KR102118083B1

KR102118083B1 - 가축 분변 균총의 육종진화에 의해 선별된 헴철 생산 미생물 및 이를 이용한 헴철 생산 방법

Info

Publication number: KR102118083B1
Application number: KR1020180140294A
Authority: KR
Inventors: 현 김; 건 김
Original assignee: 주식회사 헤모랩
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2020-06-03
Also published as: KR20200056231A

Abstract

본 발명은 빠른 생장 속도 및 그에 따른 증가된 생합성 능력을 갖는 균주를 선별하기 위한 육종진화 배양에 의해 유전자 조작 없이(non-GMO) 수득된, 모균주에 비해 증가된 생장 속도 및 헴철 생산능을 갖는 균주 및 그를 이용한 헴철 생산 방법에 관한 것이다.

Description

가축 분변 균총의 육종진화에 의해 선별된 헴철 생산 미생물 및 이를 이용한 헴철 생산 방법{Heme-iron producing microorganism obtained from microbiome of domestic animals via evolutionary breeding and method of producing heme-iron using the same}

동물에서 철은 식이에 의해 공급되어야 필수 미네랄이다. 곡류에 주로 포함된 비-헴철(non-heme iron)은 위장장애 부작용과 더불어 생체이용률이 높지 않은 반면에 육류에 포함된 헴철(heme-iron)은 생산원가가 높으나 부작용이 없고 생체이용률이 높다. 헴철이 풍부한 혈액이나 육류를 이용한 식품이나 색소는 다양한 문화권에서 이용되어 왔으나, 바이러스와 같은 인수 공동 감염 질환 유발원의 오염 위험이 대규모 정제과정에 위협이 되어 왔다.

헴철의 공급원으로서, 세균을 포함한 미생물에 의해 생산된 헴철이 다양하게 연구되고 있다. 권 등은 세균에 포함된 헴철은 동물의 헴철과 동일한 화학적 구조를 가지며, 동물 바이러스에 의한 오염 위험이 원천적으로 없으므로 세균에 의해 생산된 헴철이 잠재적인 우수한 철분 공급원이 될 수 있다는 연구 결과를 보고하였다(J. Microbiol Biotechnol. 2009;19(6):604-9). 원핵 세균과 진핵 동물 간에 공통의 질병 유발원이 없기 때문에 미생물이 합성한 헴철은 보다 안전한 철 공급원이 될 수 있다. 그러나, 권 등의 연구에서 사용된 원핵 세균은 재조합 대장균이고 외막에 내독소인 리포폴리사카라이드(LPS)를 포함하므로, 대장균-유래 헴철이 철분 공급원으로 사용되기 위해 LPS로부터 분리되어야 하고, 이는 상업적 적용에 대한 비용 장애 요인이 된다. 이를 해결하기 위해, 최 등은 내독소를 원천적으로 포함하지 않아 GRAS(generally recognized assafe) 숙주이고 산업용 균주로서 다양하게 이용되고 있는 토양 유래 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 유전형질을 재조합하여 헴철 생합성을 유도하고, 그의 배양물이 내독소의 정제과정 없는 사균체 형태로 돼지 사료첨가제나 유산균의 보존 증가제로 활용할 수 있음을 제시하였다 (J Microbiol. Biotechnol. 27 (3), 500-506). 그러나, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 인위적인 유전자 재조합에 의해 헴철 생합성능을 갖도록 유도된 것이고, 유전자 조작에 의해 수득된 산물에 대한 소비자의 우려와 부정적인 인식이 높기 때문에 여전히 효과적이고 우수한 헴철 공급원에 대한 요구가 존재한다.

돼지는 상대적으로 짧은 기간에 체중이 증가된다. 출생시 1-1.5 kg이고, 출행 후 1주차에 체중이 2배까지 증가하고, 3주차에는 4배까지 증가한다. 돼지의 빠른 성장은 3주 내에 철-결핍성 빈혈을 유도하고, 양돈에서 철 보충은 매우 중요한 부분을 차지한다. 철이 충분히 보충되지 않으면, 돼지의 성장 둔화, 설사, 및 심지어 급사가 유발될 수 있다. 철 결핍을 예방하기 위해, 수의학에서는 흙이나 진흙과의 접촉, 모돈 및 신생돈으로의 철 주사, 15g-철염/일의 공급이 권장된다(Diseases of Swine. 10th ed: Wiley-Blackwell; 2012). 그러나, 이러한 방법들은 흙이나 진흙으로부터 박테리아 및 기생충 감염, 철 주사를 위한 수의사의 노고, 및 철염의 낮은 생체이용률과 같은 한계를 갖는다.

