BR112020003799A2

BR112020003799A2 - microrganismo de alimentação direta para melhorar a condição geral e saúde de peixes

Info

Publication number: BR112020003799A2
Application number: BR112020003799-0A
Authority: BR
Inventors: David Drahos
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2020-09-08
Also published as: PH12020500167A1; WO2019040266A1; ECSP20019404A; CN111801019A; MX2020001687A

Abstract

A presente invenção se refere a uma cepa bacteriana para melhor o bem-estar, a condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes.

Description

“MICRORGANISMO DE ALIMENTAÇÃO DIRETA PARA MELHORAR A CONDIÇÃO GERAL E SAÚDE DE PEIXES” REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, a qual é incorporada ao presente documento a título de referência.

REFERÊNCIA AO DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

[0002] Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é incorporado no presente documento a título de referência. Para as informações completas, consultar o último parágrafo da descrição.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se refere a uma cepa bacteriana para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A pesca comercial, a prática de capturar peixes e outros frutos do mar de locais de pesca selvagens para benefício comercial, aumentou as preocupações quanto à sustentabilidade de populações de peixes selvagens. Desse modo, a aquacultura emergiu como uma alternativa viável à pesca comercial em grande escala. A aquacultura, ou aquicultura, é o cultivo de populações de água doce e salgada sob condições controladas e mostrou-se benéfica na medida em que reduz os impactos e as pressões da pesca comercial em locais de pesca selvagens, assim como reduz a ingestão humana de toxinas (por exemplo, metais pesados, tais como mercúrio) que são frequentemente encontradas em peixes capturados na natureza, tais como atum. Apesar dos efeitos positivos que a aquicultura teve em locais de pesca selvagens, ainda existem desafios na indústria de aquacultura. Em particular, manter um intestino saudável no animal aquático pode melhorar o peso do animal aquático e/ou os rendimentos do animal aquático. Outro principal desafio por toda a indústria é a perda de rendimento devido a micro-organismos patogênicos que infectam e causam morte ou doença nos animais aquáticos. Desse modo, na indústria de aquacultura, ainda é prática comum o uso de antibióticos para tratar animais aquáticos e/ou ambientes infectados por micro-organismos patogênicos. Entretanto, as preocupações crescentes em relação à resistência a antibióticos criaram a necessidade de novas soluções para melhorar a saúde do animal aquático e controlar a infecção de bactérias patogênicas na indústria de criação de animais aquáticos (aquacultura).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A invenção fornece cepas bacterianas para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo, melhorar, por exemplo, o peso do peixe Tilápia-do-nilo, a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou a resposta imunológica na Tilápia-do-nilo.

[0006] Em uma modalidade, a invenção fornece uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para melhorar o bem- estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0007] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0008] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0009] A invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma e um carreador, em que a composição é uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS A SEQ ID NO: 1 é o 16S rDNA da cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221.

A SEQ ID NO: 2 é o iniciador direto para a cepa NZ86. A SEQ ID NO: 3 é o iniciador reverso para a cepa NZ86. A SEQ ID NO: 4 é a sonda para a cepa NZ86. A SEQ ID NO: 5 é o iniciador direto para a cepa O14VRQ.

A SEQ ID NO: 6 é o iniciador reverso para a cepa O14VRQ.

A SEQ ID NO: 7 é a sonda para a cepa O14VRQ.

A SEQ ID NO: 8 é o iniciador direto para o TNF-α de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 9 é o iniciador reverso para o TNF-α de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 10 é a sonda para o TNF-α de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 11 é o iniciador direto para a IL-1β de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 12 é o iniciador reverso para a IL-1β de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 13 é a sonda para a IL-1β de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 14 é o iniciador direto para a actβ de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 15 é o iniciador reverso para a actβ de gene de Oreochromis niloticus.

A SEQ ID NO: 16 é a sonda para a actβ de gene de Oreochromis niloticus.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 mostra a concentração de neutrófilos no sangue periférico no dia 28 (parte superior) e lisozima no sangue (parte intermediário e superior) nos dias 14 e 51, respectivamente, de Tilápia-do- nilo após a alimentar o peixe com B. subtilis O14VRQ em comparação à concentração dos neutrófilos no sangue periférico e lisozima no sangue de um grupo de controle de Tilápia-do-nilo que não foi alimentado com a cepa (CTL).

