CN111801019A - 直接饲喂微生物用于改善鱼的一般状况和健康 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于改善鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的细菌菌株。
Description
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技术领域
本发明涉及一种用于改善鱼例如尼罗罗非鱼(Nile Tilapia fish)的康乐、一般状况、健康和/或产量的细菌菌株。
发明背景
商业捕渔(来自为了商业利润的野生渔业的捕捞鱼和其他海鲜的实践)已经提高了对野生鱼种群可持续性的关注。如此，水产养殖已成为一种大规模商业捕渔的可行的选择。水产养殖、或水产农业是在受控条件下淡水和咸水种群的培养，并且已经发现是有益的，因为它们降低了野生渔业的商业捕鱼的压力，还降低了人体摄入的毒素(例如，重金属例如汞)，这些毒素经常发现于野生捕获的鱼(例如金枪鱼)中。尽管水产农业对野生渔业有积极效果，但是水产养殖行业的挑战仍然存在。具体而言，维持水生动物的健康肠道可以改善水生动物的体重和/或水生动物的产量。整个行业的另一个主要挑战是病原微生物引起的产量损失，这些病原微生物感染水生动物并造成水生动物的死亡或疾病。如此，在水产养殖行业中，使用抗生素治疗被病原微生物感染的水生动物和/或环境仍然是习惯作法。然而，关于抗生素抗性日益增长的关注产生了对用于改善水生动物健康并控制水生动物养殖(水产养殖)行业中的病原菌感染的新解决方案的需求。
发明内容
本发明提供了用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量，改善例如尼罗罗非鱼的重量、尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或尼罗罗非鱼中的免疫应答的细菌菌株。
在实施例中，本发明提供了分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
在另外的实施例中，本发明提供了分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中使用。
在又另外的实施例中，本发明提供了分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
本发明进一步提供了包含分离的枯草芽孢杆菌菌株以及载体的组合物，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRLB-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，其中该组合物是鱼饲料或鱼饲料添加剂。
序列简要说明
SEQ ID NO:1是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ的16SrDNA。
SEQ ID NO:2是菌株NZ86的正向引物。
SEQ ID NO:3是菌株NZ86的反向引物。
SEQ ID NO:4是菌株NZ86的探针。
SEQ ID NO:5是菌株O14VRQ的正向引物。
SEQ ID NO:6是菌株O14VRQ的反向引物。
SEQ ID NO:7是菌株O14VRQ的探针。
SEQ ID NO:8是吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因TNF-α的正向引物。
SEQ ID NO:9是吉富罗非鱼基因TNF-α的反向引物。
SEQ ID NO:10是吉富罗非鱼基因TNF-α的探针。
SEQ ID NO:11是吉富罗非鱼基因IL-1β的正向引物。
SEQ ID NO:12是吉富罗非鱼基因IL-1β的反向引物。
SEQ ID NO:13是吉富罗非鱼基因IL-1β的探针。
SEQ ID NO:14是吉富罗非鱼基因actβ的正向引物。
SEQ ID NO:15是吉富罗非鱼基因actβ的反向引物。
SEQ ID NO:16是吉富罗非鱼基因actβ的探针。
附图说明
图1显示了与未饲喂枯草芽孢杆菌O14VRQ的尼罗罗非鱼对照组的血液中外周血中性粒细胞和溶菌酶的浓度相比，饲喂尼罗罗非鱼该菌株(CTL)后，在该鱼在第28天的外周血中性粒细胞的浓度(上部)和分别在第14天和第51天的血液中溶菌酶的浓度(中部和下部)。
图2显示了补充益生菌持续51天后，来自尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)中肠的促炎细胞因子mRNA的表达。肠中的TNFα(A)和肠中的IL-1β(B)。
定义
通常，本文所用的术语和短语具有其本领域公认的含义，可以通过参考本领域技术人员已知的标准文本，期刊文献和上下文来发现。所提供的以下定义用来明确它们在本披露内容的上下文中的具体用途。
如本文所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。
术语“约”意指与参考总量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相比，总量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相差多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用的，术语“水产养殖(aquaculture/aquaculturing)”，“水产农业(aquafarm和aquafarming)”可以互换使用，并且是指水生或海洋动物例如鱼通常是在人工环境(例如缸(例如，水族缸)、池塘、水池、稻田、湖等)中，或在动物的自然栖息地的封闭或隔开的部分(例如池塘、水池、稻田、湖、河口、海洋、沼泽(例如，潮沼)、泻湖(例如，潮汐泻湖)等)中的养殖、培育、饲养、生产、繁殖和/或收获。
如本文所用的，术语“鱼”是指所有缺少具有指的四肢的有鳃水生脊椎动物。非限制性实例包括，例如，硬骨鱼纲(包括但不限于鲶鱼、罗非鱼、鳟鱼、鲑鱼、鲈鱼(perch)、巴司鱼(bass)金枪鱼、刺鲅、金枪鱼、剑鱼、马林鱼、石斑鱼、鲟鱼、鲷鱼、鳗鱼和玻璃梭鲈)和软骨鱼纲(包括但不限于鲨鱼、鹞鱼和鳐鱼)。在具体的实施例中，该鱼是尼罗罗非鱼。
如本文所用的，术语“尼罗罗非鱼”是指慈鲷科的一种鱼，其为原产于非洲的吉富罗非鱼。该种鱼的其他商业上已知的名称包括五指马鲅(mango fish)、奥尼鱼(nilotica)和boulti。
如本文所用的，术语“提供(supply、supplied、supplying)”，“施用(administer、administered、或administering)”可以互换使用，并且旨在意指使鱼例如尼罗罗非鱼与如本文描述的芽孢杆菌菌株或组合物接触。优选的提供或施用形式是口服施用，例如经由水或经由鱼饲料施用。
如本文所用的，术语“控制(control或controlling)”，如在以下短语：病原微生物的“控制”，或“控制”病原微生物，或如在以下短语：“控制”病原微生物的物种中，是指用于预防病原微生物感染，减少病原微生物数量，杀灭病原微生物或消除如本文所定义的病原微生物的任何手段。事实上，如本文所用的“控制(control或controlling)”是指在预防、杀灭、消除、减少或缓解一种或多种病原细菌方面的任何成功标识。
贯穿本披露内容，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise、comprises、和comprising)”应当理解为意指包括一个所陈述的步骤或要素或多个步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或多个步骤或要素的组。
术语“由……组成”意指包括并限于在短语“由……组成”中间的任何内容。因此，短语“由……组成”是指列出的要素是必需的或强制性的，并且可能不存在其他要素。术语“基本上由……组成”意指包括在该短语之间列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本披露内容中针对所列要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”是指列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的并且可能存在或可能不存在，这取决于它们是否实质上影响列出的要素的活性或作用。
如本文所用的，术语“孢子”和“内生孢子”是可以互换的并且具有本领域的技术人员熟知和理解的其一般含义。如本文所用的，术语孢子是指处于其休眠、受保护状态的微生物。
如本文所用的，术语“分离的”意指本文描述的细菌菌株是处于自然界中不存在的一种形式或环境中，即该细菌菌株至少部分地从与其自然相关的一种或多种或所有天然存在的成分中移出。
如本文所用的，术语“共混物”意指本文描述的一个以上的细菌菌株。
如本文所用的，术语“病原微生物”意指可以对一种或多种鱼的健康、产量、或环境产生负面影响的任何微生物。
如本文所用的，术语“健康”是指生物或它的一个部分的状态或状况。
如本文所用的，术语“有效量”、“有效浓度”、或“有效剂量”被定义为足以改善鱼例如尼罗罗非鱼的健康或产量的一种或多种细菌菌株的量、浓度、或剂量。实际有效剂量的绝对数取决于以下因素，包括：所讨论的鱼的健康状态；目的是预防还是减少病原生物以改善整体健康、肠道健康等；存在的其他成分，并且还有所讨论的表面或水性环境。在实施例中，例如，披露的枯草芽孢杆菌菌株中的一种或多种细菌的有效剂量应在从1 x 102至1 x1012CFU/g组合物的范围内，优选地1 x 104至1 x 109CFU/g组合物，更优选地1 x 105至1 x108CFU/g组合物，并且甚至更优选地1 x 106至5 x 108CFU/g组合物。此外，在实施例中，在细菌菌株或本文所涉及的共混物与所讨论的不希望的一种或多种微生物之间的比率可以在1:100,000和100,000:1之间(菌株/共混物:不希望的微生物)，优选地1:10,000至10,000:1，更优选地1:1,000至1,000:1，更优选地1:100至100:1，甚至更优选地1:10至10:1。细菌菌株的“有效量”、“有效浓度”、或“有效剂量”可以通过本领域熟练的技术人员已知的常规检测来确定。
如本文所用的，术语“鱼饲料”或“鱼饲料成分”是指适用于、或目的在于由鱼例如尼罗罗非鱼摄入的任何化合物、制剂、或混合物。