이에, 본 발명자들은 철분 결핍 예방 및 성장 촉진을 위한 철분보충용 사료첨가제의 개발을 위한 연구를 수행하여, 감염의 위험 및 고비용 정제 과정 없이, 증가된 양의 헴철을 생산할 수 있으면서 동시에 소비자들의 유전자 재조합에 대한 불안감을 해소하기 위해 가축의 분변에 포함된 장내균총으로부터 육종진화(evolutionary breeding)를 통해 유전자 조작 없이(non-GMO) 헴철 생합성능이 유도되거나 개선된 미생물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 유전자 조작 없이 육종진화에 의해 수득된, 모균주에 비해 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 육종진화로 수득된 미생물을 이용하여 헴철을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 육종진화로 수득된 미생물의 배양에 의해 생산된 헴철 추출물 또는 사균체를 포함하는 철분 공급용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 모균주에 비해 생장속도가 증가된, 수탁번호 KCTC13700BP로 기탁된 클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola) Hemo-C1 균주를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "모균주"는 재조합 방법이나 자연적인 돌연변이를 포함한 진화에 의해 변형되기 이전의 원래의 균주를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 유전자 조작 없이 육종진화에 의해 수득된 균주이다.

원하는 특성을 갖는 균주를 개발하기 위해, 형질전환 등을 통한 유전자 조작이 활발하게 이용되나, 인간의 건강이나 생활에 영향을 미치는 영역에서 유전자 조작 균주를 포함한 유전자 조작 개체가 이용되는 것에 대한 우려나 제한이 존재한다. 인위적인 유전자 조작 없이, 원하는 특성이나 활성을 갖는 균주를 수득하기 위해 자연적으로 발생하는 진화과정을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "육종진화(evolutionary breeding)"는 자연적인 진화 과정의 유도를 통해 원하는 특성을 갖는 개체를 선별하는 방법을 의미한다.

클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola) Hemo-C1 균주는 생장속도가 빠른 균주를 선별하기 위해, 소의 분변으로부터 수득된 균총을 연속배양 장치에서 최소배지의 공급 속도를 증가시키면서 배양하여, 생장속도가 빠른 균주로 진화하도록 유도하는 것에 의해 수득된 균주이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 균주이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 모균주에 비해 증가된 헴철 생산능을 가질 수 있다.

클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola) Hemo-C1 균주는 소의 분변 균총으로부터 빠른 생장 속도를 갖도록 진화 육종을 통해 개발되고, 헴철 생산능의 증가에 근거하여 선별된 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헴철"은 포르피린의 철 착염을 의미하며, 헴(heme)과 호환적으로 사용된다.

본 발명의 또 다른 양태는 빠른 생장속도를 갖도록 유도하는 육종진화에 의해 선별된 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 헴철을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주를 배양하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 배지를 이용하여 수행될 수 있다. 배양 방법 및 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 헴철을 생산하는 방법은 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양물로부터 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균체를 회수하는 단계, 상기 균체를 재현탁시키고 파쇄하는 단계, 수득된 파쇄물로부터 헴철을 포함하는 상층액을 수득하는 단계, 및 상기 상층액으로부터 가열에 의한 침전, 추출 및 동결건조에 의해 헴철을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴철은 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양물 또는 균체, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물, 또는 상기 배양물로부터 정제된 헴철 추출물의 형태일 수 있다. 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양에 의해 수득된 배양물은 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주에 의해 생산된 헴철을 포함하므로, 그 자체로 헴철의 공급원으로 이용되거나, 또는 그로부터 헴철을 추출하는 단계를 더 수행하여 수득된 헴철 추출물로 이용되거나, 또는 추출 후 정제단계를 거쳐 수득된 헴철로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 헴철은 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주 배양물로부터 수득된 상층액을 산-아세톤 혼합물로 추출하는 것에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양물, 또는 그로부터 분리된 헴철을 포함하는, 철분 보충용 조성물을 제공한다.

