KR101194118B1

KR101194118B1 - 셀레늄이 농축된 바이오매스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 프로바이오틱 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR101194118B1
Application number: KR1020067027696A
Authority: KR
Inventors: 빈센지나 안드레오니; 알베르토 베네데티; 엔리카 캔지; 살바토레 씨아펠라노; 미첼라 푸마갈리
Original assignee: 바이오맨 에스.알.엘.
Priority date: 2004-06-03
Filing date: 2005-05-24
Publication date: 2012-10-24
Also published as: EP1602716A1; JP2008501329A; EP1602716B1; JP4842259B2; US20070258964A1; KR20070038985A; CA2569508A1; DE602004015948D1; US7666638B2; ES2312948T3; CA2569508C; WO2005118776A1; ATE405634T1

Abstract

본 발명은 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 페린토셴시스(Lactobacillus ferintoshensis), 락토바실러스 부크네리/파라부크네리(Lactobacillus buchneri/parabuchneri) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 생(生) 미생물을 함유하는 셀레늄이 농축된 바이오매스, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 식품 제조물, 건강기능식품 및 식품보충제에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 매우 많은 양의 셀레늄을 농축할 수 있고, 이에 따라 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 유용한 락토바실러스의 새로운 균주에 관한 것이다.

Description

셀레늄이 농축된 바이오매스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 프로바이오틱 및 건강기능식품 {SELENIUM-ENRICHED BIOMASS, METHOD FOR PREPARING THEREOF AND PROBIOTIC AND NUTRACEUTICAL PRODUCTS INCLUDING SAID BIOMASS}

본 발명은 셀레늄이 농축된 바이오매스, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 프로바이오틱(probiotic) 제품 및 건강기능식품(nutraceutical product)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 신규한 미생물 균주에 관한 것이다.

셀레늄은 동물 및 인간 둘 모두의 생존에 필수적인 원소인데, 이는 글루타티온 퍼옥시다아제 및 5'-요오도티로신 데이오디나아제(deiodinase) 타입 Ⅰ과 같은 중요한 효소 복합물 내에 주로 셀레노시스테인으로 포함되기 때문이다. 글루타티온 퍼옥시다아제는 과산화수소의 감소를 촉매하여 세포 변성 및 히드록실 라디칼의 형성을 방지하고, 5'-요오도티로신 데이오디아나아제 타입 Ⅰ은 티록신을 갑성선 호르몬의 물질대사에 필수적인 활성 호르몬인 트리요오도티로닌으로 전환시킨다.

인간의 중증 상태의 셀레늄 결핍이 암, 심혈관 질병, 고혈압, 뇌졸중, 및 신장 및 간 질환의 위험 증가와 관련되는 것이 관찰되고 있다. 그러나, 이러한 결핍 질환은 셀레늄이 농축된 식이 또는, 예를들어 식품보충제에 의해 무기 또는 유기 형태의 셀레늄을 투여시킴으로써 치료될 수 있다. 셀레늄 투여는 또한 세포 변성 및 자유 라디칼 형성의 과정을 중화시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

인체에 의한 셀레네이트 및 셀레나이트의 활용은 셀레나이드의 형성을 수반하는 환원적 과정을 통해 발생하고, 상기 셀레나이드는 이후에 비통상적(non-conventional) 아미노산, 특히 Se-메티오닌 및 Se-시스테인으로 통합된다.

다수의 미생물(세균, 효모 및 진균)은 셀레나이트의 존재하에서 성장할 수 있고, 셀레나이트를 셀레늄 원소로 환원시킬 수 있거나, 셀레나이드를 단백질 중의 셀레늄 아미노산으로 통합시킬 수 있다.

셀레늄을 함유하는 생체분자를 합성하는 능력이 락토바실러스 속의 몇몇 락트산 세균에서 기술되어 있다(Calomme et al. J. Appl. Microbiol., 1995; Andreoni et al. Ann. Microbiol., 2000; 50, 77-88).

따라서, 락토바실러스 균주가 현재 프로바이오틱 목적을 위해 사용되고, 유기 형태의 셀레늄을 농축시키는 이러한 미생물의 능력은 이들을 보충제로도 사용가능하게 한다. 브이. 안드레오니 등의 문헌 [V. Andreoni et al., Ann. Microbiol, 2000; 50, 77-88]에는 셀레늄을 축적하는 다양한 기원의 몇몇 락토바실러스의 능력이 기술되어 있다.

이제, 본 발명자들은 놀랍게도 인간 배설물 샘플에서 분리한 락토바실러스 부크네리/파라부크네리(Lactobacillus buchneri/parabuchneri), 락토바실러스 페린토셴시스(Lactobacillus ferintoshensis) 및 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 종에 속하는 미생물이 문헌[Calomme et al. J. Appl. Microbiol., 1995; Andreoni et al. Ann. Microbiol. Enzimol., 2000]에 보고된 균주보다 평균 10 배 이상의 양으로 셀레늄을 축적할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이들 락토바실러스 종은 셀레늄이 농축된 바이오매스의 제조에 특히 적합하고, 특히 프로바이오틱 및/또는 건강기능식품 작용제로서 상기 바이오매스를 사용할 목적에 적합하다.

따라서, 본 발명의 첫번째 목적은, (ⅰ) 셀레늄염을 포함하는 영양 배지에서 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 페린토셴시스, 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 셀레늄을 축적하는 미생물을 배양하고; (ⅱ) 배지로부터 셀레늄이 농축된 미생물을 분리시킴으로써, 셀레늄이 농축된 바이오매스를 제조하는 방법이다.

