KR102439500B1

KR102439500B1 - 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ny-psh 124-1 균주 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산방법

Info

Publication number: KR102439500B1
Application number: KR1020200129625A
Authority: KR
Inventors: 남승희; 양광열; 정하나; 전세현
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2020-10-07
Publication date: 2022-09-02
Also published as: KR20220046329A

Abstract

본 발명은 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생성능이 뛰어난 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주에 관한 것으로서, 갈색거저리, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 또는 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)을 기질로 이용하는 경우 상기 균주의 분지쇄 아미노산의 생성능이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 분지쇄 아미노산이 강화된 고급 단백질원으로서 노령인구 또는 유아를 대상으로 한 필수적인 단백질 보충원 또는 건강기능식품의 생산에 이용할 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산방법{Bacillus amyloliquefaciens NY-PSH 124-1 strain and method for producing branched chain amino acid using the same}

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산방법에 관한 것이다.

단백질 소재의 시장은 세계적으로 지속적인 증가 추세에 있으며 현재 약 20조 이상으로 예측되고 있다. 단백질 소재는 다양한 목적으로 식품 산업을 비롯한 산업 전반에 응용되는데, 주로 사용되는 단백질 소재는 우유(유청) 단백질, 난황 단백질, 젤라틴, 단세포 단백질, 콩 단백질, 어육 단백질, 글루텐, 기타 식물성 단백질로 구분되며 광범위한 용도로 사용되고 있다. 그 중에서도 식물성 단백질은 웰빙 바람에 힘입어 그 용도와 시장성이 커지고 있다.

특히 운동하는 사람들이 주로 즐겨 먹는 단백 보충 제품의 경우 웰빙 추세와 몸짱 열풍에 힘입어 시장이 크게 형성되고 있다. 미국의 경우 스포츠 영양식품의 시장은 약 20조 원으로 매년 10% 이상의 성장세를 보이고 있다. 그중 단백 보충 제품의 시장은 5조 원 규모로 크게 성장하고 있는 시장 중 하나이다.

국내 단백 보충 제품 시장은 약 200억 원 수준으로 2009년 성장률은 약 25%에 이른다. 최근에는 단백질 섭취에 대한 관심도 증가로 인해 단백 보충 제품이라는 국한된 제품 시장에서 벗어나 일반 식품에서도 단백질의 함량을 높이기 위해 다양한 단백 소재를 사용하고 있는 추세이다.

과거에는 주로 동물성 단백질 소재 위주로 많이 이용되어 왔으나, 최근 웰빙 추세에 대한 소비자의 관심도 증가와 더불어 광우병, 구제역, 조류독감 등의 동물성 단백질 소스(Source)에 대한 경계심이 증가하면서 상대적으로 보다 천연적이고 안전한 이미지가 있는 식물성 단백 소재에 대해 관심이 증대되고 있다.

이러한 관심에 대하여 주목받고 있는 소재는 대두 단백질(soy protein)이다. 현재 대두 단백 시장이 식물성 단백질 시장 중에서 가장 큰 시장을 형성하고 있다. 하지만, 대두의 원료적 특성상 알레르기에 관련한 우려와 더불어 끊임없이 발생하는 유전자변형 농산물(Genetically Modified Organism; GMO) 이슈로 인해 이러한 우려를 불식시킬 수 있는 새로운 식물성 단백 소재에 대한 많은 소비자의 관심도가 증가하고 있는 실정이다.

분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid: BCAA), 즉 발린, 이소루신 및 루신은 크게 3가지 특성이 있다. 첫째, 직접적인 에너지를 공급한다(J. Nutr. 136: 269S-273S, 2006). 대부분의 아미노산은 간으로 운반이 되어서 대사되는 경로를 거치나 분지쇄 아미노산은 간을 지나쳐 곧 바로 말초조직에서 취해지는 특성이 있다. BCAA는 말초조직에서 산화되어 CO₂와 에너지를 만들어낸다.

둘째, 당신생 반응에 기질을 공급한다(J. Nutr. 136: 269S-273S, 2006). 당신생 반응은 체내에서 직접 포도당을 합성하는 반응으로, 이 반응은 간에서 수행되는 것으로 생성된 포도당은 혈중으로 나가 여러 곳에 이용된다. 이 때 간에서 포도당을 합성할 수 있도록 그 자원 즉 포도당 합성의 전구 물질인 알라닌(alanine)과 피루베이트(pyruvate)를 공급해 주는 것이 근육에서 분해된 분지쇄 아미노산이다.

