KR20180049611A - 헴철을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제 - Google Patents

Abstract

ALA 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase)를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 그의 배양에 의해 수득된 헴철 추출물을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제에 관한 것이다.

Description

헴철을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제{Iron supplementing feed additive comprising heme-iron}

본 발명은 헴철 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰, 및 그에 의해 제조된 헴철 추출물을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다.

철은 식이에 의해서 공급되어야 하는 필수 미네랄이다. 식용 헴철은 비-헴철(non-heme iron)보다 높은 생체이용률(J Gastroenterol. 1979; 14(7):769-79) 및 낮은 위장 부작용(J Lab Clin Med. 1994;123(4):561-4)을 갖는 것으로 보고되었다. 현재 인구의 25%가 철 결핍이라는 점을 고려할 때(Nutrition. 2007; 23(7-8):603-14), 헴철에 기반한 식이가 가임 연령의 여성에서 철 상태를 개선했다는 것은 놀랍지 않다(Nutrition. 2013; 29(1):89-95). 헴철이 풍부한 혈액 유래 식품 및 헤모글로빈 기반 육류 색소가 다양한 문화권에서 이용되었으나, 인수 공동 감염 질환 유발원(즉, 바이러스)의 오염 위험이 대규모 정제 공정에서 위협이 되었다. 권 등은 재조합 대장균으로부터 합성된 헴이 그러한 위협 없이 마우스를 위한 잠재적인 철 공급원이라고 보고한 바 있다(J Microbiol Biotechnol. 2009;19(6):604-9). 원핵 박테리아와 진핵 인간 간에 공통의 질병 유발원은 없기 때문에, 미생물-합성 헴철은 보다 안전한 철 공급원이 될 수 있다. 그러나, 대장균은 외막에 내독소인 리포폴리사카라이드(LPS)를 포함하고, 대장균-유래 헴철은 LPS로부터 분리되어야 하고, 이는 상업적 적용을 위한 비용 장애를 유발했다. 반면에, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 토양-유래 그람 양성 방선균으로 내독소를 포함하지 않는다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 GRAS(generally recognized as safe) 숙주이고, 산업용 균주로서 다양하게 이용되고 있다(J Microbiol Biotechnol. 2016;26(5):807-22). 내독소 위험이 없기 때문에, 코리네박테리움 글루타미쿰-생산 헴철은 대장균-생산 헴철에서의 비용 장애로 지적된 정제 과정 없이, 직접적으로 동물 사료로 공급될 수 있는 것으로 사료된다.

산화적 스트레스에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰은 산화적 스트레스 하에서도 성장이 가능하여 산업용 균주로서 유용하게 이용될 수 있다. 적응적 실험 진화 (adaptive laboratory evolution, ALE)는 증식 속도가 빠른 미생물을 이용하여 실험실에서 진화를 수행하는 것이다. 한국특허공개 제2014-0064527호는 이러한 적응적 실험 진화를 통해 수득된 산화적 스트레스에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이를 이용한 프로토카테추에이트의 제조방법을 개시한다.

돼지는 상대적으로 짧은 기간에 체중이 증가된다: 출생시 1-1.5 kg, 1주차에 2배 증가, 및 3주차에 4배 증가. 돼지의 빠른 성장은 3주 내에 철-결핍성 빈혈을 유도하고, 양돈 산업에서 철 보충이 요구된다. 철이 보충되지 않으면, 성장 둔화, 설사, 및 심지어 급사가 유발된다. 철 결핍을 예방하기 위해, 수의학에서 흙이나 진흙과의 접촉, 모돈 및 신생돈으로의 철 주사, 15 g-철염/일의 공급이 권장된다(Diseases of Swine. 10th ed: Wiley-Blackwell; 2012). 최근 양돈 산업의 대규모화 때문에, 철 결핍 예방을 위한 방법들은 각각 흙이나 진흙으로부터 박테리아 및 기생충 감염, 철 주사를 위한 수의사의 노고, 및 철 염의 낮은 생체이용률과 같은 한계를 갖는다. 이에, 본 발명자들은 철분 결핍 예방 및 성장 촉진을 위한 철분 보충용 사료첨가제의 개발을 위한 연구를 수행하여, 감염의 위험 및 고비용 정제 과정 없이, 증가된 양의 헴철을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 모균주에 비해 증가된 헴철 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에 의해 제조된 헴철 추출물을 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 ALA 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase)를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헴철"은 포르피린의 철 착염을 의미하며, 헴(heme)과 호환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "모균주"는 재조합 방법이나 돌연변이에 의해 변형되기 이전의 원래의 균주를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 모균주는 KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰은 균주의 생산성을 증가시키기 위해, 산화적 스트레스 하에서 배양하는 것에 의해 산화적 스트레스에 대한 내성이 증가되도록 적응적으로 진화시킨 균주이다(한국특허공개 제2014-0064527호). 구체적으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 H₂O₂의 농도를 점차적으로 증가시키는 배양을 통한 적응적 진화 과정을 통해 산화적 스트레스에 대한 내성이 증가되도록 적응시킨 균주이다.