如本文所用的，术语“一种或多种植物蛋白”是指包括至少一种衍生自或源自植物的蛋白的任何化合物、制品或混合物，该蛋白包括修饰的蛋白和蛋白衍生物。
如本文所用的，术语“小粒”和/或“粒化”是指固体圆形、球形和/或圆柱形片或小粒，以及用于形成此类固体形状的过程，特别是饲料小粒和固体挤出的鱼饲料。如本文所用的，术语“挤出(extrusion或extruding)”是本领域众所周知的术语，并且是指如本文描述的，在压力下使组合物通过一个孔口的过程。
如本文所用的，术语“组合物”是指一种组合物，该组合物包含一种载体和如本文描述的至少一种细菌菌株。可以将本文描述的组合物与一种或多种鱼饲料混合，并且可以将其称为“粉状饲料”。可替代地，该组合物是例如沉降饲料小粒。
具体实施方式
本文描述和披露的是用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量，改善例如尼罗罗非鱼的重量、尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或尼罗罗非鱼中的免疫应答的细菌菌株。
诸位发明人已经发现，当向鱼提供时，本文描述的菌株出人意料地改善了鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量。还出人意料地发现，当向鱼提供时，菌株可以增强鱼例如尼罗罗非鱼中免疫应答的多种组分。在一个实施例中，将如本文披露的菌株向鱼提供例如尼罗罗非鱼，用于减少淋巴细胞、增加循环血液中的中性粒细胞和单核细胞、减少血浆溶菌酶和/或增加若丹明(RHO)-阳性细胞的比例。
本文披露的实施例的目的是本文提供的细菌菌株将改善尼罗罗非鱼的健康和/或尼罗罗非鱼的存活率。本文披露的实施例的另外的目的是，细菌菌株将改善鱼类预防，减少对抗生素的需求，降低生产成本和/或改善鱼类养殖中的环境条件。
在一个实施例中，该细菌菌株通过增强鱼的免疫系统和/或免疫应答来改善鱼的健康。
在一个实施例中，该枯草芽孢杆菌菌株针对病原体例如一种或多种弧菌(Vibrio)菌株和/或发光杆菌(Photobacterium)菌株具有活性。在优选的实施例中，该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌(Vibrio fischeri)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、最小弧菌(Vibrio mimicus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、或其任何组合。在另外的优选的实施例中，该弧菌菌株是副溶血弧菌。
在优选的实施例中，该枯草芽孢杆菌菌株是分离的。在另一个优选的实施例中，该枯草芽孢杆菌菌株是以孢子的形式。
在一个实施例中，用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况或健康的方法，包括以有效量向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用本文披露的细菌菌株。在具体的实施例中，该方法包括使鱼的肠道与本文披露的细菌菌株接触。在甚至更具体的实施例中，该细菌菌株可以控制和/或抑制一种或多种弧菌菌株，例如副溶血弧菌。
在实施例中，本发明涉及用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况或健康的方法，其中该方法包括向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用一种或多种具有保藏登录号NRRLB-67221的分离的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体的步骤。
本发明进一步涉及用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况或健康的方法，该方法包括提供例如施用一种或多种分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株具有与SEQID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
在一个实施例中，用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法，包括以有效量向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用细菌菌株。在具体的实施例中，该方法包括使鱼的肠道与本文披露的细菌菌株接触。在甚至更具体的实施例中，该细菌菌株可以控制和/或抑制淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞、血浆溶菌酶和/或若丹明(RHO)-阳性细胞的比例。
在另外的实施例中，本发明涉及用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法，该方法包括向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用一种或多种具有保藏登录号NRRL B-67221的分离的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体的步骤。
本发明又进一步涉及用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法，该方法包括提供例如施用一种或多种分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
在又另外的实施例中，用于在鱼例如尼罗罗非鱼中获得淋巴细胞的减少、中性粒细胞和单核细胞的增加、血浆溶菌酶的增加、和/或若丹明(RHO)-阳性细胞比例的增加的方法包括以有效量向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用细菌菌株。在具体的实施例中，该方法包括使鱼的肠道与本文披露的细菌菌株接触。在甚至更具体的实施例中，该细菌菌株可以控制和/或抑制病原体，例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株。在优选的实施例中，该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。在另外的优选的实施例中，该弧菌菌株是副溶血弧菌。
在另外的实施例中，本发明涉及用于在鱼例如尼罗罗非鱼中获得淋巴细胞的减少、中性粒细胞和单核细胞的增加和/或血浆溶菌酶的增加的方法，该方法包括向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用一种或多种具有保藏登录号NRRL B-67221的分离的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体的步骤。
本发明进一步涉及用于在鱼例如尼罗罗非鱼中获得淋巴细胞的减少、中性粒细胞和单核细胞的增加和/或血浆溶菌酶的增加的方法，该方法包括提供例如施用一种或多种分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
该方法优选地包括每日提供例如施用至少2天，例如3、4、5、6、7、8、9、10或超过10天(连贯或非连贯天数)。在一个实施例中，每日提供例如施用长达100天，例如长达90天、80天、70天、60天或51天。在一个实施例中，每日提供例如施用1至100天，例如2至80天、10至70天、20至60天、或28至51天。
该方法优选地包括每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的1.5 x 106CFU的根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量。在另一个实施例中，该方法包括每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.9 x 106至6.0 x 106CFU的根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量。在另一个实施例中，该方法包括每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至1.0 x 107CFU的根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量，例如选自下组的剂量，该组由以下组成：每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至0.5 x 106、从0.5 x 106至1.0 x 106、从1.0 x 106至2.0x 106、从2.0 x 106至3.0 x 106、从3.0 x 106至4.0 x 106、从4.0 x 106至5.0 x 106、从5.0 x 106至6.0 x 106、从6.0 x 106至7.0 x 106、从7.0 x 106至8.0 x 106、从8.0 x 106至9.0 x 106、从9.0 x 106至1.0 x 107CFU的根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株、或这些间隔的任何组合。
在另一个优选的实施例中，与对照(不提供例如施用根据本发明的分离的枯草芽孢杆菌菌株)相比，该处理导致尼罗罗非鱼的存活率增加至少20％，例如增加至少30％、例如增加至少40％、例如增加至少50％或例如增加至少60％存活率。
本发明还涉及具有保藏登录号NRRL B-67221的分离的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况或健康的方法中使用。
本发明还涉及分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况或健康的方法中使用。
在又另一个实施例中，用于在该方法中使用的细菌菌株以稳定的孢子形式存在。在本方法的仍另外的实施例中，该稳定的孢子将在鱼的肠道中萌发。
在具体的实施例中，该方法包括向鱼例如尼罗罗非鱼提供例如施用本文描述的细菌菌株，其中该细菌菌株的细菌计数是在1 x 102和1 x 1012CFU/g组合物之间，具体的是在1 x 104和1 x 109CFU/g组合物之间，并且更具体的是在1 x 105和5 x 108CFU/g组合物之间。在更具体的实施例中，本文描述的细菌菌株的细菌计数是在1 x 106和1 x 108CFU/g组合物之间。