셋째, 근육에서 단백 분해 억제 및 합성을 촉진한다. 패혈증 등의 경우에 있어서 순환 혈류 중의 아미노산 농도가 대단히 높은 것을 확인할 수 있는데, 그 이유는 세포 내에서의 포도당 이용이 비정상적인 까닭으로 신체가 에너지 공급을 위해 신체 단백의 주 저장체인 근육을 이화 대사시켜 직접 분지쇄 아미노산으로부터 에너지를 얻는 과정에서, 기타의 아미노산도 같이 근육으로부터 혈액으로 방출되기 때문이다. 이 경우 수액 주사 시 근육 단백 분해가 억제되고 오히려 단백 합성이 촉진된다.

식물성 단백질로부터 분지쇄 아미노산의 함량을 다량 포함한 가수분해물 제조에 대하여 출원된 내용으로, “옥수수 글루텐 가수분해물의 제조방법 및 이로부터 제조된 옥수수 글루텐 가수분해물”(출원번호: 10-2009-0044178)이 출원되어 있다. 옥수수의 경우 작물로써 소비가 많이 이루어지고 있으나, 대표적인 GMO 작물 중 하나이기 때문에 소비자의 입장에서는 우려와 경계심이 있다.

이외에 L-발린 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법(출원번호: 10-2007-0005268), 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 변이시킨 미생물을 이용하여 분지쇄 아미노산을 생산하는 방법을 개시한 “아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 L-분지쇄 아미노산 생산 방법”(출원번호: 10-2019-0037330), 분쇄와 효소 분해 방법을 사용하여 쌀 단백질을 가수분해하는 공정을 개시한 “분지쇄 아미노산 고함유 쌀 단백질 가수분해물의 제조방법”(출원번호: 10-2010-0137485)이 출원되어 있다.

천연 식물성 단백질인 쌀 단백질을 원료로 한 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acids) 고함유 쌀 단백질 가수 분해물의 제조방법에 관한 연구도 수행되었으나, 대부분 상업용 균주를 이용하였다는 한계점이 있고, 유산균을 이용한 분지쇄 아미노산 강화 고품질 단백질 보조제와 관련해서는 연구가 미흡하다.

이에 본 발명자들은 분지쇄아미노산 생성능이 뛰어난 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주를 동정하고, 유청단백질 또는 콩단백질을 기질로 이용하는 경우 상기 균주의 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA)의 생성능이 월등히 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 아미노산 분해능이 우수한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 배양액을 기질 존재하에서 반응시키는 반응 단계를 포함하는 분지쇄 아미노산 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주의 분지쇄 아미노산 생산 용도에 관한 것이다.

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 분지쇄 아미노산이 강화된 고급단백질원의 생산에 활용할 수 있다.

본 발명자들은 발효식품으로부터 유용균주를 분리하고 이들 중 단백질 분해능이 뛰어난 균주를 선별하여 최종적으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주를 동정하였고, 이를 이용하여 분지쇄 아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 아미노산 분해능이 우수한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주이다.

상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주는 수탁번호 KCTC 14294BP로 기탁된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산용 조성물이다.

본 발명에 있어서 분지쇄 아미노산은 발린, 이소루신 및 루신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

상기 조성물은 갈색거저리, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 및 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY-PSH 124-1 균주 배양액 또는 균주를 기질 존재하에서 직접 반응시키는 반응 단계를 포함하는 분지쇄 아미노산 생산방법이다.

상기 기질은 갈색거저리, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 및 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 반응 단계는 균주 배양액 및 기질을 1.0:0.5 내지 1.0:2.0, 1.0:0.5 내지 1.0:1.8, 1.0:0.5 내지 1.0:1.5, 1.0:0.8 내지 1.0:2.0, 1.0:0.8 내지 1.0:1.8 또는 1.0:0.8 내지 1.0:1.5, 예를 들어, 1.0:0.8 내지 1.0:1.2의 부피비로 혼합하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 균주 배양액은 균주 배양액의 상등액인 것일 수 있다.