[0011] A Figura 2 mostra a expressão de mRNA de citocina pró-inflamatória no intestino médio da Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) após suplementação probiótica por 51 dias. TNFα no intestino (A) e IL-1β no intestino (B).

DEFINIÇÕES

[0012] Em geral, os termos e expressões usados no presente documento têm seus significados reconhecidos na técnica, que podem ser encontrados por meio de referência aos textos-padrão, referências a publicações e contexto conhecido por aqueles versados na técnica. As definições a seguir são fornecidas para esclarecer seu uso específico no contesto da revelação.

[0013] Como usadas no presente documento, as formas singulares "um", "uma" e "o" e "a" se destinam a incluir também as formas plurais, a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.

[0014] O termo "cerca de" significa uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em tanto quanto 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% em relação a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.

[0015] Conforme usado no presente documento, os termos "aquacultura” e "aquicultura" podem ser usados de forma intercambiável e se referem ao cultivo, reprodução, criação, produção, propagação e/ou colheita de um animal aquático ou marinho, tal como peixe, geralmente em um ambiente artificial, tal como um tanque (por exemplo, um aquário), uma lagoa, uma piscina, um arrozal, um lago, etc. ou em uma porção encerrada ou cercada do habitat natural dos animais, tal como uma lagoa, uma piscina, um arrozal, um lago, um estatuário, um oceano, um pântano (por exemplo, um pântano de maré), uma laguna (por exemplo, uma laguna de maré), etc.

[0016] Conforme usado no presente documento, o termo "peixe" se refere a todos os animais com crânio aquáticos que possuem guelras que não têm membros com dedos. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, osteichthyes (incluindo, porém sem limitação, bagre, tilápia, truta, salmão, perca, robalo, atum, cavala-da-índia, atum, peixe- espada, marlim, garoupa, esturjão, caranho, enguia e picão-verde) e chondrichthyes (incluindo, porém sem limitação tubarões, raias e arraias. Em uma modalidade particular, o peixe é Tilápia-do-nilo.

[0017] Conforme usado no presente documento, o termo "Tilápia-do-nilo" se refere a um peixe da família Cichlidae, Oreochromis niloticus, que é nativo da África. Outros nomes comercialmente conhecidos do peixe incluem mango fish, nilotica e boulti.

[0018] Conforme usado no presente documento, os termos "fornecer", "fornecido", "fornecendo", "administrar", "administrado" ou "administrando", são usados de forma intercambiável e se destinam a significar colocar um peixe, por exemplo, o peixe Tilápia-do-nilo, em contato com uma cepa de Bacillus ou uma composição conforme descrito no presente documento. Uma forma preferencial de fornecimento ou administração é a administração oral, tal como administração por meio de água ou por meio de ração para peixes.

[0019] Conforme usado no presente documento, o termo "controle" ou "controlar" como, por exemplo, no sintagma: o "controle" dos micro-organismos patogênicos ou "controlar" micro-organismos patogênicos, ou como no sintagma: "controla" espécies de micro-organismos patogênicos, se refere a qualquer meio para impedir a infecção por micro-organismos patogênicos, reduzir o número de micro-organismos patogênicos, exterminar os micro-organismos patogênicos ou eliminar os micro-organismos patogênicos conforme definido no presente documento. De fato, "controle" ou "controlar" conforme usado no presente documento se refere a quaisquer indivíduos de sucesso na prevenção, extermínio, eliminação, redução ou atenuação de uma ou mais bactérias patogênicas.

[0020] Por toda esta revelação, a não ser que o contexto exija de outro modo, as palavras "compreendem", "compreende" e "que compreende" serão entendidas como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos determinado, mas não a exclusão de qualquer etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos.