본 발명의 방법에 따라, 바이오매스는 세포내에 축적된 많은 양의 셀레늄을 함유하는 미생물을 포함하여 수득되고, 이는 하기 보고되는 연구로부터 명백하다. 더욱이, 이러한 연구는 바이오매스에 의해 축적된 셀레늄의 부분은 유기형태, 특히 Se-메티오닌 및 Se-시스테인의 형태인 것으로 입증되었는데, Se-아미노산의 형태이고 셀레노단백질에 통합된 셀레늄이 인체에 용이하게 흡수되므로, 상기 바이오매스를 프로바이오틱 작용제로 사용하려는 목적에 있어서 장점이 된다.

셀레늄이 농축된 바이오매스를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 미생물이 셀레늄염, 예를들어 셀레나이트, 바람직하게는 나트륨 셀레나이트가 보충된 락토바실러스 속의 미생물의 성장에 적합한 영양 배지에서 배양되는, 발효의 제 1단계를 계획한다. 영양 배지는 탄소의 공급원, 예를들어 글루코오스, 수크로오스 및/또는 락토오스; 질소의 공급원, 예를들어 펩톤, 카세인의 가수분해물, 고기 추출물 및/또는 효모 추출물; 무기염; 미량원소 및 비타민의 공급원, 예를들어 농축발효 옥수수침출물 등을 함유하는 액체 배지가 바람직하다.

발효는 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, 더욱 바람직하게는 32℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 액체 배지의 pH 값은 바람직하게는 2.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 7.5이다. 발효 시간은 바람직하게는 6 내지 40시간, 더욱 바람직하게는 8 내지 36시간이다. 발효는 호기성 조건, 미호기성 조건 및/또는 혐기성 조건에서 수행될 수 있다.

발효 단계 후, 바이오매스가 성장하고, 세포내에서 셀레늄이 축적되는 동안, 수득된 바이오매스가, 바람직하게는 원심분리 또는 미세여과에 의해 세포가 온전한 상태로 유지되는 방식으로 배지로부터 분리된다. 따라서, 본 발명의 방법은 생(生) 미생물을 포함하는 셀레늄이 농축된 미생물의 바이오매스를 수득하는 것을 가능케 한다.

요망되는 경우, 이후 수득된 바이오매스는 통상적인 방법에 따라 동결건조 또는 건조 작업에 적용될 수 있다.

더욱이, 본 발명자들은 인간 배설물 샘플로부터 각각 LB2 BM, LB6 BM 및 LB26 BM으로 명명된 락토바실러스 속에 속하는 3개의 신규한 미생물 균주를 분리하였고, 이들은 셀레늄, 특히 Se-메티오닌 및 Se-시스테인의 형태의 셀레늄의 높은 농축 능력을 지니므로, 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 이로운 것으로 입증되었다. 이들 균주는 락토바실러스 류테리(LB2 BM), 락토바실러스 페린토셴시스(LB6 BM) 및 락토바실러스 부크네리/파라부크네리(LB26 BM) 종에 속하는 것으로 확인되었다(실시예 11 참조). 이들 미생물 균주의 배양균은 부다페스트 조약에 의거하여 특허 절차의 목적상 미생물의 국제공인 기탁으로 특허미생물 국제 공인 기탁기관인 도이체 삼룽 퓌르 미크로오르가니스멘 및 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Germany)에 기탁되었다:

LB2 BM LB6 BM LB26 BM

수탁번호: DSM 16143 DSM 16144 DSM 16341

기탁일: 17/01/2004 17/01/2004 05/04/2004

상기 기술된 바에 따라, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 셀레늄이 농축된 바이오매스는 프로바이오틱 제제로서의 용도에 특히 적합한데, 이는 상기 바이오매스가 무기 및 유기 형태 둘 모두의 셀레늄을 높은 농도로 함유하기 때문이다.

상기 목적상, 바이오매스는 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를들어, 바이오매스는 프로바이오틱 활성을 지니는 식품 제조물을 수득하기 위해 식품, 바람직하게는 밀크 또는 식이성 제품, 예를들어 요구르트에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이는 프로바이오틱 활성을 지니는 조성물, 예를들어 적절한 비히클 및/또는 부형제와 조합된 경구 투여용의 식품보충제 또는 비-식품 제조물, 예를들어 건강기능식품 제조물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 바이오매스는 동결건조되거나 건조된 조성물의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

프로바이오틱 또는 건강기능식품 조성물에 사용되는 동결건조되거나 건조된 제품의 세균 로드(load)는 바람직하게는 10¹⁰ CFU/g 이상 내지 10¹¹ CFU/g이다.

동결건조되거나 건조된 조성물을 제조하기 위해, 젖은 바이오매스가 액체 배지, 예를들어 보호제, 예를들어 스킴 밀크(skimmed milk), 락토오스, 글루코오스, 효모 추출물, 감자 전분, 나트륨 글루타메이트, 이노시톨, 나트륨 시트레이트, 젤라틴, 말토덱스트린, 마그네슘 스테아레이트, 아스코르브산, 스테아르산 및 이들의 조합물이 첨가된 물 또는 멸균 생리용액에 현탁된다.

이후, 동결건조되고/되거나 건조된 조성물은 동결건조를 위해 상기 언급된 물질 중에서 비활성 물질과 함께 프로바이오틱 제조물에 대해 희석되어, 바람직하게는 10⁹ CFU/g 이상의 세균 로드가 수득된다.

하기 제공되는 실시예는 단지 예시를 위한 것으로, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

8 ㎎/ℓ의 Na-셀레나이트(Na₂SeO ₃ )가 첨가된 200㎖의 MRS 배지를 500 ㎖ 플라스크에서 멸균시켰다. 교반 없이 37℃에서 18시간 동안 미리 성장시킨 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 Lb26 BM - DSM 16341의 시드 배양액을 5%의 양으로 플라스크에 접종시켰다. 이후, 배양물을 80 rpm으로 진탕하면서 24시간 동안 성장되도록 두었다. 성장 완료후, 바이오매스를 원심분리로 수거하였다. 바이오매스를 실시예 9에 기술된 방법에 의해 처리하고 분석하였다. 세포에 의해 축적된 전체 셀레늄은 1.87 ㎎/g_d.w.이었고, Se-메티오닌의 양은 36.57 ng/mg_d.w.이었고, Se-시스테인의 양은 135.70 ng/mg_d.w.이었다.