상기 반응 단계는 25℃ 내지 40℃, 28℃ 내지 40℃, 30℃ 내지 40℃ 또는 35℃ 내지 40℃, 예를 들어, 35℃ 내지 38℃ 조건에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 반응 단계는 pH 6.5 내지 8.0, pH 6.5 내지 7.5, pH 6.5 내지 7.0 또는 pH 7.0 내지 8.0, 예를 들어, pH 7.0 내지 7.5 조건에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생성능이 뛰어난 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주에 관한 것으로서, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 또는 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)을 기질로 이용하는 경우 상기 균주의 분지쇄 아미노산의 생성능이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 분지쇄 아미노산이 강화된 고급 단백질원으로서 노령인구 또는 유아를 대상으로 한 필수적인 단백질 보충원 또는 건강기능식품의 생산에 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 청국장, 된장, 간장, 배추물김치에서 TSA 배지로 1차 선발된 192종 중에서 단백질 분해능으로 재선발된 균주 57종을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 1차 선발에서 단백질 및 아미노산 분해능, 및 균주의 형태로 재선발된 균주 8종을 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 YM 배지로 2차 선발된 206종의 균주 중 단백질 분해능으로 재선발된 균주 72종으로부터, 다시 아미노산 분해능으로 재선발된 균주 42종을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 2차 선발에서 단백질 및 아미노산 분해능, 및 균주의 형태로 재선발된 균주 16종을 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예를 수행함에 있어 최적의 단백질원을 선발하기 위한 기질별 수용성 단백질 함량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 및 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)을 단백질원으로 하여 생산된 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid: BCAA)의 함량을 박층크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography; TLC) 분석한 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 WPI 및 ISP를 단백질원으로 하여 생산된 BCAA 생성능을 비교한 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 실시예에 따라 ISP를 단백질원으로 하여 SH64, SS19, SS18-1, SH124 및 SH130 균주로부터 생산된 BCAA의 함량을 LC-MS/MS 분석한 결과이다.
도 8b는 본 발명의 실시예에 따라 WPI를 단백질원으로 하여 SH64, SS19, SS18-1, SH124 및 SH130 균주로부터 생산된 BCAA의 함량을 LC-MS/MS 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 1, 2차 선발된 총 24종 균주 중 단백질 생성능이 우수한 균주 9종의 BCAA 생성능을 확인한 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 최종 선발된 균주 NY-PSH 124-1의 계통도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

분석에 사용한 시약은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1: 균주 배양 및 선발

균주를 분리하기 위해서 전남 각지에서 발효식품인 된장, 간장, 청국장 및 배추물김치를 생리식염수에 10^-1 내지 10^-6까지 현탁, 희석시키고 그 상층액을 시료로 사용하였다.

1-1. 1차 선발: 원액 유래 균주

1차 선발균은 수집한 시료 1 ml를 2% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 TSA(typticase soy agar, Difco.) 배지에 100 μL씩 도말하여 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 이후 단백질이 분해되어 나타난 투명환(clear zone)의 크기를 조사하여 투명환의 크기가 큰 균주 중 생육이 양호하고 콜로니(colony)의 모양이 상이한 균주 192종을 선별하였다.

선택된 콜로니 192개를 동일한 배지에 순수 분리하여 3대 계대 배양한 후 단일 콜로니를 취하고, 단백질 분해능 확인을 위한 투명환의 크기는 0.1 mm 이하: (+), 0.1-0.2 mm: (++), 0.2-0.3 mm: (+++), >0.3 mm 이상: (++++)으로 구분해 단백질 분해능이 뛰어난(0.1 mm 이상) 균주 57종을 도 1과 같이 선별하였다.

단백질 분해능 외에도 균주 57종의 아미노산 분해능을 조사하였다. 상기 선별된 균주 배지에 배양된 시료의 5배수 Tris 완충용액(pH 7)을 첨가하고 4℃에서 한시간 동안 정치하였다. 4000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 0.2 uM 필터(filter) 여과하여, 이를 정리한 표 1에 근거하여 1분 당 1 ug/mL의 L-tyrosine 생성능을 보유하는 효소의 양을 확인하였다.