[0021] O termo "que consiste em" significa incluindo, e limitado a, o que quer que siga o sintagma "que consiste em". Assim, o sintagma "que consiste em" indica que os elementos listados são exigidos ou mandatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. O termo "que consiste essencialmente em" significa incluindo quaisquer elementos listados após o sintagma e com limitação a outros elementos que não interferem com ou contribuem para a atividade ou ação especificada na revelação para os elementos listados. Assim, o sintagma "que consiste essencialmente em" indica que os elementos listados são exigidos ou mandatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem estar presentes ou não dependendo de se os mesmos afetam materialmente ou não a atividade ou ação dos elementos listados.

[0022] Conforme usado no presente documento, os termos "esporo" e "endósporo" são intercambiáveis e têm seu significado normal que é bastante conhecido e entendido por aqueles que são versados na técnica. Conforme usado no presente documento, o termo esporo se refere a um microrganismo no seu estado dormente e protegido.

[0023] Conforme usado no presente documento, o termo "isolado" significa que as cepas bacterianas descritas no presente documento estão em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza, isto é, a cepa bacteriana é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural aos quais a mesma está associada na natureza.

[0024] Conforme usado no presente documento, o termo "mistura" significa mais de uma das cepas bacterianas descritas no presente documento.

[0025] Conforme usado no presente documento, o termo "micro-organismo patogênico" significa qualquer micro-organismo que possa afetar adversamente a saúde, o rendimento ou o ambiente de um ou mais peixes.

[0026] Conforme usado no presente documento, o termo "saúde" se refere ao estado ou condição de um organismo ou uma de suas partes.

[0027] Conforme usado no presente documento, os termos "quantidade eficaz", "concentração eficaz", ou "dosagem eficaz" são definidos como a quantidade, concentração ou dosagem da cepa bacteriana (ou cepas bacterianas) suficiente para melhorar saúde ou o rendimento de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo. A dosagem eficaz real em números absolutos depende de fatores incluindo: o estado de saúde do peixe em questão; se o objetivo é a prevenção ou a redução de um organismo patogênico, melhorar a saúde geral, saúde do intestino, etc.; outros ingredientes presentes e também a superfície ou ambiente aquoso em questão. Em uma modalidade, uma dosagem eficaz de bactérias, por exemplo, da uma ou mais das cepas de Bacillus subtilis reveladas, estaria na faixa de 1x102 a 1x1012 CFU/g da composição, de preferência, 1x104 a 1x109 CFU/g da composição, mais preferencialmente, 1x105 a 1x108 CFU/g da composição e, ainda mais preferencialmente, 1x106 a 5x108 CFU/g da composição. Ademais, em uma modalidade, a razão entre a cepa de bactéria ou mesclas referidas no presente documento e o micro-organismo (ou micro- organismos) indesejado em questão pode estar entre 1:100.000 e 100.000:1 (cepa/mescla:micro-organismo indesejado), de preferência, 1:10.000 a

10.000:1, mais preferencialmente, 1:1.000 a 1.000:1, mais preferencialmente, 1:100 a 100:1, ainda mais preferencialmente, 1:10 a 10:1. A "quantidade eficaz", "concentração eficaz" ou "dosagem eficaz" das cepas bacterianas pode ser determinada por ensaios de rotina conhecidos por aqueles que são prontamente versados na técnica.

[0028] Conforme usado no presente documento, o termo "ração para peixes" ou "ingrediente de ração para peixes" se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequada para ou destinada à ingestão por peixe, tal como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína vegetal (ou proteínas vegetais)" se refere a qualquer composto, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou que se origina a partir de um vegetal, que inclui proteínas modificadas e derivados de proteínas.

[0030] Conforme usado no presente documento, os termos “pélete” e/ou “peletização” se referem a comprimidos ou péletes arredondados, esféricos e/ou cilíndricos sólidos e aos processos para formação de tais formas sólidas, particularmente péletes de ração e ração para peixes extrudada sólida. Como usados aqui, os termos “extrusão” ou

"extrudando” são termos bem conhecidos na técnica e se referem a um processo de forçar uma composição, como descrito aqui, a passar através de um orifício sob pressão.

[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "composição" se refere a uma composição que compreende um carreador e pelo menos uma cepa bacteriana, conforme descrito no presente documento. As composições descritas no presente documento podem ser misturadas com uma ração (ou rações) para peixes e denominadas "ração em purê". Alternativamente, a composição são, por exemplo, péletes de ração que afundam.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] São descritas e reveladas no presente documento cepas bacterianas para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo, melhorar, por exemplo, o peso do peixe Tilápia-do-nilo, a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou a resposta imunológica na Tilápia-do-nilo.