실시예 2

락토바실러스 페린토셴시스 Lb6 BM - DSM 16144를 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하였다. 배양 24시간 후, 축적된 전체 셀레늄은 1.1 ㎎/g_d.w.이었고, Se-메티오닌의 양은 12.63 ng/mg_d.w.이었고, Se-시스테인의 양은 6.60 ng/mg_d.w.이었다.

실시예 3

락토바실러스 류테리 Lb2 BM - DSM 16143을 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하였다. 배양 24시간 후, 축적된 전체 셀레늄은 0.7 mg/g_d.w.이었고, Se-메티오닌의 양은 11.39 ng/mg_d.w.이었고, Se-시스테인의 양은 83.78 ng/mg_d.w.이었다.

실시예 4

락토바실러스 부크네리/파라부크네리 Lb26 BM - DSM 16341을 5%의 농축발효 옥수수침출물(15분 동안 pH 7.0 및 100℃에서 전처리됨) 및 Na-셀레나이트 8㎎/ℓ가 첨가된 15L/10L의 MRS 배지를 지닌 발효통에서 배양한 후, log6(즉, 발효 시작 6시간 후)으로부터 출발하여 매 4시간 마다 Na-셀레나이트를 5 ㎎/ℓ로 4회 첨가하였다. 발효통을 log16에서 5% 시드로 접종하고, log20까지 pH 6.6에서 유지시켰다. 0.51/l/분의 공기를 이용하여 배양물을 천천히(60 rpm) 교반하고, log25에서 완료된 것으로 간주하였다. 바이오매스를 원심분리에 의해 수거하여, 4.2 g/ℓ의 건조 중량을 수득하였다. 2.21 ㎎/g_d.w.의 전체 셀레늄 축적물을 수득하였다.

실시예 5

락토바실러스 페린토셴시스 Lb6 BM - DSM 16144를 실시예 4에 기술된 15L 발효통에서 배양하였다. 4.8 g_d.w.의 바이오매스를 수득하였다. 축적된 전체 셀레늄은 2.09 ㎎/g_d.w.이었다.

실시예 6

락토바실러스 류테리 Lb2 BM - DSM 16143을 실시예 4에 기술된 15L 발효통에서 배양하였다. 4.1 g_d.w.의 바이오매스를 수득하였다. 축적된 전체 셀레늄은 1.91 ㎎/g_d.w.이었다.

실시예 7

28.1 g_d.w.의 락토바실러스 페린토셴시스 Lb6 BM - DSM 16144와 동등한 100 g의 젖은 바이오매스를 멸균 생리용액으로 세척한 후, NaOH로 pH 6.2로 조정된 아스코르브산 3%, Na-글루타메이트 3%, 이노시톨 4%를 함유하는 520 ㎖의 용액에 재현탁시킨 후, 동결건조시켰다. 4.3*10¹¹ CFU/g의 세균 로드를 지닌 54 g의 동결건조된 조성물을 수득하였다.

실시예 8

28.1 g_d.w.의 락토바실러스 류테리 Lb2 BM - DSMZ 16143과 동등한 100 g의 젖 은 바이오매스를 실시예 7과 같이 제조하고, 아스코르브산 3%, Na-글루타메이트 3%를 함유하는 수용액중 약 40%(w/v)의 농도로 재현탁시켰다. 현탁액을 "스프레이-건조기(Spray-dryer)"로 건조시켜, 3.4*10¹⁰ CFU/g의 세균 로드를 지닌 건조된 조성물을 수득하였다.

실시예 9: 분석 방법

세포에 의해 축적된 셀레늄

실시예 1, 2 및 3으로부터 수득한 바이오매스를 원심분리에 의해 소진된 배지로부터 분리하였다. 바이오매스를 세척하고, 세척수를 소진된 배지에 첨가하였다. 이후, 0시(T₀) 및 발효 24시간 후(T₂₄)에서 배지 내의 셀레늄의 양 및 세포에 의해 축적된 셀레늄의 양을 결정하였다. 수득된 결과를 하기 표에 나타내었다.

균주	T ₀ 에서의 배지 내의 Se (㎎/L)	T ₂₄ 에서의 배지 내의 Se (㎎/L)	제거된 Se (㎎/L)	세포에 의해 축적된 유효한 Se (㎎/g _d.w. )	Se 시스테인 (ng/㎎ _d.w. )	Se 메티오닌 (ng/㎎ _d.w. )
Lb2 BM	1.93	0.44	1.49	0.7	135.7	36.57
Lb6 BM	1.93	0.44	1.49	1.1	83.78	11.39
Lb26 BM	2.34	0.37	1.97	1.87	6.6	12.63

셀레늄 함량의 결정

세포질의 가용성 분획 및 미립자 분획의 Se(Ⅳ)의 양을 정전류에서 전위차 분석에 의해 결정하였다. 이러한 분석은 트레이스 랩(Trace Lab) PSU 20을 이용하여 수행하였다. 이 기계는 ppb 미만의 수준에서도 미량 원소를 결정하고, 극도로 민감한 분석 방법을 이용한다. 3개의 표준 전극을 상기 분석을 위해 사용하였다: 유리질-탄소 전극, 백금 전극 및 칼로멜 전극.

유리질-탄소 전극: 이는 Se를 측정하는 전극이다. 이의 말단은 분석 동안에 매우 얇은 수은 필름으로 코팅된다.

백금 전극: 이는 전기분해 동안 계수기로 작용한다.

칼로멜 전극: 이는 참조 전극이고, 금속을 흡수하지 않고, 포화된 KCl을 함유한다.