在甚至更具体的实施例中，该方法包括使鱼例如尼罗罗非鱼的肠道与具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的一种或多种菌株或其突变体接触的步骤。
在一个实施例中，该方法包括使鱼例如尼罗罗非鱼的肠道与一种或多种本文描述的细菌菌株接触的步骤，其中该细菌菌株改善了鱼的健康。适于测量改善的健康的参数的非限制性实例包括但不限于体重增加、改善的身体状况评分、增加的食物摄入、改善的抗氧化剂状态、氧化应激标志物的减少、最佳的血清蛋白水平、最佳的血清矿物水平、改善的免疫系统功能、改善的肠道菌群健康和多样性、粪便细菌降低等。合适的性能参数的非限制性实例包括体重增加、饲料:增重比率、营养物质消化率、饲料转化率、肉等级、肉产量、肉中蛋白与脂肪的比率、死亡数、死亡率和类似的性能参数。
在具体的实施例中，该方法包括使鱼例如尼罗罗非鱼的肠道与与一种或多种本文描述的细菌菌株接触的步骤，其中该细菌菌株通过增加鱼的重量改善了鱼的健康。在仍另一个实施例中，该细菌菌株通过增强鱼的免疫系统和/或免疫应答来改善鱼的健康。在又另一个实施例中，该细菌菌株通过改善鱼的肠道的整体健康改善鱼的健康。改善肠道健康的非限制性实例包括减少肠道炎症、增加肠绒毛的长度和/或表面面积、增加肠隐窝深度、改善肠道的营养物质吸收、保持和/或改善健康肠道菌群、增强外周血中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞、或其组合。在仍又另一个实施例中，该细菌菌株通过控制病原微生物来改善鱼的健康。在具体的实施例中，该细菌菌株通过控制鱼的肠道中的病原微生物改善了鱼的健康。
在本发明的典型的实施例中，该鱼可以选自由硬骨鱼纲和软骨鱼纲组成的组。在另外的实施例中，该鱼选自下组，该组由以下组成：鲶鱼、罗非鱼、鳟鱼、鲑鱼、鲈鱼(perch)、巴司鱼(bass)、金枪鱼、刺鲅、金枪鱼、剑鱼、马林鱼、石斑鱼、鲟鱼、鲷鱼、鳗鱼、玻璃梭鲈、鲨鱼、鹞鱼和鳐鱼。在合适的实施例中，该鱼是硬骨鱼纲，例如罗非鱼。在具体的实施例中，该鱼是尼罗罗非鱼。
本发明还涉及根据本发明的细菌菌株在水产养殖中的用途。
组合物
在实施例中，用于在本发明方法中使用的组合物包含鱼饲料成分(例如尼罗罗非鱼饲料成分)和根据本发明的细菌菌株。在另一个实施例中，该细菌菌株当在如下情形时是稳定的菌株：该菌株经受具有1巴至35巴压力的挤出过程，该菌株经受挤出过程，其中该挤出过程温度是从80℃至120℃的温度；以及控制一种或多种病原微生物的菌株。
在更具体的实施例中，该细菌菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
在具体的实施例中，该组合物包括具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体；和载体。该载体可以例如是碳酸钙，如本文其他部分提及的其他载体或如现有技术描述的其他载体。
在优选的实施例中，该组合物包含枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列；和载体。
在优选的实施例中，组合物中的分离的枯草芽孢杆菌菌株中的一种或多种是以孢子的形式。
该组合物优选地是鱼饲料或鱼饲料添加剂，例如尼罗罗非鱼饲料或尼罗罗非鱼饲料添加剂。在一个实施例中，该鱼饲料是饲料小粒，例如沉降饲料小粒。在具体的实施例中，将这些饲料小粒用根据本发明所使用的枯草芽孢杆菌菌株表面包衣。在具体的实施例中，该饲料小粒用以孢子的形式的枯草芽孢杆菌菌株表面包衣在标准鱼饲料上。在优选的实施例中，该组合物包含根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株的从104至108CFU/g饲料，例如从105至107CFU/g饲料或例如从5 x 106至9 x 106CFU/g饲料。
在实施例中，本文描述的组合物可以具有任何形式，与形式(例如，营养状态或休眠状态)无关，只要该载体能够支持该细菌菌株，并且该组合物适用于由鱼例如尼罗罗非鱼摄入。在某些实施例中，该组合物可以是以下形式：液体、浆液、固体或粉末(可湿性粉末或干粉末)。在具体的实施例中，本文披露的组合物，无论形式，例如液体、浆液、或粉末(例如，可湿性粉末或干粉末)，适于用作一种鱼饲料中的成分。在更具体的实施例中，本文描述的组合物适于用作一种粒状鱼饲料中的成分。在仍更具体的实施例中，本文描述的组合物适于用作一种经由挤出过程生产的鱼饲料中的成分。
组合物中的一种或多种载体：
本文描述的载体将允许本文描述的细菌菌株保持有效(例如，能够改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康或存活率)，并且一旦被配制就有活力。本文描述的载体的非限制性实例包括液体、浆液、或固体(包括可湿性粉末或干粉末)。
在一个实施例中，该载体是液体载体。作为用于本文披露的组合物的载体有用的液体的非限制性实例包括水、水溶液、或非水溶液。在一个实施例中，该载体是水。在另一个实施例中，该载体是水溶液，例如糖水。在另一个实施例中，该载体是非水溶液。如果使用液体载体，则该液体(例如水)载体可以进一步包括生长培养基，来培养细菌菌株。用于保藏的细菌菌株的适合的生长培养基的非限制性实例包括阿拉伯糖-葡糖酸盐(AG)、酵母浸出物甘露醇(YEM)、G16培养基、或本领域技术人员已知的与该细菌菌株兼容的、和/或为其提供生长营养物质的任何培养基。
在另一个实施例中，该载体是浆液。
在另一个实施例中，该载体是固体。在具体的实施例中，该固体是粉末。在一个实施例中，该粉末是可湿性粉末。在另一个实施例中，该粉末是干粉末。在另一个实施例中，该固体是颗粒。作为用于本文披露的组合物的载体有用的固体的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸氢钠、氯化钠、泥炭、小麦、小麦壳、研磨的麦秸、粗麸、蛭石、纤维素、淀粉、土壤(巴氏消毒的或未巴氏消毒的)、石膏、滑石、粘土(例如，高岭土、膨润土、蒙脱石)、和硅胶。在具体的实施例中，该载体是碳酸钙。在另一个实施例中，该载体是碳酸氢钠。
组合物中的一种或多种细菌菌株：
用于在本发明的方法中使用的组合物包含根据本发明的细菌菌株。在实施例中，当使该细菌菌株经受饲料制造过程时，该菌株是稳定的。在具体的实施例中，当使该细菌菌株经受用于粒化的挤出过程时，该菌株是稳定的。
在一个实施例中，当使该细菌菌株经受在用于粒化的挤出过程期间所达到的压力时，该细菌菌株是稳定的。在具体的实施例中，该细菌菌株在从1巴至40巴范围的压力下是稳定的，具体的是10巴至40巴，更具体的是15巴至40巴，甚至更具体的是20巴至40巴，仍甚至更具体的是35巴至37巴，甚至仍更具体的是36巴。
在一个实施例中，该细菌菌株在高温下是稳定的。具体而言，当使细菌菌株经受在用于粒化的挤出过程期间所达到的温度时，该细菌菌株是稳定的。在甚至更具体的实施例中，该细菌菌株在约80℃的温度格式下是稳定的。
在另外的具体的实施例中，该一种或多种细菌菌株的挤出稳定性是由在100℃或110℃下的挤出确定的，在100℃下展现出50％或更高存活率，或在110℃下展现出25％或更高存活率。
在甚至更具体的实施例中，当该细菌菌株经受一个挤出过程时，其中该挤出机具有0.5mm至5.0mm的口模直径，该细菌菌株是稳定的。
在另一个实施例中，该细菌菌株控制一种或多种病原微生物。
在仍另一个实施例中，该细菌菌株当在如下情形时是稳定的菌株：该菌株经受具有1巴至40巴压力的挤出过程，该菌株经受挤出过程，其中该挤出过程温度是从80℃至120℃的温度；以及控制一种或多种病原微生物的菌株。
在具体的实施例中，该细菌菌株将以在1 x 102和1 x 1012CFU/g组合物之间的量存在，具体的是以在1 x 104和1 x 109CFU/g组合物之间的量存在，并且更具体的是以在1 x105和5 x 108CFU/g组合物之间的量存在。在更具体的实施例中，该细菌菌株将以在1 x 106和1 x 108CFU/g组合物之间的量存在。
该细菌菌株的发酵可以使用常规的发酵过程在实验室或工业发酵罐中进行，这些常规的发酵过程例如，需氧液体培养技术、摇瓶培养、以及小规模或大规模发酵(例如，连续、分批、分批补料、固态发酵等)，并且此类过程是本领域中熟知的。尽管有用于生产该细菌菌株的生产过程，可以直接使用来自培养基的细菌菌株，或使其经受纯化和/或进一步加工步骤(例如，干燥过程)。
在发酵之后，该细菌菌株可以使用常规技术(例如，通过过滤、离心等)回收。可替代地，该细菌菌株可以被干燥(例如，空气干燥、冷冻干燥、或喷雾干燥至低水分水平，并且储存在合适的温度例如室温下)。
在实施例中，本文披露的一种或多种细菌是稳定的，并且在使用时保留足够有效量的活性。用于生产稳定的微生物的方法在本领域中是已知的。在一个实施例中，本文披露的一种或多种细菌菌株是以一种稳定孢子的形式存在于该组合物中。
组合物中的任选成分；
用于在本发明的方法中使用的组合物可以进一步包含一种或多种可任选的成分，该一种或多种可任选的成分适用于鱼例如尼罗罗非鱼消耗。非限制性可任选成分包括酶。此类成分是本领域的普通技术人员已知的。
酶
进一步考虑到用于在本发明的方法中使用的组合物任选地包括如本文描述的一种或多种酶。在具体的实施例中，该一种或多种酶可以是适合给予鱼的任何酶或不同酶的组合，意味着以一种或另一种方式食用该酶在营养上对鱼有益。因此，当提及“酶”时，这通常将被理解为包括一种或多种饲料酶。在具体的实施例中，不应解释为包括具有医学意义上地治疗功能的酶。
这些饲料酶应当是饲料/食品级的，因此，意味着它们对鱼例如尼罗罗非鱼是无害的，并且饲料/食品级意味着应当遵守针对食品级酶所推荐的纯度规格。在具体的实施例中，这意味着该酶遵守针对食品级酶所推荐的纯度规格，该纯度规格由食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)(JECFA)和食品化学法典(Food Chemical Codex)(FCC)给出。
在具体的实施例中，该酶包含少于30大肠菌群/克，并且包含少于50,000/g的活菌计数。