[0033] Os inventores constataram que as cepas descritas no presente documento melhoraram surpreendentemente o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo, quando fornecidas aos peixes. As cepas mostraram surpreendentemente também melhorar múltiplos componentes da resposta imunológica em peixes, tais como Tilápia-do-nilo, quando fornecidas aos peixes. Em uma modalidade, uma cepa conforme revelado no presente documento é fornecida a peixes, tais como Tilápia-do-nilo, para diminuir linfócitos, aumentar neutrófilos e monócitos no sangue em circulação, diminuir a lisozima plasmática e/ou aumentar a proporção de células positivas para rodamina (RHO).

[0034] É um objetivo das modalidades reveladas no presente documento que as cepas bacterianas fornecidas no presente documento melhorem a saúde do peixe Tilápia-do-nilo e/ou taxa de sobrevivência dos peixe Tilápia-do-nilo. É um objetivo adicional das modalidades reveladas no presente documento que as cepas bacterianas melhorem a profilaxia de peixe, reduzam a necessidade de antibióticos, diminuam os custos de produção e/ou melhorem as condições ambientais na cultura de peixes.

[0035] Em uma modalidade, a cepa bacteriana melhora a saúde dos peixes melhorando o sistema imunológico e/ou a resposta imunológica dos peixes.

[0036] Em uma modalidade, a cepa de Bacillus subtilis tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium. Em uma modalidade preferencial, a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade adicional preferencial, a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0037] Em uma modalidade preferencial, a cepa de Bacillus subtilis é isolada. Em outra modalidade preferencial, a cepa de Bacillus subtilis está em forma de esporo.

[0038] Em uma modalidade, um método para melhorar o bem-estar, condição geral ou saúde de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, compreende fornecer, tal como administrar, a um peixe, tal como Tilápia-do- nilo, a cepa bacteriana revelada no presente documento em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade particular, o método compreende colocar o intestino de um peixe em contato com a cepa bacteriana revelada no presente documento. Em uma modalidade ainda mais particular, as cepas bacterianas podem controlar e/ou inibir uma ou mais cepas de Vibrio, tais como Vibrio parahaemolyticus.

[0039] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método para melhorar o bem-estar, condição geral ou saúde de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, em que o método compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais dentre a cepa de Bacillus subtilis isolada O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma ao peixe, tal como Tilápia-do-nilo.

[0040] A invenção se refere adicionalmente a um método para melhorar o bem-estar, condição geral ou saúde de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais das cepas de Bacillus subtilis isoladas que têm uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0041] Em uma modalidade, um método para melhorar a resposta imunológica de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, compreende fornecer, tal como administrar, a um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, uma cepa bacteriana em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade particular, o método compreende colocar o intestino de um peixe em contato com uma cepa bacteriana revelada no presente documento. Em uma modalidade ainda mais particular, as cepas bacterianas podem controlar e/ou inibir linfócitos, neutrófilos e monócitos, lisozima plasmática e/ou a proporção de células positivas para rodamina (RHO).

[0042] Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a um método para melhorar a resposta imunológica de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais dentre a cepa de Bacillus subtilis isolada O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma a peixes, tais como Tilápia-do-nilo.

[0043] A invenção se refere ainda adicionalmente a um método para melhorar a resposta imunológica de um peixe, tal como Tilápia- do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais das cepas de Bacillus subtilis isoladas que têm uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0044] Em ainda outra modalidade, um método para obter uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos, aumento na lisozima plasmática e/ou um aumento na proporção de células positivas para rodamina (RHO) em um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, compreende fornecer, tal como administrar, a um peixe, tal como Tilápia-do- nilo, uma cepa bacteriana em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade particular, o método compreende colocar o intestino de um peixe em contato com uma cepa bacteriana revelada no presente documento. Em uma modalidade ainda mais particular, as cepas bacterianas podem controlar e/ou inibir patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium. Em uma modalidade preferencial, a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade adicional preferencial, a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0045] Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a um método para obter uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos e/ou um aumento na lisozima plasmática em um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais dentre a cepa de Bacillus subtilis isolada O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma a peixes, tais como Tilápia-do-nilo.