헴은 다수의 생물학적 과정에 필수적이나, 과다한 헴은 세포에 유해한 효과를 유발하고, 즉, 과량의 헴 첨가는 산소 분자와의 비-특이적 상호작용을 유발하고, 그에 의해 세포의 산화환원 상태 및 산화적 스트레스의 변형을 초래한다(Infect Immun. 2010;78(12):4977-89; J Bacteriol. 2014;196(7):1335-42). 따라서, 세포는 생합성 경로에서 세포내 헴 농도를 긴밀하게 조절한다. 헴 생합성 경로로 2개의 경로가 알려져 있다. 광영양 박테리아, 효모, 및 포유동물에서 발견되는, C4-경로는 숙시닐 CoA와 글리신의 축합에 의한 아미노레뷸린산(ALA)의 생성으로 개시된다. 대부분의 화학적 영양 박테리아, 시아노박테리아, 및 균류에서 발견되는 C5-경로는 ATP 및 NADPH를 보조-기질로 이용한, 글루타메이트의 ALA로의 전환으로 개시된다. ALA 합성 단계가 헴 농도 조절에서 가장 결정적인 단계이다(Sci Rep. 2015;5:8584). 최종 제1철 이온 킬레이션 단계와 함께, 클로로필, 시로헴(siroheme), 및 비타민 B₁₂의 합성을 위한 부속 단계들도 세포내 헴 농도의 조절에 관여한다(J Microbiol Biotechnol. 2015;25(6):880-6).

산화적 스트레스에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰은 산화적 스트레스 하에서도 성장이 가능하므로, 헴철의 축적에 의한 산화적 스트레스에서 견딜 수 있다. 따라서, 헴철 생산능을 증가시킨 균주의 모균주로서 산화적 스트레스에 대한 내성을 갖는 균주가 유용하다.

ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현은 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 카피 수의 증가, 상기 유전자의 발현을 조절하는 인자의 변형, 예를 들면, 발현 강도가 높은 프로모터로의 교체 등에 의해 모균주에 비해 그 발현이 증가될 수 있다.

ALA 합성효소의 활성은 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 변형이나, ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 증가에 의해 모균주에 비해 증가될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자 hemA의 도입에 의해 상기 유전자의 발현이 증가된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 hemA 유전자는 서열번호 3의 염기서열(GenBank: NC_007493.2)을 가질 수 있다.

hemA 유전자의 도입은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 선택하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 양태는 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 헴철 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "헴철 추출물"은 헴철 자체, 또는 배양물 등으로부터 추출된 헴철을 포함하는 추출물, 또는 조성물을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 모균주는 KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 12280BP에 hemA 유전자를 도입하는 것에 의해 제조되어, 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 12280BP에 비해 헴철 생산성이 증가된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴철 추출물은 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물, 또는 상기 배양물로부터 정제된 헴철 추출물의 형태일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에 의해 수득된 배양물은 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산된 헴철을 포함하므로, 그 자체로 헴철의 공급원으로 이용되거나, 또는 그로부터 헴철을 추출하는 단계를 더 수행하여 수득된 헴철 추출물로 이용되거나, 또는 추출 후 정제단계를 거쳐 수득된 헴철로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 배지를 이용하여 수행될 수 있다. 배양 방법 및 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 헴철 추출물은 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터 코리네박테리움 글루타미쿰을 회수하는 단계, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰을 재현탁시키고 파쇄하는 단계, 수득된 파쇄물로부터 헴철을 포함하는 상층액을 수득하는 단계, 및 상기 상층액으로부터 가열에 의한 침전, 추출 및 동결건조에 의해 헴철을 추출하는 단계에 의해 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 헴철 추출물은 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터 수득된 상층액을 산-아세톤 혼합물로 추출하는 것에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 일 양태는

ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계,

상기 배양물로부터 코리네박테리움 글루타미쿰을 회수하는 단계, 및

회수된 코리네박테리움 글루타미쿰을 건조시키는 단계를 포함하는,

헴철 추출물을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제를 제조하는 방법을 제공한다.

일반적으로 "사료첨가제"는 사료에 첨가하여 질병의 예방, 영양결핍의 개선, 사료효율의 증진 및 성장촉진 등을 목적으로 사용하는 의약품, 예를 들면, 비타민제, 프로비타민제, 항생제, 항균제, 항산화제, 항균제, 효소제, 생균제, 아미노산제 및 미량 광물질 등을 의미하며, 가축의 생명유지와 축산물 생산을 최대화하기 위하여 에너지와 단백질 공급을 기본으로 하는 가축사료에, 소량으로 첨가 또는 보충하여 사료의 효과를 높여주기 위해 사용되는 물질을 총칭한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 모균주는 KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 회수된 코리네박테리움 글루타미쿰을 건조시키는 단계 전에, 상기 회수된 세포를 부형제와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 부형제는 옥수수 가루, 밀가루, 귀리 가루, 대두 가루, 쌀가루, 및 보리가루로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

철분은 혈액의 혈색소(헤모글로빈)를 구성하는 성분으로 산소의 운반과 조직호흡에 관한 기능과 대사과정에 직접적으로 관여한다. 철분이 부족할 때에는 철분 결핍성 빈혈을 일으키게 된다. 새끼 돼지는 발육속도가 매우 빨라서 출생시 체중은 1.0~1.5㎏에 불과하지만 1주령시에는 약 2배, 3주령시에는 약 4배가 되며, 따라서 각 장기 및 신체 조직도 급속도로 발육하게 된다. 이때 외부로부터 공급되는 철분의 함량이 부족하게 되면, 적혈구의 구성성분인 혈색소 (헤모글로빈) 생산량이 감소되고, 자돈의 체중증가율을 따라잡지 못하므로 생후 3주령 이내에 생리적 빈혈이 오게 된다. 자돈의 혈액 중 혈색소량이 감소하게 되면 설사 발생 빈도가 높아지고 항병력이 저하되어 질병에 대한 감수성과 발생이 높아지는 외에도 성장이 늦어지고 허약돈이 되기 쉽다. 철분 결핍은 보통 원발성인데 모유가 유일한 철공급원인 신생자축에서 많이 발생된다. 이는 모유도 철분 공급원으로서는 빈약하기 때문이다. 신생자축의 간에 저장된 철은 정상적인 혈구형성을 2~3주 이상 유지하는데 불충분한 양이며 자돈에서는 현저하게 부족하다. 헴철은 헤모글로빈과 미오글로빈 등에 함유되어 있는 성분으로서 일반적으로 도축 혈액으로부터 분리, 정제하여 생산되기도 한다. 그러나, 광우병 등과 같이 동물에서 유발될 수 있는 질병의 위험 때문에 안전성이 문제되며, 또한, 헤모글로빈 내의 헴철의 함량이 낮기 때문에 과량을 섭취해야 하고, 이에 따른 단백질 과잉의 우려가 있다.

돼지는 생장 특성상 철분이 매우 중요한 영양 성분이며, 특히, 출생 후 초기 단계에 성장 속도가 빠르므로, 철분부족은 빈혈, 성장둔화, 및 급사 등을 초래할 수 있다.

양돈 산업에서, 철분은 주로 사료를 통해 공급되고, 그 외에 토양이나 진흙과의 접촉이나, 주사제의 형태로 공급된다. 그러나, 토양이나 진흙과의 접촉에 의한 철분 보충은 감염의 위험을 동반하고, 주사제에 의한 주사는 비용 및 노동의 부담을 초래한다.