57개 균주의 아미노산 분해능 조사

	균주번호	L-tyrosine (ug/ml)		균주번호	L-tyrosine (ug/ml)
간장	SS2	26.77	된장	SP6	18.81
	SS3	26.58		SP18	17.05
	SS4	18.06		SP19	19.45
	SS5	27.14		SP26	16.03
	SS7	28.06		SP29	31.31
	SS8	17.14		SP33	21.68
	SS10	25.10		SP35	17.97
	SS11	18.16		SP37	16.68
	SS13	29.08		SP41	25.01
	SS14	6.77		SP42	31.01
	SS15	18.16		SP45	23.44
	SS17	23.34		SP53	13.81
	SS18-1	33.97		SP54	1.58
	SS18-2	31.81	청국장	CH2	19.92
	SS19	34.88		CH3	7.51
	SS26	26.12		CH6	5.94
	SS27	15.10		CH8	6.95
	SS29	22.32		CH15	8.16
	SS31	30.01		CH24	2.97
	SS34	5.75		CH31	5.10
	SS35	22.23		CH34	6.03
	SS40	13.16		CH39	5.01
	SS42	21.77		CH41	8.71
	SST2	24.36		CH50	7.79
	SST3-1	26.12		CH54	5.10
	SST3-2	32.26		CH55	1.31
	SST6	14.08	배추김치 (물김치)	CH43	7.51
	SST7	20.94		TB85	17.32
	SST8	31.81		TB92	10.47
	-	-		TB93	20.19

최종적으로 단백질 분해능, 아미노산 생성능과 균주의 형태학적(morphology) 차별성을 고려하여 도 2와 같이 1차 균주에서 8종의 균주를 선택하였다.

1-2. 2차 선발: 원액 배양물 유래 균주

2차 선발균은 시료 1 ml를 멸균 생리식염수에 10^-1 내지 10^-6까지 현탁한 후, 효모 선발을 위한 LB, YM 및 MRS 배지 유산균용 MRS에서 일반균인 LB(Luria Bertani) 평판배지에 100 μL씩 도말하여 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 이후 단백질이 분해되어 나타난 투명환의 크기를 조사하여 투명환의 크기가 큰 균주 중 생육이 양호하고 콜로니의 모양이 상이한 균주 206종을 선별하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 단백질 분해능이 뛰어난 균주 72종을 선별하였으며, 아미노산 분해능이 뛰어난 균주 42종을 표 2 및 도 3과 같이 선별하였다.

아미노산 분해능이 높은 42개 균주의 선발

	균주번호	L-tyrosine (ug/ml)		균주번호	L-tyrosine (ug/ml)
LB	SH1	13.53	YM	SH38	0.90
	SH22	1.92		SH42-1	28.13
	SH78	9.39		SH42-2	30.86
	SH82	15.02		SH51	29.51
	SH92	40.89		SH52	3.07
	SH104	13.07		SH64	32.38
	SH112	10.20		SH75	0.77
	SH123	30.31		SH76	5.02
	SH124	26.75		SH83	30.54
	SH128	30.08		SH95	38.01
	SH129	17.09		SH115	4.68
	SH130	34.91		SH116	5.94
	SH139	18.59		SH117	0.54
	SH159	6.86		SH132	36.17
	SH161	0.77	MRS	SH99	15.83
	SH173	7.78		SH119	5.02
	SH174	13.30		SH122	5.14
	SH175	37.32		SH137	33.30
	SH176	8.24		SH151	2.84
	SH196	11.46		SH169	5.48
	-	-		SH170	6.52
	-	-		SH171	1.00
	-	-		SH181	5.25

최종적으로 단백질 분해능, 아미노산 생성능과 균주의 형태학적(morohology) 차별성을 고려하여 도 4와 같이 2차 선발 균주에서 16종의 균주를 선택하였다.

실시예 2: BCAA 생성을 위한 최적 단백질원 선발

분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생성 최적 단백질 선발을 위해 8종의 단백질원인 유청단백질(whey protein isolate; WPI), 콩단백질(Isolate soy protein; ISP), CSP(Crude soy protein), 스킴 밀크, 카제인나트륨, 유장분말, 피쉬콜라겐, 곤충(갈색거저리) 분말을 사용한 경우의 총아미노산과 BCAA 함량을 조사하였다.

구체적으로, 상기 단백질 시료들을 10%(w/v)의 농도가 되도록, 2 g에 20 mL 증류수에 85℃, 30 min 동안 녹인 후 2M NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정 후 뉴트랄레이즈(Neutralase) pH 7.0 55℃ 3h (실활 90℃, 30 min), 플라보자임(Flavozyme) pH 7.0 50℃ 3h (실활 90℃, 30 min) 조건으로 처리하였다.