[0046] A invenção se refere adicionalmente a um método para obter uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos e/ou um aumento na lisozima plasmática em um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma ou mais das cepas de Bacillus subtilis isoladas que têm uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0047] O método compreende, de preferência, um fornecimento, tal como administração, diário por pelo menos 2 dias, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 dias (dias consecutivos ou não consecutivos). Em uma modalidade, o fornecimento, tal como administração, diário é por até 100 dias, tal como até 90 dias, 80 dias, 70 dias, 60 dias ou 51 dias. Em uma modalidade, o fornecimento, tal como administração, diário é por 1 a 100 dias, tal como por 2 a 80 dias, 10 a 70 dias, 20 a 60 dias ou 28 a 51 dias.

[0048] O método compreende, de preferência, uma dose diária de 1,5x106 CFU da cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo. Em outra modalidade, o método compreende uma dose diária de 0,9x106 a 6,0x106 CFU da cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo. Em outra modalidade, o método compreende uma dose diária de 0,1x10 6 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo, tal como uma dose selecionada a partir do grupo que consiste em de 0,1x106 a 0,5x106, de 0,5x106 a 1,0x106, de 1,0x106 a 2,0x106, de 2,0x106 a 3,0x106, de 3,0x106 a 4,0x106, de 4,0x106 a 5,0x106, de 5,0x106 a 6,0x106, de 6,0x106 a 7,0x106, de 7,0x106 a 8,0x106, de 8,0x106 a 9,0x106, de 9,0x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis de acordo com a invenção por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0049] Em outra modalidade preferencial, o tratamento resulta da sobrevivência de pelo menos 20% mais da Tilápia-do-nilo em comparação ao controle (nenhum fornecimento, tal como administração, das cepas Bacillus subtilis isoladas de acordo com a invenção), tal como pelo menos 30% mais, tal como pelo menos 40% mais, tal como pelo menos 50% mais ou tal com pelo menos 60% mais sobrevivência.

[0050] A invenção também se refere à cepa deBacillus subtilis isolada O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B- 67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral ou saúde de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo.

[0051] A invenção também se refere a uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem um 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral ou saúde de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo.

[0052] Em ainda outra modalidade, as cepas bacterianas para uso no método estão presentes na forma de um esporo estável. Em ainda outra modalidade do método, o esporo estável germinará no intestino do peixe.

[0053] Em uma modalidade particular, o método compreende fornecer, tal como administrar, a um peixe, tal como Tilápia-do- nilo, uma cepa bacteriana descrita no presente documento, em que a contagem bacteriana da cepa bacteriana está entre 1x102 e 1x1012 CFU/g da composição, particularmente, 1x104 e 1x109 CFU/g da composição e, mais particularmente, 1x105 e 5x108 CFU/g da composição. Em uma modalidade mais particular, a contagem bacteriana da cepa bacteriana descrita no presente documento está entre 1x106 e 1x108 CFU/g da composição.

[0054] Em uma modalidade ainda mais particular, o método compreende a etapa de colocar o intestino de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo em contato com a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma ou mais cepas que têm as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B- 67221 ou um mutante da mesma.

[0055] Em uma modalidade, o método compreende a etapa de colocar o intestino de um peixe, tal como Tilápia-do-nilo, em contato com uma ou mais das cepas bacterianas descritas no presente documento em que a cepa bacteriana melhora a saúde do peixe. Os exemplos não limitantes de parâmetros adequados para medir a saúde melhorada incluem, porém sem limitação, ganho de peso corporal, pontuação de condição corporal melhorada, ingestão de alimentos aumentada, situação antioxidante melhorada, diminuição em marcadores de estresse oxidativo, níveis séricos de proteína ideais, níveis séricos de mineral ideais, função de sistema imunológico melhorada, saúde e diversidade melhoradas da microflora do intestino, diminuição em bactérias fecais, etc. Os exemplos não limitantes de parâmetros de desempenho adequados incluem ganho de peso, razão entre ração:ganho, digestibilidade de nutrientes, razão de conversão alimentar, grau da carne, rendimento da carne, razão entre proteína e gordura da carne, mortalidade, taxa de mortalidade e parâmetros de desempenho similares.