철분은 혈액의 혈색소(헤모글로빈)를 구성하는 성분으로 산소의 운반과 조직호흡에 관한 기능과 대사과정에 직접적으로 관여하는 필수 미네랄이다. 돼지는 생장 특성상 철분이 매우 중요한 영양 성분이며, 특히, 출생 후 초기 단계에 성장 속도가 빠르므로, 철분부족은 빈혈, 성장둔화, 및 급사 등을 초래할 수 있다.

양돈 산업에서, 철분은 주로 사료를 통해 공급되고, 그 외에 토양이나 진흙과의 접촉이나, 주사제의 형태로 공급된다. 그러나, 토양이나 진흙과의 접촉에 의한 철분 보충은 감염의 위험을 동반하고, 주사제에 의한 주사는 비용 및 노동의 부담을 초래한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 철분 보충용 조성물은 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양을 통해 생산된 헴철을 철분 공급원으로 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 일 구체예에 따라 육종진화를 통해, 유전자 조작 없이 선별된, 모균주에 비해 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 균주는 유전자 조작에 대한 거부감 없이 안전하게 이용될 수 있는 헴철의 제조를 가능하게 하여, 철분 보충용 사료 첨가제를 경제적으로 생산할 수 있게 한다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 균주를 선별하기 위한 육종진화 배양기의 모식도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 균주를 선별하기 위한 육종진화 배양에따른, 소의 분변에서 유래된 균총의 생장 곡선을 보여준다.
도 3은 소 분변에 포함된 균총의 육종진화 전(a)과 후(b)의 메타게놈 분석 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 균주 Hemo-C1의 배양에 따른 헴철 생산량을 보여준다.

실시예 1. 육종 진화에 의한 생장속도 증가 균주 선별

1-1. 건강한 가축의 장내균총 확보

건강상태가 양호한 6개월령 거세 숫소의 신선한 분변을 전국한우협회의 한우농장에서 50g 확보하였다.

수득된 분변 시료 50 g을 50 mL의 생리적 식염수(0.8%)에 분산시켜 블렌딩한 후 고형분을 제외한 장내균총이 포함된 상등액 30 mL를 시료로 채취하고, 이를 육종진화 배양의 접종 및 균총 분석의 재료로 사용하였다.

소의 장내균총을 포함하는 상등액 10 mL를 50 mL의 MCGC 최소배지 (리터당, 글루코오스 40 g, (NH₄)₂SO₄ 4 g, KH₂PO₄ 3 g, Na₂HPO₄ 6 g, NaCl 1 g, 소디움 시트레이트 디하이드레이트 1 g, 비오틴 0.2 mg, 티아민ㆍHCl 1 mg, FeSO₄ㆍ7H₂O 20 mg, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, MnSO₄ mg, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.5 mg, CuCl₂ㆍ2H₂O 0.2 mg, (NH₄)₆ Mo₇O₂₄ㆍH₂O 2 mg, FeCl₃ㆍ4H₂O 0.1mg, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.2 mg, 및 CaCl₂ 70 mg)를 포함하는 엘렌마이어 플라스크(Erlenmyer flask)에 현탁시켜 육종진화 배양의 접종액으로 사용하였다.