효소처리된 시료를 원심분리 후 상등액을 100배 희석해서 수용성 단백질(BCA, Bio-Rad), 총아미노산함량, BCAA(Branched Chain Amino Acid) 함량을 측정하였는데, 수용성 단백질의 함량은 BSA(Bovine serum albumin)을 기준으로 하여 정량하였다.

수용성 단백질 함량 조사 결과

	CSP	WPI	갈색거저리	피쉬콜라겐	ISP	카제인나트륨	유장분말	Skim milk
BSA (mg/g)	2.53+ 0.12	3.81+ 0.24	5.37+ 0.02	1.53+ 0.01	3.90+ 0.05	1.29+ 0.03	1.36+ 0.03	0.89+ 0.07

표 3 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 단백질원으로 갈색거저리, WPI 및 ISP가 가장 수용성 단백질이 높으므로 이를 선택하였다.

이에 단백질원으로 WPI, ISP, CSP, 스킴 밀크, 카제인나트륨, 유장분말, 피쉬콜라겐, 갈색거저리 분말의 농도가 10%(w/v)가 되도록 각각의 단백질원 10 g을 100 mL 증류수에 용해 후 85℃, 30 min 처리하고 2M NaOH 이용 pH 7.0으로 조정하였다.

각 균주 배양액의 상등액 200 uL과 기질 200 uL를 동량 혼합후 37℃, 오버나이트(overnight) 반응시켜서 아미노산 생성을 유도하였으며, 효소활성은 90℃, 30 min에서 실활하고 반응액은 원심분리 후 상등액을 취해 증류수로 10배 희석해 총아미노산, BCAA 함량 및 이에 대한 LC/MS 및 박층크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography; TLC) 분석 결과를 조사하여 표 4 및 5에 나타내었다.

단백질원별 효소 처리 후 총아미노산 함량과 BCAA 함량

	총아미노산 (mg/gDW)	BCAA (mg/gDW)	BCAA (%)
스킴 밀크	236.61+1.66	69.26+3.91	29.27
카제인나트륨	662.80+2.36	120.13+3.14	18.12
WPI	555.75+0.42	169.89+1.64	30.57
유장분말	70.33+1.25	20.81+0.82	29.58
ISP	520.34+0.72	103.30+4.21	19.85
CSP	482.98+0.24	86.78+7.54	17.97
피쉬콜라겐	609.15+0.24	53.83+0.44	8.84
갈색거저리	336.90+0.24	81.36+1.46	24.15

표 4에서 확인할 수 있듯이, WPI와 ISP의 총아미노산은 55.5 또는 52.0%, 이 중 BCAA는 16.9%, 10.3%로 단백질원 중 가장 높았으며 각 아미노산 내 차지하는 비율은 30.6%, 19.9%로 나타났다.

각 균주별 유리아미노산 함량 및 BCAA함량 LC/MS 분석 결과

기질 종류	WPI (10%)					ISP(10%)
균주	SH64	SS19	SS18-1	SH130	SH124	SH64	SS19	SS18-1	SH130	SH124
Lys	345.9	269.5	328.5	393.4	402.6	320.3	294.7	321.3	385.8	385.8
Cys	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
Gly	4.0	4.3	4.9	5.9	5.9	10.1	7.1	10.0	12.7	12.7
Ser	3.0	1.3	4.1	6.1	6.9	9.0	2.3	7.6	11.2	11.2
His	55.3	26.9	56.4	48.6	52.6	43.5	41.5	43.7	45.8	45.8
Arg	124.7	287.8	87.0	207.2	218.4	121.3	35.9	101.4	199.4	199.4
Asp	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
Ala	15.9	11.0	14.5	19.3	21.2	30.9	27.2	30.8	36.5	36.5
Thr	26.8	13.5	25.0	29.0	31.0	23.1	12.5	23.2	29.3	29.3
Glu	10.1	2.9	12.3	13.0	13.3	21.3	14.1	23.4	24.8	24.8
Pro	16.6	52.6	13.4	16.4	17.8	41.6	12.4	61.4	56.6	56.6
Met	240.0	112.1	224.3	256.7	278.2	146.4	95.1	150.3	174.3	174.3
Val	599.1	343.4	555.4	586.5	642.5	522.6	339.7	543.6	606.0	606.0
Ile	381.7	250.0	372.3	432.6	462.1	504.1	280.8	528.0	600.9	600.9
Leu	972.2	622.7	938.7	1,055.8	1,133.2	1,093.3	720.8	1,137.8	1,247.1	1,247.1
Tyr	169.8	106.0	150.7	196.7	150.4	292.2	147.0	201.4	369.9	369.9
Phe	422.6	312.0	396.1	432.7	456.6	660.5	424.4	655.4	746.6	746.6
Trp	170.9	116.6	156.9	191.6	202.7	169.8	127.7	165.7	187.6	187.6
Total (mg/m)	3.56	2.53	3.34	3.89	4.10	4.01	2.58	4.00	4.73	4.73
BCAA (mg/m)	1.95	1.22	1.87	2.07	2.24	2.12	1.34	2.21	2.45	2.45