[0056] Em uma modalidade particular, o método compreende a etapa de colocar o intestino de um peixe, tal como Tilápia-do- nilo, em contato com uma ou mais das cepas bacterianas descritas no presente documento em que a cepa bacteriana melhora a saúde do peixe aumentando-se o peso do peixe. Em ainda outra modalidade, a cepa bacteriana melhora a saúde dos peixes melhorando o sistema imunológico e/ou a resposta imunológica dos peixes. Em ainda outra modalidade, a cepa bacteriana melhora a saúde dos peixes melhorando a saúde geral do intestino dos peixes. Os exemplos não limitantes de saúde do intestino melhorada incluem reduzir a inflamação do intestino, aumentar o comprimento e/ou área superficial das vilosidades intestinais, aumentar a profundidade da cripta intestinal, melhorar a absorção de nutrientes pelo intestino, manter e/ou melhorar a microflora saudável do intestino, melhorar os neutrófilos, linfócitos e monócitos no sangue periférico ou combinações dos mesmos. Em ainda outra modalidade, a cepa bacteriana melhora a saúde dos peixes controlando-se os micro-organismos patogênicos. Em uma modalidade particular, a cepa bacteriana melhora a saúde dos peixes controlando-se os micro-organismos patogênicos no intestino dos peixes.

[0057] Em uma modalidade típica da invenção, o peixe pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em osteichthyes e chondrichthyes. Em uma modalidade adicional, o peixe é selecionado a partir do grupo que consiste em bagre, tilápia, truta, salmão, perca, robalo, atum, cavala-da-índia, atum, peixe-espada, marlim, garoupa, esturjão, caranho, enguia, picão-verde, tubarões, raias e arraias. Em uma modalidade adequada, o peixe é um osteichthye, tal como uma tilápia. Em uma modalidade particular, o peixe é Tilápia-do-nilo.

[0058] A invenção também se refere ao uso das cepas bacterianas de acordo com a invenção na aquacultura. Composições

[0059] Em uma modalidade, uma composição para uso no método da invenção compreende um ingrediente de ração para peixes, tal como um ingrediente de ração para peixes Tilápia-do-nilo e uma cepa bacteriana de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a cepa bacteriana é uma cepa estável quando a cepa é submetida a um processo de extrusão que tem uma pressão de 1 bar a 35 bar; a cepa é submetida a um processo de extrusão em que as temperaturas de processo de extrusão são temperaturas de 80 °C a 120 °C; e as cepas que controlam um ou mais micro-organismos patogênicos.

[0060] Em uma modalidade particular, a cepa bacteriana é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma.

[0061] Em uma modalidade particular, a composição inclui a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma; e um carreador. O carreador pode, por exemplo, ser carbonato de cálcio, outros carreadores mencionados em outra parte no presente documento ou outros carreadores descritos na técnica anterior.

[0062] Em uma modalidade preferencial, a composição compreende uma cepa de Bacillus subtilis que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; e um carreador.

[0063] Em uma modalidade preferencial, a uma ou mais cepas de Bacillus subtilis isoladas na composição estão em forma de esporo.

[0064] A composição é, de preferência, uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes, tal como uma ração para peixes Tilápia-do-nilo ou um aditivo de ração para peixes Tilápia-do-nilo. Em uma modalidade, a ração para peixes são péletes de ração, tais como péletes de ração que afundam. Em uma modalidade específica, os péletes de ração têm a superfície revestida com a cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com a invenção. Em uma modalidade específica, os péletes de ração têm a superfície revestida em ração para peixes padrão com a cepa de Bacillus subtilis na forma de esporos. Em uma modalidade preferencial, a composição compreende de 104 a 108 CFU/g de ração, tal como de 105 a 107 CFU/g de ração, ou tal como de 5 x 106 a 9 x 106 CFU/g de ração das cepas de Bacillus subtilis de acordo com a invenção.