在另一个实施例中，本文描述的组合物任选地包括一种或多种酶。可以根据handbook Enzyme Nomenclature[酶命名手册](来自NC-IUBMB,1992)对酶进行分类，还参见因特网上的ENZYME网站：expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为该酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch.2000,The ENZYME database[酶数据库],Nucleic Acids Res.[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，并且有时基于它们的分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。
Henrissat等人，2014在“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)in2013[2013年的碳水化合物活性酶数据库](CAZy)”,Nucl.Acids Res.[核酸研究](D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见cazy.org。
因此，本发明的组合物还可包含至少一种选自下组的其他酶，该组由以下组成：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)、或其任何混合物。
在具体的实施例中，本发明的组合物包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。可商购的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM植酸酶(诺维信公司(Novozymes))、
P、
NP和
HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、NatuphosTM(巴斯夫公司(BASF))、
和
Blue(AB酶公司(ABEnzymes))、
(浩卫制药公司(Huvepharma))、
XP(范恩尼姆/杜邦公司(Verenium/DuPont))和
PHY(杜邦公司(DuPont))。其他优选的植酸酶包括描述于例如WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。
在具体的实施例中，本发明的组合物包含木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。可商购的木聚糖酶的实例包括
WX和
G2(帝斯曼营养产品公司(DSMNutritional Products))、
XT和Barley(AB维斯塔公司(AB Vista))、
(范恩尼姆公司(Verenium))、
X(浩卫制药公司(Huvepharma))和
XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司(DuPont))。
在具体的实施例中，本发明的组合物包含蛋白酶(EC 3.4)。可商购的蛋白酶的实例包括
ProAct(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))。
鱼饲料
在某些实施例中，在本发明方法中使用的组合物适合用于一种或多种鱼饲料例如一种或多种尼罗罗非鱼饲料中。本文描述的组合物的特征允许将其用作一种适合加入鱼饲料中的组分。在具体的实施例中，将本文描述的组合物与一种鱼饲料成分和/或一种或多种鱼饲料混合，并且将其称为粉状饲料。在某些实施例中，随后将该粉状饲料进行粒化。
该鱼饲料可以包含适于鱼例如尼罗罗非鱼摄入的任何成分，例如包含蛋白、脂质、碳水化合物、盐、矿物质和维生素的来源。可以选择这些鱼饲料成分，并且以任何比例混合，适合满足用饲料喂养的鱼的营养需要，和/或以保持饲料的原料成本在所希望的范围内，和/或以获得饲料的其他所希望的性质。鱼饲料成分的非限制性实例可包括以下材料的一种或多种：植物衍生的产品，例如种子、谷物、叶、根、块茎、花、豆荚、果壳、油、大豆粉、大豆蛋白分离物、马铃薯蛋白粉、小麦、大麦、玉米、大豆油和玉米面筋粉；动物衍生的产品，例如鱼粉、鱼油、奶粉、脱脂奶粉、骨提取物、肉提取物、血液提取物等；添加剂，例如矿物质、维生素、芳香化合物和饲料增强酶。
在特定的实施例中，该鱼饲料可包含0-80％的玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。
该鱼饲料可以包含植物蛋白。在具体的实施例中，这些植物蛋白的蛋白含量是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(w/w)。植物蛋白可以衍生自植物蛋白来源，例如豆类和谷类，例如来自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，例如大豆粉、羽扇豆粉、油菜籽粉及其组合。
在具体的实施例中，该植物蛋白来源是来自豆科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。在另一个具体的实施例中，植物蛋白来源是来自藜科的一种或多种植物(例如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜)的材料。植物蛋白来源的其他实例是油菜和卷心菜。在另一个具体的实施例中，大豆是优选的植物蛋白来源。植物蛋白来源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。
在另一个实施例中，该鱼饲料可以任选地包含一种或多种适合的鱼饲料添加剂。适合的鱼饲料添加剂的非限制性实例包括酶抑制剂、脂-溶性维生素、水溶性维生素、痕量矿物质、巨量矿物质、及其组合。
在另一个实施例中，该鱼饲料可以进一步任选地包含一种或多种饲料添加剂成分。饲料添加剂成分的非限制性实例包括着色剂、芳香化合物、稳定剂、抗微生物肽(抗微生物肽(AMP)的非限制性实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、定点诱变抗菌肽(Protegrin)-1、死亡肽(Thanstin)、防卫肽(Defensin)、Ovispirin例如Novispirin(罗伯特莱勒(Robert Lehrer)，2000)、及其变体或片段(它们保有抗微生物活性))、抗真菌多肽(AFP)(非限制性实例包括巨大曲霉和黑曲霉肽、连同其变体和片段(它们保有抗真菌活性)，如在WO 94/01459和PCT/DK 02/00289中披露的)、和/或至少一种其他酶，该酶选自植酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4。
在仍另一个实施例中，该鱼饲料仍可以进一步可任选地包括一种或多种脂溶性维生素或水溶性维生素、痕量矿物质和巨量矿物质。通常，脂-溶性维生素和水-溶性维生素、以及痕量矿物质形成了所谓的旨在添加到饲料中的预混物的部分，而巨量矿物质通常被分开地添加到饲料中。
脂-溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。
水-溶性维生素的非限制性实例包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。
痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒、锌等。
巨量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、钾、钠等。
制造工艺
在一个实施例中，本文描述的方法包括向鱼例如尼罗罗非鱼施用本文描述的组合物，和/或使鱼例如尼罗罗非鱼的肠道与本文描述的组合物接触。在具体的实施例中，该组合物是如本文描述的鱼饲料(即，粉状饲料)中的成分。
在具体的实施例中，将根据本发明的细菌孢子共混到碳酸钙载体(例如#1491Vicron 45-3FG)中以形成来自初始喷雾干燥的孢子浓缩物(通常为5-9 x 109至5-9x1011CFU/g，例如像，CFU/g 5-9 x 1010CFU/g)的产物(目标优选地为1 x 108CFU/g至1 x1010CFU/g，例如像，1 x 109CFU/g)。该配制品通常在RT(23℃)下在干燥条件下稳定至少2年。使用时，该产物通常以1:5g/g至1:20g/g，例如1:10g/g悬浮于，例如水或植物油中，以提供例如1 x 108CFU/ml的悬浮液。优选地将该材料均匀地喷雾在预形成的饲料小粒上，例如以5％至20％v/g的速率，例如10％v/g的速率，并在例如21℃-30℃下干燥过夜。在小粒上的根据本发明的孢子的所得可回收水平优选地为6-8 x 105CFU/g饲料至6-8 x 108CFU/g饲料，例如像约6-8 x 106CFU/g饲料。在具体的实施例中，饲料小粒上的细菌浓度为从1 x105CFU/g饲料至8 x 108CFU/g饲料、例如从1 x 105CFU/g饲料至8 x 105CFU/g饲料、例如从8 x 105CFU/g饲料至1 x 106CFU/g饲料、例如从1 x 106CFU/g饲料至1 x 107CFU/g饲料、例如从1 x 107CFU/g饲料至1 x 108CFU/g饲料、或这些间隔的任何组合。
在甚至更具体的实施例中，该饲料粉是粒状的。粒化过程是本领域中己知的。在具体的实施例中，这些小粒通过粒化过程进行制造。在另一个实施例中，这些小粒通过挤出过程进行制造。
在实施例中，该进料混合物(粉状饲料)可以通过将包含该细菌菌株的组合物与所希望的饲料组分混合来制备。在具体的实施例中，该粉状饲料可以是经调节的或未经调节的。
在一个实施例中，该粉状饲料在粒化过程之前是经调节的。在具体的实施例中，该粉状饲料被引导至一个调节器，例如，具有蒸汽注入的级联混合器中。该饲料在调节器中通过注入蒸汽被加热至在调节器出口所测量的指定的温度，例如像60℃-120℃，例如，60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、105℃、110℃、115℃、或120℃。停留时间可以从几秒到几分钟，并且甚至是几小时来变化。例如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4,小时、5小时、6小时、7小时、8,小时、9,小时、10小时、11小时、12小时、和长达24小时以及更久。在具体的实施例中，在蒸汽处理期间的过程温度是至少60℃。在更具体的实施例中，在蒸汽处理期间的过程温度是至少70℃。在甚至更具体的实施例中，在蒸汽处理期间的过程温度是至少80℃。在最具体的实施例中，在蒸汽处理期间的过程温度是至少90℃。