금속의 특성 및 농도에 따라, 금속은 작업 중의 전극에 다양하게 침착된다. 수은 필름 상에 침착된 금속의 양은 샘플 내의 금속 이온의 농도 및 전기분해 시간에 비례한다(전극에 침착되는 금속의 양은 전기분해 시간이 증가함에 따라 증가한다).

셀레늄 함량을 결정하는데 사용되는 방법은 250 ㎕의 표준(5 ppm의 Se)의 첨가가 계획되는 SE-ADD 방법이다. 셀레늄의 판독 범위는 10 ppb 내지 100 ppb 사이어야 한다.

미가공 세포 추출물의 제조

Se-아미노산의 함량을 결정하기 위해, 우선 미가공 세포 추출물을 제조하였다. 이를 위해, 세포 펠레트를 pH 8.0, 1:5의 비(용해 용액 5 ㎖중 1 g의 펠레트)로 용해 용액(Tris HCl 50 mM - NaCl 0.3 mM)에 재현탁시켰다. 세포벽의 용해를 완료시키기 위해, 리소자임의 용액(50 ㎎/㎖)을 펠레트(g) 당 20 ㎕의 양으로 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반한 후, 8주기로 초음파 처리하였다(얼음에서 1분의 휴지기를 지니는 30초의 주기)(Bandelin HD 2070-U sonicator). 혼합물을 5℃에서 1시간 동안 15000 rpm(Beckman, JA20 rotor)에서 원심분리하여, 미립자 분획(세포막 및 세포벽)으로부터 세포질의 가용성 분획을 분리시켰다. 침전 후, 세포질 단백질에서 통합된 셀레늄 및 셀레늄 함유 아미노산의 함량을 분석하였다.

Se-아미노산 함량의 결정

Se-아미노산의 함량을 결정하기 위해, 1 ㎖의 증류수를 미리 광물화되고 동결건조된 각각의 샘플에 첨가하고, 수득된 용액을 NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조정하였다. 이후, 프로테이나아제 K의 수용액을 1 대 10의 비로 각각의 샘플에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 교반과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 트리클로로아세트산을 10%의 최종 농도로 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 현탁액을 원심분리시키고, 상층액을 수거하고, 사용할때까지 -20℃에서 보관하였다. 문헌[J. Agric. Food Chem., 2002; 50, 5722 - 5728]에 기술된 LC/MS 방법을 이용하여 전체 셀레늄 함량을 샘플의 하나의 분취량에서 결정하고, Se-메티오닌 및 Se-시스테인의 양을 또 다른 분취량에서 결정하였다.

실시예 10: 락토바실러스의 위 산도 및 담즙에 대한 내성의 결정

본 발명의 균주의 산도에 대한 내성을 90분 동안의 pH 2.00의 위액 접촉 후에 이들의 생존을 측정함으로써 시험하였다(J. App. Microb. 2001; 90, 268-278). 혐기 조건으로 MRS 배지에서 37℃에서 18시간 성장시킨 후 수거한 세포를 펩톤수에 재현탁시켰다. 이러한 세균 현탁액의 동등한 부피(0.1 ㎖)를 6 ㎖의 위액 및 6 ㎖의 "대조 튜브" 용액에 첨가하여, 약 1x10⁸ CFU/㎖의 최종 농도에 도달되게 하였다. 둘 모두의 세균 현탁액을 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 데시멀(decimal) 희석 및 MRS 아가 배지 상의 플레이팅에 의해 T₀ 및 90분 후에 샘플에서 생존하는 수를 확인하였다. 잔여 부피를 5℃에서 20분 동안 9500 rpm에서 원심분리(Beckman, JA20 rotor)하여, 담즙에 대한 내성을 결정하기 위한 담즙염(biliary salt)의 용액중에 현탁하기 위한 세포를 수득하였다. 이러한 목적을 위해, 세포를 펩톤(1 g/L) 및 담즙(3 g/L)이 보충된 6 ㎖의 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 6.5)에 재현탁시키고, 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 동시에, 대조 세포를 상기와 동일하나 담즙이 없는 6 ㎖의 완충용액에 재현탁시키고, 상기 언급한 바와 같이 인큐베이션하였다. 상기 기술된 바와 같이 세균 로드의 결정을 T₀ 및 담즙 노출 3시간 후에 수득된 샘플에서 수행하였다.

산성 환경에서 인큐베이션된 세포에 대한 밀크의 보호 효과를 담즙염 및 산도에 대한 노출에 각각 예민한 2개의 균주인 L. 류테리 Lb2 BM 및 L. 부크네리/파라부크네리 Lb26 BM에서 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 세포를 pH 2.0으로 산성화된 스킴 밀크 용액에 접종하고, 이러한 용액(90분 동안 pH 2.0) 및 담즙염 용액(180분)에 노출 후 CFU/㎖의 수를 결정하였다.

위 산도에 대한 내성

균주	CFU/㎖
균주	T ₀	90분 후
Lb2 BM	7.9x10⁷	7.7x10⁷
Lb6 BM	2.6x10⁶	2.9x10²
Lb26 BM	4.4x10⁶	1.1x10²

담즙염의 효과

균주	CFU/㎖
균주	T ₀	180분 후
Lb2 BM	4.1x10⁷	1.5x10⁴
Lb6 BM	2.5x10	0.5x10
Lb26 BM	3.0x10	2.5x10

pH 2.0의 스킴 밀크 및 담즙의 존재에 대한 균주의 반응

균주	CFU/㎖
	pH 2.0		담즙염
	T₀	90분	T₀	180분
Lb 2 BM	8.3x10⁷	4.1x10⁷	1.2x10⁷	6.8x10⁶
Lb 26 BM	1.0x10⁷	5.9x10⁶	3.9x10⁶	2.5x10⁶

실시예 11: LB2 BM, LB6 BM 및 LB26 BM 균주의 확인

본 발명의 LB2 BM, LB6 BM 및 LB26 BM 균주를 유니버셜(universal) 프라이머를 이용하여 16S rDNA 유전자를 엔코딩하는 DNA 영역을 증폭시키고, 수득된 증폭 생성물을 제한 효소로 절단하는 것을 계획하는 ARDRA 기술(증폭된 리보솜 DNA 제한 분석)을 이용하여 확인하였다. 이후, 제한 단편을 서열분석하고, 수득된 서열을 공지된 서열과 정렬시켜, 상동성%를 기초로 하여 균주를 확인하였다.