[0065] Em uma modalidade, as composições descritas no presente documento podem ser de qualquer forma contanto que o carreador tenha a capacidade de suportar a cepa bacteriana, independentemente da forma (por exemplo, um estado vegetativo ou um estado dormente), e a composição é adequada para ingestão por um peixe, tal como o peixe Tilápia-do-nilo. Em certas modalidades, a composição pode estar na forma de um líquido, uma pasta, um sólido, ou um pó (pó molhável ou pó seco). Em uma modalidade particular, a composição revelada no presente documento, independentemente da forma, por exemplo, um líquido, uma pasta fluida ou um pó (por exemplo, pó molhável ou pó seco), é adequada para uso como um ingrediente em uma ração para peixes. Em uma modalidade mais particular, as composições descritas no presente documento são adequadas para uso como um ingrediente em uma ração para peixes peletizada. Em uma modalidade ainda mais particular, as composições descritas no presente documento são adequadas para uso como um ingrediente em uma ração para peixes produzida por meio de um processo de extrusão. Carreador (ou carreadores) na composição:

[0066] Os carreadores descritos no presente documento permitirão que a cepa bacteriana descrita no presente documento permaneça eficaz (por exemplo, com a capacidade de melhorar o bem-estar, condição geral, saúde ou taxa de sobrevivência de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo) e viável uma vez que formulada. Exemplos não limitantes de transportadores aqui descritos incluem líquidos, pastas, ou sólidos (incluindo pós molháveis ou pós secos).

[0067] Em uma modalidade, o carreador é um carreador líquido. Os exemplos não limitantes de líquidos úteis como carreadores para as composições reveladas no presente documento incluem água, soluções aquosas ou soluções não aquosas. Em uma modalidade de realização, o transportador é água. Em outra modalidade, o carreador é uma solução aquosa, tal como água com açúcar. Em outra modalidade, o carreador é uma solução não aquosa. Se um carreador líquido for usado, o carreador líquido (por exemplo, água) pode incluir adicionalmente meio de crescimento para cultivar a cepa bacteriana. Os exemplos não limitantes de meio de crescimento adequado para as cepas bacterianas depositadas incluem arabinose-gluconato (AG), extrato de levedura de manitol (YEM), meio G16, ou quaisquer meios conhecidos dos habilitados na arte como sendo compatíveis com, e/ou proporcionando nutrientes de crescimento à cepa bacteriana.

[0068] Em outra modalidade de realização, o transportador é uma pasta.

[0069] Em outra modalidade de realização, o transportador é um sólido. Em uma modalidade particular, o sólido é um pó. Em uma modalidade, o pó é um pó molhável. Em outra modalidade de realização, o pó é um pó seco. Em outra modalidade de realização, o sólido é um grânulo. Os Exemplos não limitantes de sólidos úteis como carreadores para as composições reveladas no presente documento incluem cálcio, carbonato, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, turfa, trigo, joio de trigo, palha de trigo moída, farelo, vermiculita, celulose, amido, solo (pasteurizado ou não pasteurizado), gipsita, talco, argilas (por exemplo, caulim, bentonita, montmorillonita) e géis de sílica. Em uma modalidade particular, o carreador é carbonato de cálcio. Em outra modalidade, o carreador é bicarbonato de sódio. Cepa (ou cepas) bacteriana nas composição:

[0070] A composição para uso no método da invenção compreende uma cepa bacteriana de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a cepa bacteriana é estável quando a cepa é submetido a um processo de fabricação de ração. Em uma modalidade particular, a cepa bacteriana é estável quando a cepa é submetida a um processo de extrusão para peletização.

[0071] Em uma modalidade, a cepa bacteriana é estável quando submetida a pressões alcançadas durante um processo de extrusão para peletização. Em uma modalidade particular, a cepa bacteriana é estável em pressões na faixa de 1 bar a 40 bar, particularmente, 10 bar a 40 bar, mais particularmente, 15 bar a 40 bar, ainda mais particularmente 20 bar a 40 bar, ainda mais particularmente, 35 bar a 37 bar, com máxima particularidade, 36 bar.