在另一个实施例中，该粒化过程是挤出过程。用于制造饲料小粒的典型挤出过程是本领域技术人员所已知的。挤出或粒化产品，其中将该饲料混合物(粉状饲料)压制成小粒或在压力下通过一个小的开口挤出，并且切成颗粒，这些颗粒随后进行干燥。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为制成挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口的允许压力降。此外，当使用小的开口时，非常高的挤出压力增加了粉状饲料的热发生。(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；SurfactantScience Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；马塞尔德克尔出版社(Marcel Dekker))。
在具体的实施例中，将该粉状饲料引入挤出机以形成来自挤出物的可变长度的小粒。该挤出设备可以是本领域已知的任何螺旋式挤出机。在具体的实施例中，该挤出机是一种双螺旋挤出机，例如Werner&Pfleiderer型连续37”挤出机。挤出参数(例如，容量、螺杆转速、口模直径、干燥温度、干燥时间等)取决于具体挤出过程和/或所用的挤出设备。
在实施例中，该挤出机的螺杆转速是1-1,000RPM。在更具体的实施例中，该挤出机的螺杆转速是100RPM。在甚至更具体的实施例中，该挤出机的螺杆转速是150RPM。在又甚至更具体的实施例中，该挤出机的螺杆转速是200RPM。在仍甚至更具体的实施例中，该挤出机的螺杆转速是250RPM。在仍又甚至更具体的实施例中，该挤出机的螺杆转速是300RPM。
在实施例中，该口模直径是0.5mm-5.0mm。在更具体的实施例中，该口模直径是0.5mm。在甚至更具体的实施例中，该口模直径是1.0mm。在又甚至更具体的实施例中，该口模直径是1.5mm。在最具体的实施例中，该口模直径是2.0mm。
放置该小粒然后干燥一段指定的时间，例如，至少15分钟、优选地20分钟，在60℃-100℃的温度下，优选地90℃-100℃、更优选地90℃、甚至更优选地95℃、甚至仍更优选地100℃。
优选的方面
下文给出了本发明的一组优选的方面。
1.一种分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
2.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中使用。
3.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
4.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，用于在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中使用。
5.根据方面1至4中任一项所使用的分离的枯草芽孢杆菌菌株，其针对病原体例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株具有活性。
6.根据方面5所使用的分离的枯草芽孢杆菌菌株，其中该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。
7.根据方面6所使用的分离的枯草芽孢杆菌菌株，其中该弧菌菌株是副溶血弧菌。
8.根据方面1至7中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次向所述鱼提供。
9.根据方面1至8中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少6次、至少8次、至少10次、至少15次或至少20次向所述鱼提供。
10.根据方面1至9中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼类养殖相比，当将该枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致改善的鱼类预防，减少了对抗生素的需求，降低了生产成本和/或改善了鱼类养殖中的环境条件。
11.根据方面1至10中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼相比，当将该枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致在所述鱼中淋巴细胞的减少，循环血液中的中性粒细胞和单核细胞的增加和/或血浆溶菌酶的增加。
12.根据方面1至11中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中该枯草芽孢杆菌菌株在104小时后导致至少15％的鱼存活率，例如在104小时后至少20％、至少25％或至少30％的鱼存活率。
13.根据方面1至12中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用至少2天，例如3、4、5、6、7、8、9、10或超过10天。
14.根据方面1至12中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用长达100天，例如长达90天、80天、70天、60天或51天。
15.根据方面1至12中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用至少1至100天，例如2至80天、10至70天、20至60天、或28至51天。
16.根据方面1至15中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.9 x 106至6.0 x 106CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
17.根据方面1至15中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
18.根据方面1至15中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至0.5 x 106、从0.5 x 106至1.0 x 106、从1.0 x 106至2.0 x 106、从2.0 x 106至3.0 x 106、从3.0 x 106至4.0 x 106、从4.0 x106至5.0 x 106、从5.0 x 106至6.0 x 106、从6.0 x 106至7.0 x 106、从7.0 x 106至8.0 x106、从8.0 x 106至9.0 x 106、或从9.0 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株提供例如施用。
19.根据方面1至18中任一项所使用的枯草芽孢杆菌菌株，其中与对照组的鱼相比，该使用导致该鱼的存活率提高至少10％，例如至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、或例如至少70％的更高的存活率，其中该对照组不接受所述分离的枯草芽孢杆菌菌株或包含所述分离的枯草芽孢杆菌菌株的组合物。
20.枯草芽孢杆菌菌株在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中的用途，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有该枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
21.分离的枯草芽孢杆菌菌株在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中的用途，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
22.分离的枯草芽孢杆菌菌株在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中的用途，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
23.分离的枯草芽孢杆菌菌株在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中的用途，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
24.根据方面20至23中任一项所述的用途，其中该枯草芽孢杆菌菌株针对病原体例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株具有活性。
25.根据方面24所述的用途，其中该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。
26.根据方面25所述的用途，其中该弧菌菌株是副溶血弧菌。
27.根据方面20至26中任一项所述的用途，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次向所述鱼提供。
28.根据方面20至26中任一项所述的用途，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少6次、至少8次、至少10次、至少15次或至少20次向所述鱼提供。
29.根据方面20至28中任一项所述的用途，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼类养殖相比，当将该枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致改善的鱼类预防，减少了对抗生素的需求，降低了生产成本和/或改善了鱼类养殖中的环境条件。
30.根据方面20至29中任一项所述的用途，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼相比，当将枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致在所述鱼中淋巴细胞的减少，循环血液中的中性粒细胞和单核细胞的增加和/或血浆溶菌酶的增加。
31.根据方面20至30中任一项所述的用途，其中该枯草芽孢杆菌菌株在104小时后导致至少15％的鱼存活率，例如在104小时后至少20％、至少25％或至少30％的鱼存活率。