재료 및 방법

DNA의 추출

24시간 동안 37℃에서 인큐베이션된 멸균 MRS 중의 브로쓰(broth) 배양액 중의 세포로부터 DNA를 추출하였다. 약 2㎖의 브로쓰 배양액을 5분 동안 13000 rpm으로 원심분리하고, 수거된 펠레트를 1.85 ㎖의 세포 현탁액에 균질하게 재현탁시키고; 50 ㎕의 RNase 믹스를 첨가하고, 신속히 교반한 후, 100 ㎕의 세포 용해/변성 용액을 첨가하였다. 현탁액을 15분 동안 55℃에서 온도조절기에서 유지시키고, 25 ㎕의 프로테아제 믹스를 보충하고, 2시간 동안 55℃에서 유지시켰다. 500의 솔트-아웃(salt-out) 혼합물을 첨가한 후, 1.5 ㎖를 10분 동안 4℃에 유지시키고, 10분 동안 13000 rpm에서 원심분리하였다. 2 ㎖의 TE (Tris-HCl 10 mM 및 EDTA 1 mM, pH 8, 멸균) 및 8 ㎖의 100% 에탄올을 상층액에 첨가하였다. 유리 막대를 이용하여 회수된 DNA 가닥에 500 ㎕의 70% 에탄올을 보충하고, 30분 동안 11000 rpm에서 원심분리하였다. 수성상을 제거한 후, 이를 24시간 동안 37℃에서 유지시킨 후, TE (약 200 ㎕)에 재현탁시키고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. DNA의 추출을 TAE 1X 완충용액 중의 0.7% 아가로오스 젤(w/v)에서 전기영동하여 확인하였다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)

게놈의 특정 부분을 PCR 기술로 증폭시켰다. PCR 증폭 반응을 멸균 200 ㎕ 에펜도르프(Eppendorf)를 이용하여 25 ㎕의 소정의 반응 부피로 수행하였다.

반응 혼합물은 하기와 같이 구성된다:

- 중합효소 연쇄 증폭 반응이 프라이밍되는 주형인 균주의 DNA(주형 DNA), 최종 반응 부피의 1/25의 비로 사용됨;

- Taq-중합효소의 효소 활성을 안정화시키는데 필요한 Mg²⁺를 공급하는 MgCl₂ 용액 (1.75 mM);

- 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(0.2 μM), 하나는 "정방향" 반응용(f)이고, 하나는 상보적 서열 지점에서 DNA의 이전에 변성된 상보적 가닥과 페어링하는 "역방향" 반응용(r)이다. 프라이머의 3' 자유 말단은 효소 활성의 출발 지점을 제공한다. 프라이머의 서열은 증폭되는 영역에 따라 다양하고, 하기와 같이 주어진다:

- 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 혼합물 (0.2 mM)(dNTP = dAPT+dCTP+dGTP+dTTP);

- 출발 주형에서 새로운 DNA의 합성 반응을 촉매하는 열안정성 효소 Taq-중합효소(Bioline, UK); 이의 활성을 위한 최적 온도는 70℃이고; 사용되는 효소는 5 유닛/㎕의 농도로 공급된다;

- Tris-HCl (100 mM, pH 8.3) 및 KCl (500 mM)로 구성된 효소 Taq-중합효소를 위한 완충용액, 효소 반응을 위한 최적의 이온 강도 및 pH를 생성하는 기능을 하고, 최종 부피의 1/10의 비로 첨가된다;

- 멸균 증류수, 반응이 발생하고, 요망되는 부피에 도달하는 것을 가능케 하는 수단으로 제공된다.

하기의 예방책은 외부 DNA를 이용한 반응의 오염을 방지하기 위한 것이다:

- 증류(laminar flow)를 이용하여 멸균 후드 하에서 반응 혼합물을 제조함;

- 사용되는 모든 재료를 멸균함;

- 매 증폭 반응시에 주형 DNA를 제외한 모든 반응물을 함유하는 네거티브 대조군을 포함함.

주형 DNA를 제외한 적절한 양의 상기 상술된 모든 반응물을 함유하는 반응 혼합물을 1.5 ㎖ 에펜도르프에서 제조하였다. 이후, 반응 혼합물을 0.2 ㎖ 에펜도르프 분취량으로 분배하고, 여기에 주형을 첨가하였다. 샘플을 신속히 얼음에 두어 Taq-중합효소가 비특이적으로 작용하는 것을 방지하였다.

증폭 결과를 1.5% (w/v) 아가로오스 젤 상에서 전기영동하여 확인하였다. 네거티브 대조군의 전기영동 프로파일에서 밴드가 없는 경우, 반응물이 오염되지 않은 것으로 간주하였다.

하기 주어진 표는 세균 리보솜의 16S 서브유닛을 엔코딩하는 16S rDNA 유전자의 증폭을 위한 반응 혼합물에 사용된 반응물의 농도를 나타낸다.

유니버셜 프라이머는 유박테리아 27f 5'-AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG-3' (SEQ ID NO:1) 및 1495r 5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3' (SEQ ID NO:2)(Invitrogel)을 사용하였고, 이들은 각각 대장균(E. Coli)의 16S rDNA 유전자의 27번째 및 1495번째 뉴클레오티드에 위치하여, 거의 완전한 증폭을 가능케 한다.