본 발명의 일 양태는 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 헴철 추출물을 포함하는 철분보충용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 일 양태에 따른 철분 보충용 사료 첨가제는 저비용으로 제조되어, 돼지에 공급되는 일반 사료에 첨가하는 것에 의해 용이하게 공급될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사료 첨가제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정된 양으로 사료에 첨가될 수 있다. 첨가되는 사료 첨가제의 양은 사료 급여 대상의 체중, 성별, 건강 상태, 및 급여의 목적 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사료 첨가제는 양돈용 사료에 첨가될 수 있다.

상기 사료 첨가제는 헴 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양물, 그의 건조물 또는 추출물, 또는 그로부터 수득된 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 사료 첨가제는 침투, 분무 또는 혼합에 의해 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제에는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명은 헴철 생산능이 증가된 GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 및 그를 이용한 헴철 추출물 제조방법을 제공하여, 양돈에서 유용하게 이용될 수 있는 철분 보충용 사료 첨가제를 경제적으로 생산할 수 있게 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에서 생산된 헴철 추출물의 스펙트럼 스캔 결과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 HA_pSL360-hemA(●) 및 대조구 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(○)의 배양에서 수득된 바이오매스 및 헴철 생산량을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에 의해 생산된 헴철 추출물을 포함하는 철분 공급용 사료 첨가제와 대조구 사료 첨가제를 공급받은 자돈의 체중 증가를 모니터링한 결과를 도시한다. ●은 헴철 추출물을 포함하는 철분 공급용 사료 첨가제를 공급한 자돈을 나타내고, ○는 대조구 사료 첨가제(밀가루)를 공급받은 자돈을 나타낸다.
도 4는 수의사가 확인한 헴철 추출물의 자돈 사육에 대한 영향에 관한 임상시험 결과지를 보여준다.

실시예 1. 모균주에 비해 개선된 헴철 생산능을 갖는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 작제

헴철 생산능이 높은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 작제하기 위해, 모균주로 산화적 스트레스에 내성을 갖게 하는 적응적 진화에 의해 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 HA(KCTC 12280BP)을 이용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 HA는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032)로부터 적응적 진화에 의해 수득된 균주이다(Biotechnol Lett. 2013;35(5):709-17).

1-1. 재조합 균주의 작제

헴철 생산능을 증가시키기 위해, 헴철의 생합성에서 속도 결정 단계인 ALA 합성에 관여하는 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 HA에 도입시켰다.

ALA 합성효소를 코딩하는 hemA 유전자를 J Microbiol Biotechnol. 2015;25(6):880-6에 개시된 바와 같은 pTrc(P_lac hemA ⁺-coaA)를 주형 DNA로 이용하여 서열번호 1 및 2의 프라이머 CTGCAG AGGAAACAGACCATGGACTACAATCTGG 및 CTGCAGAAACCTAGGGGATCCGCCAGCGGATCCTAG (밑줄친 부분은 PstI 인식 부위, 진한 글씨로 표시된 부분은 리보솜 결합 부위를 나타냄)로 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 TA-벡터 (T-blunt PCR Cloning Kit, 솔젠트, 대전, 한국) 내로 서브클로닝하고, 대장균 DH10B에 형질전환시켰다. 대장균 DH10B를 LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃에서 배양했다.

서열확인 후, 서브클로닝된 벡터를 PstI으로 처리하고, DNA 단편(1.7 kb)을 코리네박테리움 발현 벡터인 PstI-처리 pSK1cat-P₁₈₀에 라이게이션시켜서(J Microbiol Biotechn. 2004;14(4):789-95), pSL360-hemA를 수득하였다. 작제된 벡터를 헴철 생산을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 HA 균주에 형질전환시켜 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 HA_pSL360-hemA을 수득하였다.

