KR20190025101A - 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 kbcbs1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법 - Google Patents

항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 kbcbs1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항영양인자 제어 미생물 M. hydrothemale KBCBS1021 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법에 관한 것으로 본 발명에 의한 M. hydrothemale KBCBS1021 균주 또는, 균주에서 유래한 추출물 또는 분획물을 이용한 발효 대두박 및 발효 대두박을 유효성분으로 하는 발효 조성물은 발효 전에 비해 항영양인자가 저감 효과를 나타내므로 사료를 비롯한 다양한 조성물에 영양공급원으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 KBCBS1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법{Method for preparing fermented soybean meal for replacing fishmeal using Anti-Nutritional Factor controlling strain Microbacterium hydrothemale KBCBS1021}
본 발명은 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법에 관한 것이다.
사육 및 양식에 있어 사료공급은 생산비의 큰 부분을 차지하고 있으며, 생산량 증대에 중요한 영향을 미친다. 그러나, 양식에 의한 수질오염은 급여되는 사료와 관계 있기 때문에 배합사료의 개발은 양식생산성과 환경보호 측면이 가장 우선적으로 고려되어야 한다. 이에 전 세계적으로 안전하고 건강한 사료의 지속 가능한 공급을 위하여 환경 친화적 저오염, 고효율 배합사료의 개발에 많은 투자를 하고 있다.
현재 사료용의 가장 일반적 단백질원인 어분(fishmeal)은 동물성 단백질로 성장에 필수성분인 단백질 함량이 풍부하게 함유되어 있을 뿐만 아니라, 특히 여러 종류의 아미노산이 함유되어 있고, 항영양인자(anti-nutiritonal factor)가 많지 않아 소화력이 매우 양호하여 육상의 가축 및 양식 어류를 아우르는 가장 이상적인 사료 성분으로 이야기되고 있다. 그러나, 주요 어분 수출국인 페루와 칠레의 경우 2008년에 206만3,000톤을 생산했으나 2012년도에는 116만1,000톤, 2013년에는 85만5,000톤을 생산하는데 그쳐 어분 생산량 감소세를 나타냈으며, 2014년 엘니뇨 발생으로 인해 남미연안에 따뜻한 바닷물이 유입돼 어분 재료인 엔쵸비 어군 형성을 방해해 페루 등 주요 어분 수출국의 생산량이 급감하는 등 어분의 공급이 불안정하여 가격이 상승하면서 이를 대체할 수 있는 단백질원의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.
프랑스 국립농업연구소(French National Institute for Agriculture Research)는 EU의 5차 연구계획에 의거, 양식을 위한 ‘식물 단백질 사용(PEPPA, Perspectives of Plant Protein Use in Aquaculture)’이라 불리는 연구사업을 시작하였으며, 국내에서도 양식사료에서 어분 사용량을 줄이는 연구가 진행되고 있다.
어분 대체 단백질의 예로는 대두박분(soybean meal), 분리대두단백(soy protein isolate), 카놀라분(canola meal), 옥수수 글루텐분(corn gluten meal) 및 기타 식물성 물질이 있으며, 종래의 어분을 대신해 상기 물질들을 사용하려는 경향이 높아지고 있다. 이들 물질은 2011년 기준, 어분 가격의 1/4에 불과해 충분한 공급이 가능하며, 식물성 단백질이기에 스크래피(scrapie)와 같은 동물성 단백질 매개 질환에서 자유로운 것으로 알려져 있다.
대두박은 콩기름을 짜고 남은 찌꺼기를 의미하는 것으로 건조상태를 기준으로 단백질이 55~56%, 가용성 탄수화물이 13~14%, 불용성 탄수화물이 21~22%, 지방이 1% 및 미네랄이 4~6% 가량 함유되어 있다. 대두박과 같은 식물성 물질의 장점은 상기와 같이 저렴한 가격과 단백질 함량이 높다는 점이다. 그러나, 어분 대신 이들 식물성 단백질을 사용할 때의 단점으로는 동물성 단백질에 비해 오메가-3 지방산 함량이 낮은점, 대두박분의 쓰레오닌(threonine) 및 티로신(tyrosine)과 같은 아미노산의 함량이 동물성 단백질에 비하여 좋지 못한 점과 같이, 식물성 단백질에는 가축에 필요한 필수 아미노산의 조성에 있어 일부 부족한 부분이 있고, 비타민, 미네랄 및 UGF(Unknown Growth Factor) 함량이 우수하지 못한 영양 불균형의 문제점이 있다.