시약	농도
완충용액	1.00 X
MgC1 ₂	1.75 mM
dNTP_s	0.2 mM
정방향 프라이머	0.2 μM
역방향 프라이머	0.2 μM
Taq-중합효소	2.0 U^*
DNA	2.0 ㎕

^* 유닛은 74℃의 온도에서 30분 동안 10 ng의 dNTP를 결합시키는 효소량으로 정의된다. 효소는 열안정적이고, 출발 주형에서 새로운 DNA의 합성 반응을 촉매한다.

제조 직후 반응물을 함유하는 시험 튜브를 PCR 진앰프(GeneAmp) PCT 시스템 2400 (Perkin Elmer)에 대한 열 사이클러에 두고, 하기 열 주기를 적용시켰다: 3분 동안 95℃에서 변성; 1분 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 2분 동안 72℃에서 35주기; 이후 15분 동안 72℃에서 최종 신장기.

증폭 결과를 TAE 1X 완충용액 중의 1.5% (w/v) 아가로오스 젤에서 전기영동하여 확인하였다. 16S rDNA의 임의의 증폭을 약 1500 뉴클레오티드의 증폭 밴드의 존재로 검출할 수 있었다. 100 bp의 배수의 길이를 지니는 DNA 단편의 혼합물인 래더 100 bp 플러스를 영동함으로써 생성된 밴드와 비교하여 젤 상에 보이는 밴드에 해당하는 DNA의 분자량을 확인하였다.

제한 효소를 이용한 분해

수득된 증폭 생성물을 제한 효소 HhaⅠ, HinfⅠ, Afa를 이용하여 분해하였다.

각각의 균주의 16S rDNA의 분해 반응을 하기 시약을 이용하여 10 ㎕의 부피에서 수행하였다:

- 증폭 밴드의 강도에 따른 다양한 양의 증폭된 DNA;

- 각각의 효소에 대한 특정 완충용액 10 x(Amersham Biosciences);

- 제한 효소(Amersham Biosciences)(10 U/㎕);

- 10 ㎕ 이하의 부피를 발생시키는 MilliQ 수.

하기 표는 16S rDNA 단편의 분해를 위한 반응 혼합물에 사용된 시약의 양을 나타낸다.

시약	양
DNA	증폭 밴드의 강도에 따라 다양함
효소(10 U/㎕)	1 ㎕
완충용액	1 ㎕
물	q.s.
최종 부피	10 ㎕

시약을 에펜도르프에 두고, 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플 을 -20℃에서 보관한 후, 샘플을 특성규명하는 밴드의 중량을 측정하기 위해 래더 50 bp를 이용하여 TAE 1X 완충용액 중의 3% (w/v) 아가로오스 젤에서 전기영동하여 분석하였다.

16S rDNA의 효소 분해는 분석되는 서열에 존재하는 효소에 의해 인지되는 부위의 기능에 따라 다양한 분자량의 다양한 밴드로부터 형성된 프로파일을 생성하였다. 전체 밴드는 증폭되는 단편의 길이(1500 bp)를 초과하지 않아야 한다.

DNA의 젤 전기영동

수행 조건은 Tris-염기 0.04 M, 빙초산 0.02 M, Na₂-EDTA 0.001 M으로 구성된 Tris-아세테이트-EDTA(TAE) 영동 완충용액(pH 8) 중의 수평 아가로오스 젤의 사용을 고려하였다. 영동을 젤의 치수의 함수에 따라 90V 내지 110V의 정전압을 유지하면서 실온에서 수행하였다. DNA 단편이 젤 길이의 약 2/3에 도달하였을때 영동을 중지시켰다.

아가로오스의 농도는 분리되는 DNA 분자의 크기에 따라 0.7% 내지 3%로 다양하였다:

- DNA의 추출을 확인하기 위한 0.7%

- 16S rDNA의 증폭을 확인하기 위한 1.5%

- 제한 효소를 이용한 DNA의 분해를 확인하기 위한 3%.

전기영동을 위한 젤을 TAE 1X 완충용액에 아가로오스를 용해시킴으로써 제조하였다. 웰에 로딩하기 전에, DNA를 1:5(v/v)의 비율로 수크로오스 40% (w/v), 브 로모페놀 블루 0.05% (w/v), EDTA 0.1 M pH 8, 및 나트륨 도데실설페이트 (SDS) 0.5% (w/v)로 구성된 젤 로딩 용액과 혼합하였다.

젤의 첫번째 및 마지막 웰에 염기쌍(bp)으로 표현되는, 샘플의 길이를 평가하기 위해 사용되는 DNA의 분리 밴드를 함유하는 공지된 분자량의 마커를 로딩하였다. 영동 종료후에, 마커는 공지된 길이의 DNA에 해당하는 분리된 밴드를 지닌 전기영동 프로파일을 나타낸다.

밴드가 젤의 약 2/3을 이동하였을 때, 젤을 15 내지 30분 동안 빛이 없는 곳에서 에티디움 브로마이드의 0.5 mM 용액(Sigma)에 침지시켰다. 이후, 젤을 약 15분 동안 증류수로 세척하고, 젤 Doc 영상 포착 시스템(Gel Doc image acquisition system, Biorad)과 연결된 UV 투과조명기의 빛에서 사진을 찍었다.

PCR 생성물의 정제

70 bp - 10 kb의 증폭 생성물의 정제를 위해 키아퀵(QIAquick) 젤 추출 키트 프로토콜을 이용하였다. 정제된 생성물(약 450 ㎕)을 사용시까지 2 ㎖의 마이크로튜브에서 -20℃에서 보관하였다.

DNA의 침전

Na 아세테이트(pH 5; 3 M)를 수득된 DNA의 1/10의 부피의 비율로 정제된 생성물에 첨가한 후, 100% 에탄올을 DNA의 2.5 부피의 비율로 첨가하였다.