1-2. 재조합 균주의 배양 및 헴철 추출물의 생산

(1) 재조합 균주의 배양

1-1에서 수득된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 카나마이신 25 mg/L가 보충된 MCGC 최소 배지(리터당, 글루코오스 40 g, (NH₄)₂SO₄ 4 g, KH₂PO₄ 3 g, Na₂HPO₄ 6 g, NaCl 1 g, 소디움 시트레이트 디하이드레이트 1 g, 비오틴 0.2 mg, 티아민ㆍHCl 1 mg, FeSO₄ㆍ7H₂O 20 mg, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, MnSO₄ㆍH₂O 2 mg, FeCl₃ 2 mg, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.5 mg, CuCl₂ㆍ2H₂O 0.2 mg, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.1mg, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.2 mg, 및 CaCl₂ 70 mg)에서 30℃에서 배양했다. 대조구로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 동일한 조건 하에서 배양하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 바이오매스는 600 nm에서 OD(optical density)로 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 건세포 중량(dry cell weight)은 1 OD_600nm = 0.25 mg/mL의 흡광계수로 환산했다(AMB Express. 2014;4:15).

ALA 합성효소 활성은 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 중 20 mM MgCl₂, 0.1 M 디소디움 숙시네이트, 0.1 M 글리신, 0.1 mM 피리독살 포스페이트, 15 mM ATP, 0.2 mM CoA, 및 50 ㎕의 세포 추출물로 구성된 1 mL 반응 혼합물로부터의 ALA 형성에 근거하여 확인했다(J Microbiol Biotechnol. 2007;17(9):1579-84). 상기 효소 반응 혼합물은 Ehrlich 반응 완충액 [파라-디메틸아미노벤즈알데히드 0.02 g, 빙초산 0.84 mL, 70% (v/v) 과염소산 0.16 mL]을 첨가하는 것에 의해 시각화시키고, 표준 ALA를 이용하여 555 nm에서의 흡광도로 측정했다. 추출물의 단백질 함량은 BSA(bovine serum albumin)을 표준으로 이용한, Protein Assay Kit (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정했다. ALA 합성효소 활성 1 유닛은 분당 1 μmole의 ALA를 전환시키는 효소의 양으로 정의하였다.

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 헴 생합성 경로의 속도 결정 단계를 우회하기 위해, ALA 합성효소를 코딩하는 유전자(hemA)를 P180 프로모터(구성적(constitutive) 프로모터)의 제어 하에 발현시키는 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 HA에 도입하는 것에 의해 작제되었고, 활발하게 증식하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 추출물은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 추출물이 ALA 합성효소의 활성을 보이지 않을 때 ALA 합성효소의 활성을 보여서, hemA 유전자가 기능적으로 발현되었다는 것을 보여주었다.

ALA 합성효소의 활성은 하기와 같이 측정하였다.

지수생장기의 코리네박테리움 글루타미쿰 세포를 원심분리 (5000 rpm, 10min, 4℃)로 분리한 후 유리 비드(212-300 mm, Sigma-Adrich Co.) 10% (w/w)를 첨가한 후 비드분쇄기(Mini-BeadBeater16, Biospec, Bartlescille, OK, USA)에서 30분간 진탕하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 침전물을 원심분리 (12000 rpm, 10min, 4℃)로 제거한 후 남은 세포 추출물에 포함된 효소활성을 효소반응액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl₂, 0.1 M 디소디움 숙시네이트, 0.1 M 글리신, 0.1 mM 피리독살 포스페이트, 15 mM ATP, 0.2 mM CoA, 및 50 ㎕의 세포 추출물)을 37℃에서 30분간 반응시켜 ALA 합성을 유도하여 측정하였다. 합성된 ALA의 농도는 Ehrlich 반응액 (Bio-Rad Laboratory)으로 발색 후 550nm의 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 결정하였다(UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japan). 결과가 하기 표 1에 요약된다.

세포	ALA 농도 (μmol/min. OD1)
C. glutamicum 13031 (야생형)	0 ±0.05
C. glutamicum HA (진화적응형)	0 ±0.03
C. glutamicum 13031 + hemA	1.77 ±0.09
C. glutamicum HA + hemA	1.82 ±0.11

hemA 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 재조합 코리네박테리움을 MCGC 최소배지에서 배양하면 초기에는 황색을 띠다가, 배양 72시간 내에 적색으로 변했다. 적색 색소가 헴인 것으로 사료되어, 하기에 기재된 바와 같이, 그 색소를 분리하고 스펙트럼 분석을 수행하였다.