1-2. 생장속도 증가 유도 육종진화

1-1에서 준비된 소의 분변에서 유래된 장내균총 시료가 접종된 MCGC 최소배지를 담은 플라스크를 접종액으로 사용하여, 도 1에 도시된 바와 같은 연속식 육종진화 배양기에서 MCGC 최소배지를 초기 15 mL/h의 유속 (생장속도=0.3 h^-1에 해당)으로 페레스탈틱 펌프를 이용하여 공급하고, 오버플로우(overflow)되는 배양액은 펌프로 제거하여 인큐베이터(incubater)인 플라스크 내의 배양액은 상시적으로 50 mL로 유지시키면서, 연속배양을 수행하였다. 장내균총 시료를 포함하는 인큐베이터의 플라스크는 250 rmp으로 진탕하면서 37℃에서 유지하였다. 인큐베이터로 연속적으로 공급되는 MCGC 최소배지의 공급속도를 점진적으로 증가시키면서 3개월간 운전하면서, 육종진화 배양기 내의 균총농도는 12시간 간격으로 오버플로우되는 배양액의 600nm OD(optical density)로 측정하였다. 건세포 중량(dry cell weight)은 1 OD_600nm = 0.25 mg/mL의 흡광계수로 환산했다(AMB Express. 2014; 4: 15).

도 2는 연속식 육종진화 배양 동안 측정된 OD₆₀₀및 비생장속도(specific growth rate)를 보여준다.

최종적으로 연속식 육종진화 배양기에 잔존하는 소 장내균총의 생장속도는 배양 초기의 생장속도 0.3 h^-1에 대비하여 2배 이상 증가하여 0.75 h^- ¹였고, 배양기 내 균체 농도는 OD 1.7 이었다.

소의 장내 균총이 육종 진화 과정을 통해 인위적인 유전자 조작 없이 변화된 것을 확인하기 위해서 육종진화 이전과 이후의 메타게놈을 분리하여 비교하였다. 초기의 분변 분산액과 육종진화 3개월 후의 배양액을 시료로 사용하여, 원심분리(13,000g, 10 min)로 각 시료에 포함된 균총의 미생물시료를 펠렛으로 분리한 후 FastDNA SPIN Kit for Soil 키트(MPBio LC, Santa Ana, CA, USA)에서 제공된 프로토콜을 사용하여 메타게놈을 분리하였다. 분석 전문 기관인 (주)천랩에 의뢰하여 분리된 메타게놈 시료의 균총분석을 수행하였다. 도 3은 육종진화 전(a)과 후(b)의 메타게놈 분석 결과를 보여준다. 초기 균총은 다양한 미생물의 혼합 배양물이었으나 육종진화 이후에는 빠른 생장조건에 적합하지 않은 미생물이 제거되어 균총의 종류가 감소하였다. 이는 육종 진화에 의해, 생장 속도가 빠르고 그에 의해 헴철을 포함한 생산능이 높은 미생물의 비율이 균총 내에 높아졌음을 시사한다.

또한, 생장속도가 증가된 육종진화 균총의 세포내 에너지를 비교하기 위하여 육종진화 전과 후의 균총 현탁액 시료의 ATP 농도를 측정하였다. 세포내 ATP 농도는 ATP determination kit(FL-AA; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 루미노미터(luminometer)(20/20n Luminometer System, Turner Biosystems, Sunnyvale, CA)와 ATP 표준을 이용하여 나 등의 방법에 따라 측정하였다(J Ind. Microbiol. Biotechnol. 42 (6), 915-924). 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 소 분변균총의 육종진화 개시 이전의 세포내 평균 ATP량은 0.327 μmole/g-DCW이었고 육종진화 이후는 1.428 μmole/g-DCW로써, 육종진화 전보다 2배 이상 높은 세포내 에너지량을 보였다.

	육종진화 전 소의 장내균총	육종진화 후 소의 장내균총
ATP 농도 (μmole/g-DCW)	0.327±0.785	1.428±0.772

생장속도의 증가를 유도하는 육종진화에 의해 수득된 균총의 평균 세포내 에너지량이 증가된 것을 확인하였다.

1-3. 육종진화에 의해 생장속도 및 헴 생산능이 증가된 균주의 선별

1-2에서 3개월의 육종진화 완료 후 수득된 연속식 육종 진화 배양기의 오버플로우 배양액 0.01 mL을 고체형 MCGC 최소배지 20 mL (조성: MCGC + 16 g agar)을 포함하는 플레이트에 도말한 후 37℃에서 72 시간 동안 정치배양하였다. 배양 후 플레이트에 형성된 콜로니(육종진화된 균총)를 1800만 화소의 카메라로 촬영한 후, IAT(Image Analysis Toolset, SMH17, 구글 플레이 스토어) 프로그램을 이용하여 콜로니 색소 중 적색(RGB중 R값)이 높은 콜로니들을 선별하였다. 헴철이 생성되면서 콜로니의 색이 적색을 띠게 되므로, 헴철의 생산능이 높을수록 적색소가 강하게 나타났다.