상층액을 분리시키기 위해 14000 rpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 500 ㎕의 70% 에탄올을 첨가한 후, 침전물을 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 에펜도르프에 잔류하는 에탄올을 약 15분 동안 37℃에서 온도조절기에서 증발시킨 후, 후드하에서 증발시켰다. 침전물을 23 ㎕의 TE(pH 8)에 재현탁시키고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다.

DNA의 정량

증폭된 생성물을 젤 Doc 영상 포착 시스템(Biorad)을 이용하여 샘플의 형광성과 공지된 농도의 마커의 형광성을 비교함으로써 정량하였다.

1.5% 아가로오스 젤을 제조하였다. 하기로부터 각각 형성된 공지된 분자량의 마커의 두개의 혼합물을 웰에 로딩하였다:

1) 20 ㎕ 마커 로우 레인지 매스 룰러(Low Range Mass Ruler^TM) (MBI Fermentas)

2) 10 ㎕ 마커 로우 레인지 매스 룰러^TM (MBI Fermentas).

2 ㎕의 샘플 DNA를 2 ㎕의 브로모페놀 블루 및 6 ㎕의 MilliQ 수와 혼합하였다. 10 ㎕의 혼합물을 젤에 로딩하였다.

서열분석

플루오로크롬으로 라벨링된 뉴클레오티드의 혼합물을 함유하는, 200 ng의 PCR 생성물, 6 pmol의 프라이머 27f 및 1495r (Invitrogen), 4 ㎕의 완충용액 (2.5X) 및 4 ㎕의 "다이터미네이터(DyeTerminator)" 프리믹스 (Amersham Biosciences)을 이용하여 PCR 증폭시킴으로써 서열분석 반응을 수행하였다. 최종 부피는 20 ㎕이었다. 증폭 반응을 위해 바이오메트리아(Biometria)사의 열 사이클러를 사용하여, 하기 열 주기를 적용시켰다: 2분 동안 95℃에서 변성; 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 4분 동안 60℃에서 25주기; 이후 15분 동안 60℃에서 최종 신장기. 이후, 라벨링된 뉴클레오티드의 정제를 다음과 같이 수행하였다: QUICK RUN 샘플을 원심분리하고, 1.5 ㎖ 에펜도르프로 옮기고, 2 ㎕의 Na 아세테이트 및 80 ㎕의 100% 에탄올을 첨가하였다. 전체를 5분 동안 13000 rpm에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 1 ㎖의 70% 에탄올을 첨가하였다. 5분 동안 13000 rpm에서 원심분리후, 상층액을 제거하고, 혼합물을 15분 동안 후드하에 두어 잔류하는 에탄올을 증발시켰다. 잔류물을 약 13 ㎕의 메가(Mega) BAC 완충용액에 재현탁시키고, 20초 동안 볼텍스 상에서 교반하였다. QUICK RUN을 원심분리하고, 샘플을 1.5 ㎖ 에펜도르프로 옮긴 후, 어플라이드 바이오시스템 310A 서열분석기(Applied Biosystem 310A sequencer)에 로딩하고, 어플라이드 바이오시스템 모세관 전기영동을 수행하였다.

상동성 조사

수득된 서열을 Fasta3 및 GeneSteam Align 프로그램을 이용하여 GenBank 및 EMBL 데이터베이스에 존재하는 서열과 정렬시켰다. 각각의 균주에 대해 사용된 서열, 서열분석된 염기의 수, 상동성% 및 각각의 균주가 속하는 종을 하기에 나타내었다.

LB2 BM - DSM 16143

락토바실러스 류테리

서열분석된 염기수: 860

상동성%: 99.5

LB2 BM 정방향 (SEQ ID NO:3)

LB2 BM 역방향 (SEQ ID NO:4)

LB6 BM - DSM 16144

락토바실러스 페린토셴시스

서열분석된 염기수: 748

상동성%: 98.9

LB6 BM 정방향 (SEQ ID NO:5)

LB6 BM 역방향 (SEQ ID NO:6)

LB26 BM - DSM 16341

락토바실러스 부크네리/파라부크네리

서열분석된 염기수: 485

상동성%: 99.4

LB26 BM 정방향 (SEQ ID NO:7)

LB26 BM 역방향 (SEQ ID NO:8)