(2) 헴철 추출물의 생산 및 헴철의 확인

(1)에서의 배양에 의해 수득된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양물과 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 배양물을 각각 4℃에서 3,000g로 15분 동안 원심분리하여 적색으로 착색된 코리네박테리움 글루타미쿰을 회수하고, 증류수로 2회 세척하였다.

상기 세포들을 15 ml의 증류수에 현탁시키고, 1 초 간격의 30W로 설정된 초음파 파쇄기(sonicator)(UP200S, Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) 를 이용하여, 얼음 상에서 20분 동안 파쇄시켰다. 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리를 수행하여 세포 파쇄물을 제거하고, 상층액을 65℃ 수조에서 30분 동안 보관하였다. 그 후, 4℃, 10,000g에서 10 분간 원심분리를 수행하여 단백질 침전물을 제거하고 그 상층액을 이용하여 헴철 추출물을 수득하였다.

적색의 색소인 헴철을 차가운 산-아세톤 추출 방법(Di Iorio, E.E., Methods Enzymol, 1981. 76: p. 57-72)을 이용하여 추출하였다. 상기에서 수득된 세포 추출물의 상층액을 -20℃에서 교반 하에 100 ml의 산-아세톤(99.8 ml의 아세톤 + 0.2 ml의 10 N HCl)에 소량씩 적가하였다. 그 후, 상기 용액을 -20℃에서 30분간 10,000g로 원심분리하였다. 침전물에서 적색을 완전히 제거하기 위해 상기 추출 과정을 반복하였다. 상기 과정에서 수득된 산-아세톤을 10N NaOH를 첨가하여 중화시키고 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 증발시켰다. 증발 후 잔류된 용액을 동결건조시켜 정제된 헴철 추출물을 수득하였다.

각 추출물의 단백질 함량은 우혈청 알부민을 표준으로 이용한 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.)를 이용하여 결정하였다. 철의 양은 [Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O]를 표준으로 이용한 오르토-페난트롤린 비색법(Volkova, T.N.and N.V. Patrina, Lab Delo, 1967. 2: 97-8)을 이용하여 결정하였다.

헴 농도는 C18 컬럼(Xbridge, Waters Co.) 및 400 nm에서의 UV 검출기가 구비된 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)을 이용하여 측정했다(J Microbiol Biotechnol. 2015;25(6):880-6). 용리액(1 M ammonium acetate mixed with 86 % methanol, v/v. pH 5.16)을 1 mL/분의 유속으로 등속으로 흘렸다(isocratic). 소로부터의 헤민 클로라이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 정량 표준 곡선을 작성하기 위해 이용했다.

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양액에서 관찰된 적색이 헴철에 의한 것이라는 것을 확인하기 위해 UV1240 분광분석기(Shimadzu사, 교토, 일본)를 이용하여 추출물의 스펙트럼을 조사하였다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 수득된 추출물의 스펙트럼은 407 nm에서 주요 피크를 보이고, 500 및 503 nm에서 작은 피크를 보였고, 이는 헴의 특징적인 스펙트럼과 일치한다(Berry and Trumpower, Simultaneous determination of hemes a, b and c from pyridine hemochrome spectra. Anal Biochem 161(1):1-15, 1987). 도 1은 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에서 생성된 헴철을 함유하는 추출물의 스펙트럼을 도시한다. 이에 의해, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에서 생성된 적색 색소는 헴철로 확인하였다.

과량의 헴은 산화적 스트레스를 유발했을 것이므로(P Natl Acad Sci USA. 2013;110(20):8206-11), 산화적 스트레스-내성 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 모균주로 이용하여 헴 축적을 유도했다. H₂O₂ 스트레스 하에서 적응적으로 진화된, HA 균주(Biotechnol Lett. 2013;35(5):709-17)를 ALA 합성효소를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주로 이용하였다. 도 2는 상기 1-1에서 작제된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰과 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032)의 배양에 따른 바이오매스와 헴철 생산량을 보여준다. ALA 합성효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 HA 균주의 배양물(OD=47.7)은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(OD=47.6)와 유사한 수준의 바이오매스를 생성했다. 그러나, 헴 함량은 재조합 HA 균주의 경우 0.74±0.15 mg_{- heme}/g-_DCW 이고, 야생형의 경우, 0.33±0.08 mg_{- heme}/g-_DCW 이었다. 따라서, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 HA 균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 비해 2배 이상 많은 양의 헴을 생성했다.