32.根据方面20至31中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用至少2天，例如3、4、5、6、7、8、9、10或超过10天。
33.根据方面20至31中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用长达100天，例如长达90天、80天、70天、60天或51天。
34.根据方面20至31中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用至少1至100天，例如2至80天、10至70天、20至60天、或28至51天。
35.根据方面20至34中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.9 x 106至6.0 x 106CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
36.根据方面20至34中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
37.根据方面20至34中任一项所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至0.5 x 106、从0.5 x 106至1.0 x 106、从1.0 x 106至2.0 x 106、从2.0 x 106至3.0 x 106、从3.0 x 106至4.0 x 106、从4.0 x 106至5.0 x 106、从5.0 x 106至6.0 x 106、从6.0 x 106至7.0 x 106、从7.0 x 106至8.0 x 106、从8.0 x106至9.0 x 106、或从9.0 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株提供例如施用。
38.根据方面20至37中任一项所述的用途，其中与对照组的鱼相比，该使用导致该鱼的存活率提高至少10％，例如至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、或例如至少70％的更高的存活率，其中该对照组不接受所述分离的枯草芽孢杆菌菌株或包含所述分离的枯草芽孢杆菌菌株的组合物。
39.一种用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法，该方法包括向所述鱼提供例如施用分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
40.一种用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法，该方法包括向所述鱼提供例如施用分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株是用于在方法中使用的具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
41.一种用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法，该方法包括向所述鱼提供例如施用分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株具有与SEQ IDNO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
42.一种用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法，该方法包括向所述鱼提供例如施用分离的枯草芽孢杆菌菌株的步骤，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
43.根据方面39至42中任一项所述的方法，其中该枯草芽孢杆菌菌株针对病原体例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株具有活性。
44.根据方面43所述的方法，其中该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。
45.根据方面44所述的方法，其中该弧菌菌株是副溶血弧菌。
46.根据方面39至45中任一项所述的方法，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次向所述鱼提供。
47.根据方面39至45中任一项所述的方法，其中将该枯草芽孢杆菌菌株至少6次、至少8次、至少10次、至少15次或至少20次向所述鱼提供。
48.根据方面39至47中任一项所述的方法，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼类养殖相比，当将该枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致改善的鱼类预防，减少了对抗生素的需求，降低了生产成本和/或改善了鱼类养殖中的环境条件。
49.根据方面39至48中任一项所述的方法，其中与没有接受所述枯草芽孢杆菌菌株的鱼相比，当将枯草芽孢杆菌菌株向鱼类养殖提供时，导致在所述鱼中淋巴细胞的减少，循环血液中的中性粒细胞和单核细胞的增加和/或血浆溶菌酶的增加。
50.根据方面39至49中任一项所述的方法，其中该枯草芽孢杆菌菌株在104小时后导致至少15％的鱼存活率，例如在104小时后至少20％、至少25％或至少30％的鱼存活率。
51.根据方面39至50中任一项所述的方法，其中该提供例如施用包括每日提供例如施用至少2天，例如3、4、5、6、7、8、9、10或超过10天。
52.根据方面39至50中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用长达100天，例如长达90天、80天、70天、60天或51天。
53.根据方面39至50中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌菌株每日提供例如施用至少1至100天，例如2至80天、10至70天、20至60天、或28至51天。
54.根据方面39至53中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.9 x 106至6.0 x 106CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
55.根据方面39至53中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株的每日剂量提供例如施用。
56.根据方面39至53中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌菌株以每条鱼例如每条尼罗罗非鱼的从0.1 x 106至0.5 x 106、从0.5 x 106至1.0 x 106、从1.0 x 106至2.0 x 106、从2.0 x 106至3.0 x 106、从3.0 x 106至4.0 x 106、从4.0 x 106至5.0 x 106、从5.0 x 106至6.0 x 106、从6.0 x 106至7.0 x 106、从7.0 x 106至8.0 x 106、从8.0 x106至9.0 x 106、或从9.0 x 106至1.0 x 107CFU的该枯草芽孢杆菌菌株提供例如施用。
57.根据方面39至56中任一项所述的方法，其中与对照组的鱼相比，该处理导致虾的存活率提高至少10％，例如至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、或例如至少70％的更高的存活率，其中该对照组不接受所述分离的枯草芽孢杆菌菌株或包含所述分离的枯草芽孢杆菌菌株的组合物。
58.一种包含分离的枯草芽孢杆菌菌株以及载体的组合物，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，其中该组合物是鱼饲料或鱼饲料添加剂。
59.一种包含分离的枯草芽孢杆菌菌株以及载体的组合物，该菌株具有与SEQ IDNO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，其中该组合物是鱼饲料或鱼饲料添加剂。
60.根据方面58或59所述的组合物，其中该枯草芽孢杆菌菌株针对病原体例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株具有活性。
61.根据方面60所述的组合物，其中该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。
62.根据方面61所述的组合物，其中该弧菌菌株是副溶血弧菌。
63.根据方面58或62所述的组合物，其中该分离的枯草芽孢杆菌菌株是以孢子的形式。
64.根据方面58至63中任一项所述的组合物，其中该载体选自下组，该组由以下组成：液体、浆液和/或固体。
65.根据方面58至64中任一项所述的组合物，其中该载体是选自下组的液体载体，该组由以下组成：水、水溶液和非水溶液。
66.根据方面58至65中任一项所述的组合物，其中该载体是选自下组的固体，该组由以下组成：粉末、可湿性粉末、干粉末、颗粒、碳酸钙、碳酸氢钠、氯化钠、泥炭、小麦、小麦壳、研磨的麦秸、粗麸、蛭石、纤维素、淀粉、土壤(巴氏消毒的或未巴氏消毒的)、石膏、滑石、粘土(例如，高岭土、膨润土、蒙脱石)、和硅胶。
67.根据方面58至66中任一项所述的组合物，其中该组合物是尼罗罗非鱼饲料或尼罗罗非鱼饲料添加剂。
68.根据方面58至67中任一项所述的组合物，其中该鱼饲料是鱼饲料小粒，例如沉降饲料小粒或挤出的小粒，例如浮性小粒。
69.根据方面58至68中任一项所述的组合物，其中将这些鱼饲料小粒用该枯草芽孢杆菌菌株表面包衣。
70.根据方面58至69中任一项所述的组合物，其中将这些鱼饲料小粒用以孢子的形式的枯草芽孢杆菌菌株表面包衣在标准鱼饲料上。
71.根据方面58至70中任一项所述的组合物，其中该组合物包含该枯草芽孢杆菌菌株的从104至108CFU/g饲料，例如从105至107CFU/g饲料或例如从5 x 106至9 x 106CFU/g饲料。
实例
实例1
生物材料保藏