상기와 같은 영양 함량의 불균형과 함께 문제가 되는 것으로 식물체에 있는 항영양성분의 존재를 들 수 있다. 예를들어, 대두에 함유된 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF)인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)는 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)의 적절한 효소기능을 방해하여 대두 내에 존재하는 전체 단백질의 이용성을 저하시킨다. 이외에도, 항영양인자로는 혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin), 단백질 및 미네랄 등과 상호작용하는 파이테이트(phytate), 가축의 설사와 복통을 유발하는 라피노스(raffinose) 및 스타키오스(stachyose) 등과 같은 올리고당, 및 영양성분의 흡수를 저해하는 다당류 등이 알려져 있다. 특히 이러한 항영양인자는 어린 가축에 더욱 영향을 주기 때문에, 어린 가축용 사료에는 대두박의 첨가량을 제한하고 있다. 양식어류에서도 항영양인자로 인해 성체로 성숙시키는데 많은 시간이 걸리는 문제가 나타나기도 한다. 이러한 문제들로 인해 일반적으로 동물사료에서는 대두박분과 같은 식물성 단백질이 단백질 공급원으로 많이 활용되지 못하고 있으며, 특히 어류사료에서는 대두박 성분을 많이 사용할 수 없는 것으로 알려져 있다.
따라서, 어분의 대체제로서 식물성 단백질을 이용하기 위해서는, 상기 식물성 단백질원에 존재하는 항영양인자를 줄이는 것이 해결과제로 남아 있다. 현재, 열을 가해 트립신 저해제의 양을 가열 전 39 mg/g에서 4 mg/g 이하 수준으로 낮추는 방법도 사용되고 있으나, 다른 영양성분의 파괴 및, 사육 동물의 새끼와 같이 크기가 작은 개체에서는 잔존 항영양인자에 의한 영향이 계속 미치는 문제 등이 있으며, α-갈락토시다아제(α-galactoside) 및 갈락토만난(galactomannan)등 일부 항영양인자는 열처리 가공에 저항성이 높아 한계가 있다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0027535호에서는 바실러스균을 대두박에 첨가하여 발효시켜 항영양인자를 저감시키는 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0645284호에서도 바실러스 서브틸리스 GR-101과 아스퍼질러스오리재 GB-107를 이용해 효소생성능을 강화하는 고체발효 대두단백질 가공 방법을 개시하는 등 미생물 첨가를 통해 항영양인자를 저감시키는 방법들이 개발되고 있다.
이에 본 발명자들은 항영양인자를 억제하는 신규한 미생물을 선별하였으며, 이를 이용하여 제조한 발효 대두박에서 항영양인자가 감소되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0027535호 대한민국 등록특허 제10-0645284호
본 발명의 목적은 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 (Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 M. hydrothemale KBCBS1021 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두박 내 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF) 활성 억제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조방법을 제공한다:
1) 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 M. hydrothemale KBCBS1021 균주를 배양하여 배양물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 탈피 대두박과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 발효하는 단계.
아울러 본 발명은 상기 방법으로 제조된 발효 대두박을 유효성분으로 함유하는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주 또는, 이의 배양물을 이용한 발효 대두박은 발효 전에 비해 항영양인자가 저감되는 효과를 나타내므로 사료를 비롯한 다양한 조성물에 영양공급원으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주의 API ZYM kit 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 영양한천배지 상에서 순수배양된 M. hydrothemale KBCBS1021 균주이다.