실시예 2. 사료 첨가제의 제조 및 돼지 사육

실시예 1에서 수득된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여, 파일롯 스케일의 프로토타입 첨가제 생산을 위해, 바이오 제어 연구 센터(Bio Control Research Center)(곡성, 한국)의 시설에서 일련의 발효를 수행하였다. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 단일 콜로니를 1L YS 배지(리터당, 글루코오스 40 g, 효모 추출물 10 g, 소이톤 10 g, MgSO₄ 1 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g, K₂HPO₄ 1.5 g, NaH₂PO₄ 0.5 g, CaCl₂ 0.4 g, FeSO₄ 0.02 g: 공업 등급)를 담은 3-L 배플 플라스크(baffled flask)에 접종하고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양액을 30 L의 YS 배지를 담은 50-L 발효조(KBT Ltd., Incheon, Korea)에 접종하였다. 18시간의 배양 후에, 배양액을 2,000L의 YS 배지를 담은 5-톤 발효조(KBT Ltd.)로 무균 조건 하에 옮겼다. 30℃에서 30시간 동안 다양한 교반 속도 및 포기(aeration)(1 vvm)에 의해 용존 산소를 포기 30-40%로 유지시켰다. 정지기 후에, 포기를 중단시키고, 배양물을 3일 동안 유지시켜서 헴철이 축적되게 하였다. 세라믹 막 필터 시스템(Puretech EnG Co., Goyang, Korea)을 이용하여 세포를 수집하고, 수집된 세포 케이크를 60 kg의 밀가루와 혼합하고 100 kg-분무 건조기(Cheilgigong, Jinju, Korea)에서 건조시켰다. 분무 건조는 200℃ 고온 공기 블로잉으로 수행하였다. 건조된 프로토타입 산물을 돼지 급여 테스트에서 사용하였다.

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산된 헴철이 돼지의 철분 공급원으로 이용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 전술된 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터 수집된 바이오매스와 밀가루를 중량 기준 1:9로 혼합하여 분무 건조시켜서 사료 첨가제를 수득하고, 일반 사료(Don Don Step3, CJ Cheiljedang, Seoul, Korea)와 중량 기준 1:9의 비율로 혼합하였다. 대조구의 사료는 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물 없이, 밀가루만을 일반 배합 사료와 중량 기준으로 1:9로 혼합하였다. 제조 비용을 절감하기 위해, 헴 정제 단계 없이, 전체 바이오매스를 분무 건조시키고, 70 kg의 프로토타입 사료첨가제를 제조하였다. 프로토타입 사료 첨가제는 중량 기준으로 90%의 밀가루와 10%의 헴-생성 코리네박테리움 글루타미쿰 건조 세포를 포함했다.

프로토타입 사료 첨가제의 헴철 공급원으로부터의 잠재력을 확인하기 위해, 농장(양성 그린바이오, 용인, 한국)에서 두 마리의 3주령 수컷 돼지에 준비된 혼합 사료(프로토타입 첨가제:일반 사료=1:9 w/w)를 수의사의 일별 검진 하에 3주 동안 3주령의 수컷 돼지에 공급하고 매주 돼지의 체중을 모니터링하였다. 일일 사료 공급량은 1주차에 1 kg/일, 2주차에 1.2 kg/일, 및 3주차에 1.5 kg/일이었다. 도 3은 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산된 헴철을 포함하는 사료 첨가제와 혼합된 사료를 공급받은 돼지의 체중 변화를 보여준다. 밀가루와 일반 사료가 중량 기준으로 1:9로 혼합된 혼합물을 공급받은 대조구 돼지는 18.0 kg의 체중 증가를 보이고, 헴-생산능을 갖는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 바이오매스와 밀가루의 혼합물의 분무건조물과 일반 배합사료가 혼합된 혼합물을 공급받은 돼지는 3주 동안 19.1 kg의 체중 증가를 보였다. 대조구 돼지에서는 1회의 경미한 설사 증상이 관찰되었으나, 코리네박테리움 글루타미쿰 바이오매스를 공급받은 돼지에서는 테스트 기간 동안 설사 증상이 관찰되지 않았다. 3주 동안의 돼지 검진은 수의사에 의해 확인되었다. 도 4는 수의사에 의해 확인된 임상시험성적서를 보여준다.