已经依据布达佩斯条约的条款，在农业研究服务专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL))，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，1815号，大学街，皮奥瑞亚(Peoria)，伊利诺伊州，61604，美国，保藏了以下生物材料，并且给出以下登录号：
| 保藏物 | 登录号 | 保藏日期 |
| 枯草芽孢杆菌O14VRQ | NRRL B-67221 | 2016年1月8日 |
| 枯草芽孢杆菌NZ86 | NRRL B-50136 | 2008年5月30日 |
枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ于2006年5月5日由来自诺维信北美公司(NovozymesNorth America,Inc.)的Michael Frodyma从弗吉尼亚州，美国的土壤样品中分离出来。
该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，通过该外国专利法律确定的授权的人能够获得该培养物。这些保藏物代表所保藏菌株的基本上纯的培养物。需要按一些国家的国外专利法要求提供保藏物，在这些国家提交该主题申请的副本，或其后续文本。然而应理解，保藏物的可用性不构成将本发明主题用于由政府行为批准的专利权的实践的许可。
实例2
罗非鱼肠道中DFM菌株的qPCR定量
罗非鱼肠中的枯草芽孢杆菌定量
通过标准的DNA提取程序(例如，凯杰公司(Qiagen)PowerLyzer/PowerSoil DNA提取试剂盒)进行DNA提取和定量。定量在补充任何一种芽孢杆菌菌株之前和之后在整个罗非鱼肠中总枯草芽孢杆菌菌株NZ86和O14VRQ的存在的RT-qPCR分析示出于表1和表2。
表1.用于RT-qPCR分析的针对枯草芽孢杆菌的菌株NZ86和O14VRQ具有特异性的定制引物和探针。
表2 RT-qPCR分析后尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)肠中的总枯草芽孢杆菌菌株的细菌定量。值是平均值±标准偏差。
ND，未检测到
实例3
枯草芽孢杆菌O14VRQ对尼罗罗非鱼血液中免疫防御机制的增强
三个缸/处理，其中每个80加仑缸中有20条尼罗罗非鱼，分别用于比较14天和28天后的外周血白细胞水平。所有尼罗罗非鱼都饲喂标准量的商业鱼饲料小粒，这些商业鱼饲料小粒在饲喂前24小时已通过直接在饲料小粒上表面喷雾用枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221(O14VRQ)或NRRL B-50136处理，或者这些尼罗罗非鱼已经饲喂未经处理的标准量的商业鱼饲料小粒。具体地，制备处理细菌的水中孢子悬浮液，优选浓度为1.0x 107CFU/g-饲料。将悬浮液以1.0ml孢子悬浮液的优选速率均匀地喷雾到干饲料小粒(沉降)上，至10.0g的饲料小粒，并允许其在23℃下干燥过夜。小粒上的所得的可回收细菌浓度为0.9-1.2 x107CFU/g-饲料CFU/g-饲料。将处理的小粒以3％(w/w)的尼罗罗非鱼体重/天的速率添加到每个指定的缸中。对于本研究中的所有鱼，目标接种为平均4.8g-饲料/鱼/天，或4.8 x107CFU/鱼/天。在测试开始时(时间0小时)，所有鱼(100％)健康且大小相似。
在第14天和第28天，测量尼罗罗非鱼的外周血白细胞水平。
表3 显示了与对照相比在第14天和第28天用枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221(O14VRQ)或NRRL B-50136(NZ86)饲喂的尼罗罗非鱼的外周血白细胞水平的百分比。
表示为平均值的值
同一行中的abc上标字母是指Tukey的HSD测试后，各组之间存在显著差异(P<0.05)。
与枯草芽孢杆菌NRRL B-50136和对照相比，在第14天通过饲喂枯草芽孢杆菌O14VRQ可以显著增加外周血中性粒细胞的百分比，并且在第28天时甚至可以更显著。此外，到第28天，O14VRQ也显著增强了单核细胞。
实例4
饲喂枯草芽孢杆菌O14VRQ后，肾脏和脾脏中免疫防御机制的增强。
根据实例2处理尼罗罗非鱼。测量经处理的尼罗罗非鱼的肾脏和脾脏血白细胞分布，作为免疫防御机制的量度。
表4 显示了在不同枯草芽孢杆菌益生菌饮食下尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)的肾脏和脾脏血白细胞分布。n＝9/组。
表示为平均值的值
同一行中的ab上标字母是指Tukey的HSD测试后，各组之间存在显著差异(P<0.05)。
在补充益生菌枯草芽孢杆菌O14VRQ后，在尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)中观察到若丹明(RHO)-阳性细胞比例的增加，以及PMA(佛波酯)刺激的头肾和脾脏白细胞(分别为HKL和SL)的中值荧光强度(MFI)的增加(n＝9)。这证明与枯草芽孢杆菌菌株NZ86(NRRL B-50136)和对照相比，枯草芽孢杆菌O14VRQ具有显著提高RHO-阳性细胞百分比的能力。
实例5
用枯草芽孢杆菌O14VRQ饲喂后血液中中性粒细胞和溶菌酶含量的增加。
根据实例3处理尼罗罗非鱼，并在第28天测量罗非鱼血细胞中中性粒细胞水平的比例。分别在第14天和第51天测量溶菌酶水平的比例。
图1说明了相对于未经处理的尼罗罗非鱼(对照)中相同水平，罗非鱼血细胞中中性粒细胞和溶菌酶水平的比例。
结果显示，在饲喂枯草芽孢杆菌O14VRQ后的第28天(中性粒细胞)以及第14天和第51天(溶菌酶)，罗非鱼血细胞中的中性粒细胞和溶菌酶水平的比例显著增加。
实例6
尼罗罗非鱼中肠的促炎细胞因子mRNA的表达
用枯草芽孢杆菌O14VRQ饲喂尼罗罗非鱼51天，此时使用特异于这些细胞因子的引物和探针通过RT-qPCR定量评估促炎细胞因子IL-1B、TNFa和actB的mRNA表达，如表5中所示。
表5.用于RT-qPCR分析的针对吉富罗非鱼基因具有特异性的引物和探针
RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR
在第51天尸检时从罗非鱼(n＝9)取出大约50mg的中肠，并置于1mL RNA later(西格玛公司(Sigma))中，并储存在-20℃。将样品从RNA later中取出，切成小块，并置于RLT缓冲液(凯杰公司(Qiagen)，日耳曼敦，马里兰州，美国)中用于RNA提取。使用Omni TH均化器(Omni国际，肯内索，乔治亚州，美国)以中等速度均质化组织1分钟。通过使裂解物通过附接至无菌3mL注射器的23G针头，使所得悬浮液进一步破碎。遵循制造商的说明书，使用RNeasy微试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从不同组织中提取总RNA。在提取过程期间，对样品进行DNA酶(NEB，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)处理，以消除柱上的基因组DNA。将总RNA浓度通过使用NanoDrop分光光度计(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量。仅将260/280比率大于1.9的RNA用于cDNA合成。RNA样品储存在-8℃。遵循制造商的说明书，使用高容量反转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))从mRNA(1μg)合成互补DNA。用无核酸酶的水(GE医疗集团(GE Healthcare)，芝加哥，伊利诺伊州，美国)将样品稀释至5ng/μL，并储存在-20℃。
NCBI引物-BLAST工具用于设计白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和β-肌动蛋白(actβ)的引物和探针，其序列跨越外显子-外显子区域(表5)。基因表达分析在10μL的总样品体积中通过RT-qPCR进行，该体积含有300nM正向和反向引物(整合DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies)，科尔维尔，爱荷华州)两者、150nM 6-羧基荧光素(FAM)探针(整合DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies))和2x Primetime基因表达预混液和12.5ng的cDNA。所有样品均在CFX连接实时系统(伯乐实验室(Bio-RadLaboratories)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)上以一式三份运行。将样品加热一次至95℃下持续3分钟，并且然后38个循环，在95℃下持续15秒，并且在55℃下持续1分钟。通过热循环仪自动确定所得的定量循环(Cq)值。每个引物对和探针组合均不包括模板对照(NTC)样品，以排除DNA污染。在非处理对照饮食中，使用actβ的参考基因将免疫基因的表达归一化。
图2显示了补充益生菌持续51天后，来自尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)中肠的促炎细胞因子TNFα和IL-1β的表达。本工作显示罗非鱼肠道的功能在施用枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ和NZ86后受到免疫影响。这种补充导致促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的水平升高，其中饮食O14VRQ的升高作用显著(p<0.05)。这些细胞因子是在肠道侵袭或定植事件期间促进炎症应答的生物标志物。对罗非鱼膳食补充菌株O14VRQ导致较低的瞬态益生菌计数。因此似乎罗非鱼肠道在该枯草芽孢杆菌益生菌菌株的基因表达水平上更敏感。如在罗非鱼中使用乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的另一项研究中所证明的，膳食补充益生菌可导致肠道中免疫基因表达水平增加。两种细胞因子的丰度将导致更多的淋巴样细胞募集至定植/侵袭位点。这些细胞因子水平的增加与炎症应答的上调有关，其中吞噬细胞被募集到肠道。这项研究的显微镜工作证明，在补充O14VRQ后上皮内淋巴细胞(IEL)略有增加(数据未示出)。所有这些都暗示着，相对于菌株NZ86，枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ似乎导致在肠道水平上具有更高的免疫准备状态，这可能有益于抵抗病原侵害。