소의 분변으로부터 육종진화에 의해 수득된 균총에서 약 100만개의 콜로니를 조사하여, 적색소의 값이 높은 콜로니 5개를 선별하였다. 선별된 5개의 콜로니를 15 mL의 MCGC 최소배지를 포함하는 테스트 튜브에 접종하고 2일간 37℃에서 250 rpm으로 진탕 배양한 후, 세포에 포함된 헴철을 정량하였다. 대조군으로, 그람음성 박테리아의 지표 균주인 야생형 대장균 ATCC 27325를 동일한 조건에서 배양하였다.

구체적으로, 플라스크 배양에 의해 수득된 선별 콜로니의 배양물과 대조군 의 배양물을 각각 4℃에서 3,000g로 15분 동안 원심분리하여 적색으로 착색된 균체를 회수하고, 증류수로 2회 세척하였다. 수득된 균체를 15 ml의 증류수에 현탁시키고, 1초 간격의 30W로 설정된 초음파 파쇄기(sonicator)(UP200S, Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany)를 이용하여, 얼음 상에서 20분 동안 파쇄시켰다. 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리를 수행하여 세포 파쇄물을 제거하고, 상층액을 65℃ 수조에서 30분 동안 보관하였다. 그 후, 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리를 수행하여 단백질 침전물을 제거하고 그 상층액을 이용하여 헴철 추출물을 수득하였다. 적색의 색소인 헴철을 차가운 산-아세톤 추출 방법(Di Iorio, E.E., Methods Enzymol, 1981. 76: p. 57-72)을 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 수득된 세포 추출물의 상층액을 -20℃에서 교반 하에 100 ml의 산-아세톤(99.8 ml의 아세 톤 + 0.2 ml의 10 N HCl)에 소량씩 적가하였다. 그 후, 상기 용액을 -20℃에서 30 분간 10,000g로 원심분리하였다. 침전물에서 적색을 완전히 제거하기 위해 상기 추 출 과정을 반복하였다. 그 후, 수득된 산-아세톤을 10N NaOH를 첨가하여 중화시키고 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 증발시켰다. 증발 후 잔류된 용액을 동결건조시켜 정제된 헴철 추출물을 수득하였다. 철의 양은 [Fe(NH₄)₂(SO₄·6H₂O]를 표준으로 이용한 오르토-페난트롤린 비색법(Volkova, T.N.and N.V. Patrina, Lab Delo, 1967. 2: 97-8)을 이용하여 결정하였고, 헴철 농도는 C18 컬럼(Xbridge, Waters Co.) 및 400 nm에서의 UV 검출기가 구비된 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)을 이용하여 측정했다(J Microbiol Biotechnol. 2015;25(6):880-6). HPLC 분석은 1M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.16)을 메탄올과 14:86(v/v)으로 혼합한 용액을 이동상으로 이용하여 1 mL/분의 등속 조건에서 수행하였다. 헤민 클로라이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 정량 표준 곡선을 작성하기 위해 이용했다. 헴철 정량 결과가 표 2에 표시된다.

선별 콜로니	헴철 함량(μM/g-DCW)
대장균(그람음성 대조군)	0.043
코리네박테리움 글루타미쿰 (그람양성 대조군)	0.038
콜로니 #1	0.075
콜로니 #2	0.074
콜로니 #3	0.084
콜로니 #4	0.077
콜로니 #5	0.118

육종진화를 통해 수득된 균총 중에서 헴철 생산능이 가장 우수한 콜로니 #5 균주를 모균주 대비 생장속도 및 헴철 생산능이 증가된 균주로 선별하였다.