표 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 단백질 함량 결과와 유사하게, SH124의 경우에 WPI와 ISP가 총아미노산과 이에 함유된 BCAA(루신, 이소루신, 발린)을 가장 높게 함유하는 것을 확인하였다.

실시예 3: BCAA 생성을 위한 최적 균주의 선발

균주 라인이 다수인 경우를 포함하여 단백질 분해능이 높은 24종 균주와 공시균주 5종을 이용해 ISP(대두단백질) 와 WPI(유청단백질) 기질로 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여 BCAA 생성능을 비교하였다.

1, 2차에 걸쳐 선발, 사용된 최종 균주는 24종으로 아래와 같다: SST3-2, SST8, SS18-1, SS18-2, SS19, SS31, SP29, SP42, SH64, SH75, SH117-1(SH117), SH122, SH116, SH169, SH51, SH42-2, SH161-1(SH161), SH130-1(SH130), SH124-1(SH124), SH78-1(SH78), SH137, SH175, SH95, SH123.

단백질 분해능 비교 대상인 공시균주 5종은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis;　KACC 19683), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens; KCTC 3002), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides;　KACC 12313), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis; KCTC 13241), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum; KCTC 13093)을 사용하였다.

BCAA 생성능을 비교한 도 7에 근거하여, WPI와 ISP 모두에서 총아미노산과 BCAA 생성능이 높은 균주 9종(SS18-1, SS18-2, SS19, SP29, SP42, SH64, SH130-1, SH124-1, SH78-1)을 선발하였다.

이어서 상기 선발된 균주 9종에 대하여 공시균주 중 KCTC 3002 및 KACC 19683 대비 단백질 분해능, 총아미노산과 BCAA 생성능을 비교하였다.

유청단백질(WPI)와 콩단백질(ISP) 이용 9종과 공시균주 2종의 BCAA 생성능

균주	유청단백질(WPI)		콩단백질(ISP)
균주	총아미노산 (mg/g DW)	BCAA (mg/g DW)	총아미노산 (mg/g DW)	BCAA (mg/g DW)
3002 Bacillus amyloliquefaciens	162.26+1.00	35.74+0.20	147.82+1.21	31.55+0.32
19183 Bacillus　 velezensis	154.79+1.18	32.21+1.30	143.89+1.45	41.55+0.12
SS18-1	181.41+2.64	47.06+1.20	195.63+2.00	40.25+0.32
SS18-2	162.04+1.07	39.8+1.10	129.17+1.20	37.86+0.50
SS19	189.87+1.92	40.54+1.10	148.87+1.20	40.99+0.32
SP29	167.57+1.06	34.97+0.10	173.27+1.08	37.60+0.22
SP42	167.30+1.96	43.72+1.20	160.38+1.20	45.08+0.54
SH64	187.22+2.16	45.29+0.20	208.52+1.08	44.92+0.60
SH130-1	203.82+1.16	43.62+1.01	172.11+2.22	48.20+0.60
SH124-1	171.72 + 1.11	38.30 + 2.10	225.56 + 2.01	47.42 + 0.40
SH78-1	177.59+1.96	26.97+0.50	183.51+2.00	47.19+0.20

표 6, 도 8a, 8b 및 9에서 확인할 수 있듯이, 이 중에서도 전체 공시균주와 비교해 단백질 분해능, 총아미노산, BCAA 생성능이 월등히 높은 균주는 SH124-1로 확인되었다.

실시예 4: BCAA 고효율 생성 균주의 동정

실시예 3에서 선발된 균주의 동정 결과, 유전자 서열 및 계통수를 확인하였다. 다중서열 정렬은 Clustal X를 사용하여 수행하였다. 5' 및 3' 말단에서의 갭은 추가 분석을 통해 다시 편집하였다. 특히 특성이 뚜렷한 균주 SH124-1(NY-PSH 124-1)의 계통발생수는 모든 분석을 위한 MEGA 2.1.0 팩키지를 이용한 네이버-조이닝 방법(neighbor-joining method)에 따라 제작하였다.