도 3은 M. hydrothemale KBCBS1021 균주의 16S rRNA 염기서열의 분자계통학적 유연관계를 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주를 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 항영양인자 저감 효과를 갖는 균주의 선별 및 어류 양식 환경에도 적용할 수 있는 호염성 미생물을 분리하기 위하여 주요 해변들에서 해당 지역의 모래, 해수, 해초에 서식하는 균주를 분리하였다. 선발한 균주를 대상으로 항영양인자를 제어하는데 관여하는 것으로 알려진 갈락토시다아제(Galactosidase) 생성이 우수한 균주를 선발했다(도 1 및 도 2, 표 1). 16S rRNA 염기서열 분석으로 상기 선발된 균주가 신규한 균주임을 확인한 후(도 3), 'Microbacterium hydrothemale KBCBS1021'로 명명하여 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 M . hydrothemale KBCBS1021 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두박 내 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF) 활성 억제용 조성물을 제공한다.
상기 항영양인자는 트립신 저해제(trypsin inhibitor; TI), 라피노스, 스타키오스, 피토헤마글루틴(렉틴), 요소 분해효소, 리폭시제나제(lipoxygenase), 시안화글루코사이드 및 항비타민 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물일 수 있으며, 구체적으로는 트립신 저해제, 라피노스 또는 스타키오스일 수 있다.
상기 균주 또는 배양액은 균주의 직접 배양 또는, 균주에서 유래한 추출물 또는 분획물을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 직접 배양물은 균주를 배양한 배양액 또는 이를 물리적 방법으로 여과한 것일 수 있다.
상기 조성물은 동물의 사료에 직접 혼합하거나 사료와 별도로 단독으로 경구 제형, 주사 또는경피로 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여될 수 있다. 투여량은 동물의 체중, 건강상태, 식이, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 당 업계에서 잘 알려진 바와 같이 일일 투여량은 약 0.1~10㎎/g, 구체적으로 0.05~1㎎/g이며, 하루 일회 내지 수회 에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 항영양인자 저감 효과를 갖는 신규 균주인 M. hydrothemale KBCBS1021의 배양액을 대두박과 혼합한 다음 발효시킨 후, 수확된 발효 대두박은 발효하기 전과 비교하였을 때 항영양인자 함량이 현저하게 낮아지는 것으로 확인되었다(표 5). 이를 통해 본 발명에 의한 대두박 내 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF) 활성 억제용 조성물은 항영양인자의 감소에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조 방법을 제공한다:
1) 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 M . hydrothemale KBCBS1021 균주를 배양하여 배양물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 탈피 대두박과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 발효하는 단계.
상기 단계 1)의 배양은 하기 성분을 포함하는 배지를 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: a) 아라비노스(Arabinose), 과당(Fructose), 수크로오스(Sucrose) 및 포도당(Dextrose)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 탄소원을 0.1 내지 50 중량부, 구체적으로는 0.5 내지 20 중량부, 더욱 구체적으로는 1 내지 10 중량부; b) 아르기닌(Arginine), 트립톤(Tryptone), 우육추출물(Beef extract), 대두추출물(Soy bean meal), 효모추출물(Yeast extract)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원을 0.01 내지 50 중량부, 구체적으로는 0.05 내지 20 중량부, 더욱 구체적으로는 0.1 내지 5 중량부; 및 c) FeCl2·7H2O, AgNO3, MgSO4·7H2O, K2HPO4, CaCl2·2H2O, FeSO4·7H2O 또는 MnSO4·4-5H2O로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염류를 0.001 내지 5 중량부, 구체적으로는 0.005 내지 1 중량부, 더욱 구체적으로는 0.01 내지 0.5 중량부.
상기 단계 2)의 혼합은 혼합물 전체 100 중량부에 대하여 배양물을 1 내지 80 중량부, 구체적으로는 3 내지 50 중량부, 더욱 구체적으로는 5 내지 30 중량부, 탈피 대두박을 20 내지 99 중량부, 구체적으로는 50 내지 97 중량부, 더욱 구체적으로는 70 내지 95 중량부로 혼합하는 것일 수 있다.
상기 단계 3)의 발효는 3시간 내지 15일, 구체적으로는 1 내지 7일, 더욱 구체적으로는 2 내지 5일간 수행하는 것일 수 있다.