1-4. 선별된 균주의 동정

1-3에서 선별된 #5 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분석법을 사용하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 전문기관인 (주)천랩에 의뢰하여 수행하였다. #5 균주의 16S rRNA 유전자 서열은 서열번호 1의 서열로 확인되었고, GenBank 데이터베이스를 이용한 상동성 분석을 통해 DMS 15968st 클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola)와 가장 높은 일치율(상동성 99.93%)을 보여 클렙시엘라 바리콜라로 동정되었다. 16S rRNA 서열에 근거하여, #5 균주를 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1로 명명하고, 2018년 11월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC13700BP로 기탁하였다.

실시예 2. 선별된 균주의 헴철 생산성

실시예 1에서 육종진화를 통해 선별되고 동정된 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1의 헴철 생산성을 조사하였다.

클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1을 50 mL의 MCGC 최소배지를 포함하는 삼각플라스크에 접종하고 2일간 37℃에서 250 rpm으로 진탕배양하면서 초기 비생장속도와 2일 후의 균체당 포함된 헴철 함량을 측정하였다. 배양액의 균체 및 상층액에서 헴량을 각각 측정하였다. 채취된 배양액 1mL를 원심분리(10 min, 4℃, 13000 rpm)하여 균체(펠렛)와 상층액을 얻었다. 펠렛은 1M NaOH에 재현탁한 후 0.2g의 비드(Glass bead acid washed 212-300 ㎛, Sigma Aldrich, Missouri, USA)를 바이알에 넣고 비드-파쇄기(bead-beater)(Minibead beater-16, biospec products, Oklahoma, USA)를 이용해 각각 1분간 총 5번 파쇄하고, 파쇄 후 원심분리(10 min, 4℃, 13000 rpm)하고, 상층액 200 ㎕와 400㎕의 아세토니트릴:디메틸술폭시드(DMSO)(4:1, v/v)와 혼합 후 볼텍싱하고, 원심분리(15 min, 4℃, 13000 rpm)한 후에 하층부의 용액을 PTFE 필터로 여과하여 HPLC로 실시예 1에 기재된 방법에 따라 분석하였다. 상층액은 펠렛의 파쇄 과정을 제외하고 동일하게 수행하였다.

클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1은 육종진화 전 균총의 비생장속도 0.3 h^-1보다 약 7배 높은 2.16 h^-1를 보였고, 헴철의 함량은 그람음성 지표 미생물인 야생형 대장균 ATCC 27325 대비 약 2배 높은 0.112 μM/g-DCW였다. 도 4는 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 및 대조군으로서, 그람 음성 세균의 지표 미생물인 야생형 대장균 ATCC 27325의 헴철의 생산량을 보여준다.

<110> Hemolab Ltd. Co. <120> Heme-iron producing microorganism obtained from microbiome of domestic animals via evolutionary breeding and method of producing heme-iron using the same <130> PN180411 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Klebsiella sp. <220> <221> gene <222> (1)..(1374) <223> 16S rRNA <400> 1 cggtagcaca gagagcttgc tctcgggtga cgagcggcgg acgggtgagt aatgtctggg 60 aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc 120 aagaccaaag tgggggacct tcgggcctca tgccatcaga tgtgcccaga tgggattagc 180 tagtaggtgg ggtaacggct cacctaggcg acgatcccta gctggtctga gaggatgacc 240 agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 300 gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg 360 taaagcactt tcagcgggga ggaaggcgat aaggttaata accttgtcga ttgacgttac 420 ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag 480 cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa 540 atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg 600 gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga 660 aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 720 tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc 780 gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 840 actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 900 acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt tccagagatg gattggtgcc 960 ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1020 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggttag gccgggaact 1080 caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc 1140 ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcatata caaagagaag cgacctcgcg 1200 agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc 1260 atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc 1320 cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag gtag 1374

Claims

수탁번호 KCTC13700BP로 수탁된 클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola) Hemo-C1 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 유전자 조작 없이 육종진화에 의해 수득된 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 그람 음성 세균의 지표 미생물인 야생형 대장균 ATCC 27325에 비해 증가된 헴철 생산능을 갖는 것인 균주.
청구항 1의 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 헴철을 생산하는 방법.
청구항 1의 클렙시엘라 바리콜라 Hemo-C1 균주의 배양물, 또는 그로부터 분리된 헴철을 포함하는, 철분 공급용 조성물.