SEQUENCE LISTING <110> BioMan S.r.l. <120> Selenium-enriched biomass, method for preparing thereof and probiotic and nutraceutical products including said biomass <130> E057074 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> eubacteria universal primer 26f <400> 1 agagtttgat cctgcctcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> eubacteria universal primer 1495r <400> 2 ctacggctac cttgttacga 20 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> misc_feature <222> (301)..(301) <223> n = c, a, g or t <400> 3 cagtcgtacg cactggccca actgattgat ggtgcttgca cctgattgac gatggatcac 60 cagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt aggtaacctg ccccggagcg ggggataaca 120 tttggaaaca gatgctaata ccgcataaca acaaaagccg catggctttt gtttgaaaga 180 tggctttggc tatcactctg ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg 240 gcttaccaag gcgatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca atggaactga 300 nacacggtcc atactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat gggcgca 357 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = c, a, g or t <400> 4 ttggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttaacatctt gcgntaacct 60 tagagataag gcgttccctt cggggacgca atgacaggtg gtgcatggtc gtcgtcagct 120 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtta ctagttgcca 180 gcattaagtt gggcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggacga 240 cgtcagatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 300 cgagtcgcaa gctcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cgttctcagt tcggactgta 360 ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 420 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgtaacgccc 480 aaagtcggtg gcctaacctt t 501 <210> 5 <211> 304 <212> DNA <213> Lactobacillus ferintoshensis <220> <221> misc_feature <222> (251)..(251) <223> n = c, a, g or t <220> <221> misc_feature <222> (288)..(288) <223> n = c, a, g or t <400> 5 tcttggtatt gatgttaagt gcttgcattt aactgattta acattgagac gagtggcgaa 60 ctggtgagta acacgtgggt aacctgccct tgaagtaggg gataacactt ggaaacaggt 120 gctaataccg tataacaacc aaaaccacct ggttttggtt taaaagatgg cttcggctat 180 cactttagga tggacccgcg gcgtattagc ttgttggtaa ggtaacggcc taccaaggca 240 atgatacgta nccgacctga gagggtaatc ggccccattg ggactgcnac acggcccaaa 300 ctcc 304 <210> 6 <211> 448 <212> DNA <213> Lactobacillus ferintoshensis <400> 6 gctttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt 60 attcaccgtg gcatgctgat ccacgattac tagcgattcc aacttcatgt aggcgagttg 120 cagcctacaa tccgaactga gaacggcttt aagagattag cttgacctcg cggtttcgcg 180 actcgttgta ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt 240 tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttgctagag tgcccaactg 300 aatgctggca actaacaata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg 360 acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcattctgt ccccgaaggg aacgcctaat 420 ctcttaggtt ggcagaagat gtcaagac 448 <210> 7 <211> 192 <212> DNA <213> Lactobacillus buchneri/parabuchneri <400> 7 gcgtcttggt tattgatgtt aatgcttgca tttaactgat ttaacattga gacgagtggc 60 gaactggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttgaagta ggggataaca cttggaaaca 120 ggtgctaata ccgtataaca accaaaacca cctggttttg gtttataaga tgtattcttg 180 ttataattta tg 192 <210> 8 <211> 306 <212> DNA <213> Lactobacillus buchneri/parabuchneri <400> 8 aaggttacct caccggcttt gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg cggtgtgtac 60 aaggcccggg aacgtattca ccgtggcatg ctgatccacg attactagcg attccaactt 120 catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaacg gctttaagag attagcttga 180 cctcgcggtt tcgcgactcg ttgtaccgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 240 aggggcatga tgatttgacg acatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctagc 300 tagagt 306

Claims

(ⅰ) 셀레늄염을 포함하는 영양 배지에서 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 페린토셴시스(Lactobacillus ferintoshensis), 락토바실러스 부크네리/파라부크네리(Lactobacillus buchneri/parabuchneri) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 셀레늄을 축적하는 미생물을 배양하고;

(ⅱ) 배지로부터 셀레늄이 농축된 미생물을 분리시킴으로써, 0.7 mg/g_d.w. 이상의 셀레늄 함량을 갖는 셀레늄이 농축된 바이오매스(biomass)를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 배지로부터 분리된 미생물을 추가로 동결건조시키거나 건조시켜서, 동결건조되거나 건조된 셀레늄이 농축된 바이오매스를 수득함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미생물이 락토바실러스 류테리 DSM 16143, 락토바실러스 페린토셴시스 DSM 16144 및 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 DSM 16341로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 셀레늄염이 셀레나이트임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배지가 액체 배지임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배지가 무기염, 탄소원, 질소원, 비타민원, 미량 원소원 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 미생물의 성장을 위한 일반적인 영양소를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배지가 2.5 내지 8 범위의 pH를 지님을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미생물이 25 내지 45℃ 범위의 온도로 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미생물이 6 내지 40 시간 동안 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미생물이 원심분리 또는 미세여과에 의해 배지로부터 분리됨을 특징으로 하는 방법.
락토바실러스 류테리, 락토바실러스 페린토셴시스, 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함하고, 0.7 mg/g_d.w. 이상의 셀레늄 함량을 갖는 셀레늄이 농축된 바이오매스.
제 11항에 있어서, 생(生) 미생물을 포함함을 특징으로 하는 바이오매스.
제 11항에 있어서, 미생물이 2004년 1월 17일에 수탁번호 DSM 16143으로 도이체 삼룽 퓌르 미크로오르가니스멘 및 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 기탁된 락토바실러스 류테리 균주 LB2 BM, 2004년 1월 17일에 수탁번호 DSM 16144로 DSMZ에 기탁된 락토바실러스 페린토셴시스 균주 LB6 BM, 2004년 4월 5일에 수탁번호 DSM 16341로 DSMZ에 기탁된 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 균주 LB26 BM, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 바이오매스.
삭제
삭제
제 11항에 따른 셀레늄이 농축된 바이오매스와 비히클, 부형제, 또는 비히클 및 부형제를 함께 함유하는, 프로바이오틱 활성을 지니는 조성물.
제 16항에 있어서, 10⁹ CFU/g 이상의 세균 로드(load)를 지님을 특징으로 하는 조성물.
제 16항 또는 제 17항에 따른 프로바이오틱 활성을 지니는 조성물을 포함하는 식품 제조물.
2004년 1월 17일에 수탁번호 DSM 16143으로 DSMZ에 기탁되고, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4의 부분적 16S rDNA 서열을 갖는 락토바실러스 류테리 균주 LB2 BM, 2004년 1월 17일에 수탁번호 DSM 16144로 DSMZ에 기탁되고, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 부분적 16S rDNA 서열을 갖는 락토바실러스 페린토셴시스 균주 LB6 BM 및 2004년 4월 5일에 수탁번호 DSM 16341로 DSMZ에 기탁되고, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8의 부분적 16S rDNA 서열을 갖는 락토바실러스 부크네리/파라부크네리 균주 LB26 BM으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물.
제 7항에 있어서, 배지가 3.5 내지 7.5 범위의 pH를 지님을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 미생물이 32 내지 40℃ 범위의 온도로 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 미생물이 8 내지 36 시간 동안 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항 또는 제 17항에 따른 프로바이오틱 활성을 지니는 조성물을 포함하는 식품보충제.
제 16항 또는 제 17항에 따른 프로바이오틱 활성을 지니는 조성물을 포함하는 건강기능식품.