实例7
总结DFM细菌增强
表6中提供了由一种或两种测试的DFM(直接饲喂微生物)细菌提供的免疫增强的汇编。两种测试的菌株均能够显著增强特定的免疫参数，尽管有时会有所不同。
表6.来自用枯草芽孢杆菌内生孢子补充尼罗罗非鱼(吉富罗非鱼)持续51天的观察到的免疫结果的总结
*表示统计学显著(p<0.05)
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 直接饲喂微生物用于改善鱼的一般状况和健康
<130> 14577-WO-PCT
<160> 16
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1259
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 60
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 120
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagta 180
ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 240
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg 300
ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 360
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 420
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 480
gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 540
gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 600
ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 660
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 720
tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 780
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 840
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgatgctaca 960
atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1020
agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1080
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1140
gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg aaggtgggac 1200
agatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg aaggtgcggc tggatcacc 1259
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctgttctcat gaactggggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gctaactctg caggtacccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 4
aaggtcgaag ttgaggcaaa 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cccttgggta atgctatgta aagg 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gatggctttc cacagcgatg g 21
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 7
caaccccact agaccctcaa taaagc 26
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
atagcttctc agaccacggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcaaacacgc caaagaaggt 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 10
cacgctgtgg acggaaacca ac 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ggcatcaaag gcacaaacct c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
ggtgtcgcgt ttgtagaaga g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 13
caagccaacc ctccacctgg ag 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ctccatcgtc caccgcaaa 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ctgcgcctga gttgtgtatg 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 16
caaacgccca acaacttcag ctct 24
PCT/RO/134表
Claims (13)
1.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
2.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，用于在用于增加尼罗罗非鱼的重量、改善尼罗罗非鱼的整体肠道健康、和/或改善鱼例如尼罗罗非鱼的免疫应答的方法中使用。
3.一种分离的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，用于在用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的方法中使用。
4.如权利要求1至3中任一项所述的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株针对病原体例如一种或多种弧菌菌株和/或发光杆菌菌株具有活性。
5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌菌株，其中该弧菌菌株选自下组，该组由以下组成：费氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、或其任何组合。
6.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌株，其中该弧菌菌株是副溶血弧菌。
7.如权利要求1至6中任一项所述的枯草芽孢杆菌菌株，其中该枯草芽孢杆菌菌株在104小时后导致至少15％的鱼存活率，例如在104小时后至少20％、至少25％或至少30％的鱼存活率。
8.枯草芽孢杆菌菌株用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的用途，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体。
9.分离的枯草芽孢杆菌菌株用于改善鱼例如尼罗罗非鱼的康乐、一般状况、健康和/或产量的用途，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列。
10.一种包含分离的枯草芽孢杆菌菌株以及载体的组合物，该菌株是具有保藏登录号NRRL B-67221的枯草芽孢杆菌菌株O14VRQ或具有枯草芽孢杆菌菌株NRRL B-67221的鉴别特征的菌株或其突变体，其中该组合物是鱼饲料或鱼饲料添加剂。
11.一种包含分离的枯草芽孢杆菌菌株以及载体的组合物，该菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少98.00％，例如至少98.05％、至少98.10％、至少98.15％、至少98.20％、至少98.25％、至少98.30％、至少98.35％、至少98.40％、至少98.45％、至少98.50％、至少98.55％、至少98.60％、至少98.65％、至少98.70％、至少98.75％、至少98.80％、至少98.85％、至少98.90％、至少98.95％、至少99.00％、至少99.05％、至少99.10％、至少99.15％、至少99.20％、至少99.25％、至少99.30％、至少99.35％、至少99.40％、至少99.45％、至少99.50％、至少99.55％、至少99.60％、至少99.65％、至少99.70％、至少99.75％、至少99.80％、至少99.85％、至少99.90％、至少99.95％或100％的序列同一性的16S rDNA序列，其中该组合物是鱼饲料或鱼饲料添加剂。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其中该分离的枯草芽孢杆菌菌株是以孢子的形式。
13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中该载体选自下组，该组由以下组成：液体、浆液和/或固体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20201020 |