상기 단계 3) 이후 건조시키는 단계를 추가할 수 있으며, 4) 발효 후 3시간 내지 15일, 구체적으로는 1 내지 7일, 더욱 구체적으로는 2 내지 5일간 건조시키는 것 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 a) 아라비노스(Arabinose), 과당(Fructose), 수크로오스(Sucrose) 및 포도당(Dextrose)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 탄소원을 1 내지 10 중량부; b) 아르기닌(Arginine), 트립톤(Tryptone), 우육추출물(Beef extract), 대두추출물(Soy bean meal), 효모추출물(Yeast extract)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원을 0.1 내지 5 중량부; 및 c) FeCl2·7H2O, AgNO3, MgSO4·7H2O, K2HPO4, CaCl2·2H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·4-5H2O로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염류를 0.01 내지 0.5 중량부 포함하는 배지에 M. hydrothemale KBCBS1021 균주를 접종하여 배양한 결과 일반적인 LB 배지에 비해 높은 밀도로 세균이 배양되는 것을 확인했다(표 4). 상기 M. hydrothemale KBCBS1021의 배양액을 대두박과 혼합한 다음 발효시킨 후, 수확된 발효 대두박은 발효하기 전과 비교하였을 때 항영양인자 함량이 현저하게 낮아지는 것으로 나타났다(표 5).
아울러 본 발명은 1) 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 M . hydrothemale KBCBS1021 균주를 배양하여 배양물을 제조하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 배양물을 탈피 대두박과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 혼합물을 발효하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 발효 대두박을 유효성분으로 함유하는 사료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에는 사료로 첨가 가능한 물질, 예를 들면 곡물류, 조강류, 기타 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 곡물류로는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 포함할 수 있다.
상기 조강류로는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수 겨, 옥수수 배아 등을 포함할 수 있다.
상기 기타 식물성 유박류로는 대두박 외의 유박류, 예를 들면 콩가루, 아마박, 면실박, 땅콩박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박(Kapok meal), 겨자박 등을 포함할 수 있다.
상기 동물성 사료 원료로는, 예들 들면 추가적인 어분, 육분, 어골분, 혈분, 골분, 가축 처리 부산물, 페더 밀(feather meal), 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 포함할 수 있다.
상기 기타 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.
상기 정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄, 비타민, 기타 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제 등을 들 수 있다.
상기 사료내의 발효 대두박의 함량은 적용 가축 종류, 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 1 내지 99 중량부, 10 내지 90 중량부, 또는 20 내지 80 중량부 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물용 사료에 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않으나, 바람직하게는 양식어용 사료에 사용될 수 있다.
상기 사료를 적용 가능한 가축 종류는 특별한 제한이 없으며, 예를 들면, 본 발명의 사료는 개, 고양이, 쥐 등의 애완 동물용 사료, 소, 돼지 등의 가축용 사료, 닭, 칠면조 등의 가금용 사료, 도미, 방어, 메기, 붕어, 잉어, 넙치, 뱀장어 등의 어류용 사료로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 a) 아라비노스(Arabinose), 과당(Fructose), 수크로오스(Sucrose) 및 포도당(Dextrose)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 탄소원을 1 내지 10 중량부; b) 아르기닌(Arginine), 트립톤(Tryptone), 우육추출물(Beef extract), 대두추출물(Soy bean meal), 효모추출물(Yeast extract)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질소원을 0.1 내지 5 중량부; 및 c) FeCl2·7H2O, AgNO3, MgSO4·7H2O, K2HPO4, CaCl2·2H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·4-5H2O로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기염류를 0.01 내지 0.5 중량부 포함하는 배지에 M. hydrothemale KBCBS1021 균주를 접종하여 배양한 결과 일반적인 LB 배지에 비해 높은 밀도로 세균이 배양되는 것을 확인했다(표 4). 상기 M. hydrothemale KBCBS1021의 배양액을 대두박과 혼합한 다음 발효시킨 후, 수확된 발효 대두박은 발효하기 전과 비교하였을 때 항영양인자인 트립신 저해제(trypsin inhibitor; TI), 라피노스 및 스타키오스 함량이 현저하게 낮아지는 것으로 확인되어(표 5), 사료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인했다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 주요 항영양인자 제어 미생물의 선발
어류 양식 환경에 적용할 수 있는 호염성 미생물을 분리하기 위하여 경남지역의 주요 해변(사천, 남해, 통영 등)으로부터 해당 지역의 모래, 해수, 해초 등을 샘플링하였다. 각각의 샘플링된 시료는 준비된 멸균수에 10배로 희석하여 30분간 교반 후 멸균수에 단계 희석한 후 5% NaCl LB agar(NaCl 5%, LB broth 2.5%, Bacto agar 2%) 배지에 평판도말하였다. 평판도말 된 배지는 30℃ 인큐베이터에 24시간동안 배양하였고, 배지에 생장한 균주 중 1.0×103 cfu/g(㎖) 이상의 밀도를 나타내는 111종의 호염성 균주를 선발하였다.