균주 NY-PSH 124-1의 동정을 위한 PCR 및 시퀀싱을 위한 프라이머

서열번호	명칭	서열 (5’-3’)
1	Sequencing용 785 F primer	GGA TTA GAT ACC CTG GTA
2	Sequencing용 907 R primer	CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT
3	PCR용 27 F primer	AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG
4	PCR용 1492 R primer	TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T

균주 NY-PSH 124-1의 16S rRNA 유전자 서열

서열번호	명칭	서열 (5’-3’)
5	NY-PSH 124-1 16S rRNA	GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGTTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTA

표 8 및 도 10에서 확인할 수 있듯이, 16S 리보솜 RNA 시퀀싱(sequencing) 분석 및 NCBI의 gene bank 정보와 유사도 비교를 통한 동정 결과, NY-PSH 124-1 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 규명되었다. 상기 균주의 동정 결과를 이용하여 식약처 허용정보를 확인하였다.

NY-PSH 124-1의 동정 결과 및 식약처 허용정보

설명	Accession #	Pct (%)	식약처
Bacillus amyloliquefaciens DSM7 complete genome	FN597644.1	99	허용
Bacillus siamensis strain KCTC 13613 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	KY643639.1	99
Bacillus subtilis strain NCIB 3610 chromosome, complete genome	CP020102.1	99
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168, partial genome	CP019663.1	99
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 genome	CP019662.1	99
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168, complete genome	CP010052.1	99
Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGW, complete genome	CP003329.1	99
Bacillus velezensis strain NRRL B-41580 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	KY694464.1	99
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 complete genome	AL009126.3	99
Bacillus vallismortis strain DSM 11031 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	NR_024696.1	99

따라서 전체 공시균주와 비교하여 단백질 생성능, 총아미노산, BCAA 생성능이 월등히 높은 균주 NY-PSH 124-1를 이용하면, 콩단백질이나 유청단백질을 이용해 분지쇄 아미노산이 강화된 고급단백질원을 개발하여 노령인구나 유아에게 필수적인 단백질 보충원 및 건강보조식품으로 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

한국생명공학연구원

KCTC14294BP

20200903

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacillus amyloliquefaciens NY-PSH 124-1 strain and method for producing branched chain amino acid using the same <130> PN200265 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 785 F primer <400> 1 ggattagata ccctggta 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 907 R primer <400> 2 ccgtcaattc mtttragttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27 F primer <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492 R primer <400> 4 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 5 <211> 1486 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> NY-PSH 124-1 <400> 5 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc 60 ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 120 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatgttt gtttgaaccg catggttcag 180 acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 420 ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc 480 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 600 cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 660 aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 720 ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag 840 tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca 900 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg 1020 gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg 1140 tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta 1260 agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1320 ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta 1440 ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgta 1486

Claims

분지쇄 아미노산 생성능이 우수한 수탁번호 KCTC 14294BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주.
삭제
수탁번호 KCTC 14294BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주의 배양액 및 유청단백질(whey protein isolate; WPI), 콩단백질(Isolate soy protein; ISP), CSP(Crude soy protein), 스킴 밀크, 카제인나트륨, 유장분말, 피쉬콜라겐, 및 갈색거저리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기질을 포함하는 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생산용 조성물.
삭제
제3항에 있어서, 상기 분지쇄 아미노산은 발린, 이소루신 및 루신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 기질은 갈색거저리, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 및 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
수탁번호 KCTC 14294BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY-PSH 124-1 균주 배양액을 유청단백질(whey protein isolate; WPI), 콩단백질(Isolate soy protein; ISP), CSP(Crude soy protein), 스킴 밀크, 카제인나트륨, 유장분말, 피쉬콜라겐, 및 갈색거저리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기질 존재하에서 반응시키는 반응 단계를 포함하는 분지쇄 아미노산(Branched chain amino acid; BCAA) 생산방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 기질은 갈색거저리, 유청단백질(whey protein isolate; WPI) 및 콩단백질(Isolate soy protein; ISP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 분지쇄 아미노산은 발린, 이소루신 및 루신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 방법.