<110> Catholic University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Iron supplementing feed additive comprising heme-iron <130> PN160273 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hemA <400> 1 ctgcagagga aacagaccat ggactacaat ctgg 34 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hemA <400> 2 ctgcagaaac ctaggggatc cgccagcgga tcctag 36 <210> 3 <211> 1224 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <220> <221> gene <222> (1)..(1224) <223> hemA <400> 3 atggactaca atctggcact cgataccgct ctgaaccggc tccataccga gggccggtac 60 cggaccttca tcgacatcga gcggcgcaag ggtgccttcc cgaaagccat gtggcgcaag 120 cccgacggga gcgagaagga aatcaccgtc tggtgcggca acgactatct cggcatgggc 180 cagcatccgg tggtgctggg ggccatgcac gaggcgctgg attcgaccgg cgccgggtcg 240 ggcggcacgc gcaacatctc gggcaccacg ctctatcaca agcgcctcga ggccgagctc 300 gccgacctgc acggcaagga agcggcgctg gtcttctcgt cggcctatat cgccaacgac 360 gcgaccctct cgacgctgcc gcagctgatc ccgggcctcg tcatcgtctc ggacaagttg 420 aaccacgctt cgatgatcga gggcatccgc cgctcgggca ccgagaagca catcttcaag 480 cacaatgacc tcgacgacct gcgccggatc ctgacctcga tcggcaagga ccgtccgatc 540 ctcgtggcct tcgaatccgt ctattcgatg gatggcgact tcggccgcat cgaggagatc 600 tgcgacatcg ccgacgagtt cggcgcgctg aaatacatcg acgaggtcca tgccgtcggc 660 atgtacggcc cccgcggcgg cggcgtggcc gagcgggacg ggctgatgga ccggatcgac 720 atcatcaacg ggacgctggg caaggcctat ggcgtgttcg gcggctatat cgcggcctcg 780 tcaaagatgt gcgacgcggt gcgctcctac gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840 ccgcccgtcg tggcggccgg tgcggcggcc tcggtgcgcc acctcaaggg cgatgtggag 900 ctgcgcgaga agcaccagac ccaggcccgc atcctgaaga tgcgcctcaa ggggctcggc 960 ctgccgatca tcgaccacgg ctcgcacatc gtgccggtcc atgtgggcga ccccgtgcac 1020 tgcaagatga tctcggacat gctgctcgag catttcggca tctatgtcca gccgatcaac 1080 ttcccgaccg tgccgcgcgg gaccgagcgg ctgcgcttca ccccgtcgcc cgtgcatgat 1140 tccggcatga tcgatcacct cgtgaaggcc atggacgtgc tctggcagca ctgtgcgctg 1200 aatcgcgccg aggtcgttgc ctga 1224

Claims (9)

1. ALA 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase)를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 모균주는 KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 ALA 합성효소를 코딩하는 유전자 hemA의 도입에 의해 상기 유전자의 발현이 증가된 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
4. ALA 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 ALA 합성효소의 활성이 모균주에 비해 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계,
   상기 배양물로부터 코리네박테리움 글루타미쿰을 회수하는 단계, 및
   회수된 코리네박테리움 글루타미쿰을 건조시키는 단계를 포함하는,
   헴철을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제를 제조하는 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 모균주는 KCTC 12280BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 방법.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 회수된 세포를 부형제와 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
7. 청구항 5에 있어서, 상기 부형제는 옥수수 가루, 밀가루, 귀리 가루, 대두 가루, 쌀가루, 및 보리가루로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
8. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 헴철을 포함하는, 철분보충용 사료 첨가제.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 사료 첨가제는 양돈용 사료에 첨가되는 것인 사료 첨가제.

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