선발한 111종의 호염성 균주를 대상으로 라피노스(Raffinose)와 스타키오스(Stachyose)를 제어하는데 관여하는 것으로 알려진 갈락토시다아제(Galactosidase) 생성 균주를 선발하고자, 미생물의 효소 활성을 조사하는데 이용되는 API ZYM kit(Biomerieux, USA)를 활용하였다. 선발한 균주를 순수분리 후 LB broth에 접종하여 30℃, 120rpm으로 48시간 동안 진탕배양한 후, 냉장형 고속원심분리기(한일과학, Korea)을 이용하여 6,000rpm으로 15분간 원심분리하였고, 농축된 배양액을 300㎕씩 샘플링하여 2㎖의 현탁용 매개물(suspension medium)에 넣어 McFarland standard 4 내지 5의 탁도가 되도록 맞추었다. 동시에 준비된 트레이에 스트립을 놓고 준비된 배양액 현탁물을 각 100㎕씩 접종하였다. 35℃의 인큐베이터에 4시간 배양한 후 ZYM A와 ZYM B 시약을 차례로 투입하여 5분간 반응시킨 후 발현된 색깔의 정도에 따라 발현 지수를 0 ~ 5로 구분하여 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 표 1에서와 같이 알파-갈락토시다아제(Alpha-galactosidase)와 베타-갈락토시다아제(Beta-galactosidase)의 발현지수가 3 이상인 KBCBS1021 균주를 최종 선발하였다.
균주 9. Trypsin 10. Alpha- chymotrypsin 13. Alpha- galactosidase 14. Beta- galactosidase
KBCBS1021 1 0 3 4
실시예 2. 유전학적 특성을 통한 균주의 동정
상기 실시예 1에서 선발한 KBCBS1021 균주를 도 2와 같이 영양 한천 배지(Nutrient agar, Difco, USA)에 접종하고 28℃에서 3일간 배양한 후 단일 균주임을 확인하였다. 상기 균주를 영양 배지(Nutrient broth)에 접종한 후 28℃에서 2일간 진탕 배양한 후 벤질 클로라이드법(Benzyl chloride method)을 변형하여 상기 균주의 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA에서 상기 균주의 16S rRNA 유전자를 하기 표 2와 같은 방법으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 시행하였으며, 사용된 프라이머는 표 3과 같다.
온도 시간 cycle 수
95℃ 2 min 1 cycle
94℃ 30 sec 30 cycles
58℃ 30 sec
72℃ 45 sec
72℃ 5 min 1 cycle
서열번호 프라이머 서열
2 프라이머 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
3 프라이머 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3'
얻어진 16S rRNA PCR 산물은 4℃에 보관하였으며, PCR 증폭산물은 PCR Product Purification Kit(Qiagen)를 이용하여 정제하였고, 정제된 산물은 Genetic analyzer 3730xl(Applied biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하여 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자 전염기서열(1,349bp)을 결정하였다.
상기 균주의 16S rRNA 염기서열에 대해 DDBJ/NCBI/Genebank의 데이터 베이스에서 상동성 검색을 수행하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자 계통학적 분석결과, 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.)에 속하는 종으로 판명되었다. 특히, 상기 선발된 균주는 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) 0704C9-2T(HM222660)과 99%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 상기 선발된 균주를 ‘Microbacterium hydrothemale KBCBS1021’로 명명하고, 2016년 11월 22일자로 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC18516P).
실시예 3. 대량 배양액의 제조 및 균주의 대량배양
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선발한 균주의 대량 배양을 위하여 대량 배양기에 물 1 ton을 넣고 탄소원으로 포도당 2%, 질소원으로 효모추출물(Yeast extract) 0.5%, 무기염류로 MgSO4·7H2O 0.02% 및 K2HPO4 0.1%를 포함하고 있는 배지를 제조한 후 121℃에 15분간 고압멸균 후 M. hydrothemale KBCBS1021 균을 접종하였고 30℃에서 100rpm으로 48시간동안 배양한 후, 영양 한천 배지를 이용하여 단계 희석 도말법으로 배양액 내 밀도를 측정하였다.
상기와 같이 대량 배양 배지를 제조한 후 M. hydrothemale KBCBS1021 균주를 접종하여 48시간 동안 배양하여 일반적인 LB broth 배지에서 배양한 결과와 비교하여 표 4에 나타내었다.
균주명 LB( Luria - bertani ) broth 대량배지 ( TM )
M. hydrothemale KBCBS1021 5.3×106 cfu/㎖ 1.6×109 cfu/㎖
표 4와 같이 상기 대량배양용 배지는 LB broth에서 배양한 밀도에 비하여 높은 밀도를 나타내었다.
실시예 4. 항영양인자가 제어된 발효 대두박 의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 3 에서 제조한 대량 배양액을 이용하여 탈피대두박 내에 함유되어 있는 항영양인자 제어를 위해 탈피대두박 800Kg, 탄소원으로 포도당 2%, 질소원으로 효모추출물(Yeast extract) 0.5%, 무기염류로 MgSO4·7H2O 0.02% 및 K2HPO4 0.1%를 첨가하고, 상기 실시예 3에 의한 마이크로박테리움 하이드로더멀 1021(M. hydrothemale KBCBS1021) 대량 배양액 150ℓ를 1 ton짜리 발효기에 넣고 혼합한 다음, 매 시간마다 10분간 혼합하면서 3일간 발효시켰다. 발효 종료 후, 매시간 마다 45분간 혼합하여 3일간 건조시킨 후 항영양인자가 제어된 발효 대두박을 수집하였다. 항영양인자의 제어 능력을 검증하기 위해 배양액 혼합 전 탈피대두박(무처리)을 대조군으로 하고, 대두박 발효 종료 후 시료를 샘플링하여 각 시료별 항영양인자(항트립신, 라피노스, 스타키오스) 분석을 실시해 하기 표 5에 나타내었다.
구분 탈피대두박 M. hydrothemale
KBCBS1021 발효 대두박
항트립신인자(㎎/g) 3.27 0.34
라피노스(%) 0.27 0.02
스타키오스(%) 0.50 0.10
표 5와 같이, M. hydrothemale KBCBS1021 균주를 이용하여 발효한 대두박의 항영양인자 함량은 발효하기 전과 비교하였을 때 현저하게 낮아져, 본 발명에 의한 대두박 발효는 항영양인자 저감 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC18516P 20161122
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Claims (5)

  1. 수탁번호 KCTC18516P로 기탁된 마이크로박테리움 하이드로더멀(Microbacterium hydrothemale) KBCBS1021 균주.
  2. 제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두박 내 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF) 활성 억제용 조성물.
  3. 제 3항에 있어서, 상기 항영양인자는 트립신 저해제(trypsin inhibitor; TI), 라피노스, 스타키오스, 피토헤마글루틴(렉틴), 요소 분해효소, 리폭시제나제(lipoxygenase), 시안화글루코사이드 및 항비타민 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물.
  4. 하기 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조 방법:
    1) 제1항의 균주를 배양하여 배양물을 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 배양물을 탈피 대두박과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 혼합물을 발효하는 단계.
  5. 제 4항의 방법으로 제조된 발효 대두박을 유효성분으로 함유하는 사료용 조성물.
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