[0072] Em uma modalidade, a cepa bacteriana é estável a altas temperaturas. Em particular, a cepa bacteriana é estável quando são submetidas a temperaturas alcançadas durante um processo de extrusão para peletização. Em uma modalidade ainda mais particular, a cepa bacteriana é estável a um formato de temperaturas de cerca de 80 °C.

[0073] Em uma modalidade mais particular, a estabilidade de extrusão da cepa (ou cepas) bacteriana é determinada pela extrusão a 100 °C ou 110 °C, exibindo 50% ou mais de sobrevivência a 100 °C ou 25% ou mais de sobrevivência a 110°C.

[0074] Em uma modalidade ainda mais particular, a cepa bacteriana é estável quando a cepa é submetida a um processo de extrusão em que a extrusora tem um diâmetro de matriz de 0,5 mm a 5,0 mm.

[0075] Em outra modalidade, a cepa bacteriana controla um ou mais micro-organismos patogênicos.

[0076] Em ainda outra modalidade, a cepa bacteriana são cepas estáveis quando a cepa é submetida a um processo de extrusão que tem uma pressão de 1 bar a 40 bar; a cepa é submetida a um processo de extrusão em que as temperaturas de processo de extrusão são temperaturas de 80 °C a 120 °C; e as cepas controlam um ou mais micro-organismos patogênicos.

[0077] Em uma modalidade particular, as cepas bacterianas estarão presentes em uma quantidade entre 1x102 e 1x1012 CFU/g da composição, particularmente 1x104 e 1x109 CFU/g da composição, e mais particularmente 1x105 e 5x108 CFU/g da composição. Em uma modalidade mais específica, as cepas bacterianas estarão presentes em uma quantidade entre 1x106 e 1x108 CFU/g da composição.

[0078] A fermentação das cepas bacterianas pode ser conduzida usando processos de fermentação convencionais, tais como técnicas de cultura líquida aeróbicas, cultivo em frasco de agitação, e fermentação em pequena escala ou grande escala (por exemplo, fermentação contínua, em batelada, em batelada alimentada, em estado sólido, etc.) em fermentadores laboratoriais ou industriais, e tais processos são bem conhecidos na arte. Independentemente do processo de produção usado para produzir as cepas bacterianas, as cepas bacterianas podem ser usadas diretamente a partir do meio da cultura ou submetidas à purificação e/ou outras etapas de processamento (por exemplo, um processo de secagem).

[0079] Após a fermentação, as cepas bacterianas podem ser recuperadas usando técnicas convencionais (por exemplo, por filtração, centrifugação, etc.). A cepa bacteriana pode ser alternativamente seca (por exemplo, secagem ao ar, liofilização ou secagem por pulverização até um baixo nível de umidade e armazenamento a uma temperatura adequada, por exemplo, temperatura ambiente).

[0080] Em uma modalidade, a uma ou mais bactérias reveladas no presente documento são estáveis e retêm uma quantidade eficaz suficiente de atividade quando usadas. Métodos para produção de microrganismos estabilizados são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a uma ou mais bactérias reveladas no presente documento estão presentes na composição na forma de um esporo estável.

Ingredientes opcionais na composição:

[0081] As composições para uso no método da invenção podem compreender adicionalmente um ou mais ingredientes opcionais que são adequados para consumo por um peixe aquático, tal como o peixe Tilápia-do-nilo. Os ingredientes opcionais não limitantes incluem enzimas. Tais ingredientes são conhecidos daqueles peritos na técnica. Enzimas

[0082] É adicionalmente contemplado que as composições para uso no método da invenção incluem opcionalmente uma ou mais enzimas conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade particular, a uma ou mais enzimas podem ser qualquer enzima ou combinação de diferentes enzimas que são adequadas para serem dadas a um peixe, significando que será, de um modo ou de outro, bom para o peixe de modo nutricional comer a enzima. Consequentemente, quando é feita referência a "uma enzima", isso será entendido, em geral, como incluindo uma ou mais enzimas alimentares. Em uma modalidade particular, a mesma não é interpretada como incluindo enzimas que têm uma função terapêutica no sentido médico.

[0083] As enzimas alimentares devem ser de grau alimentar/alimentício, significando, assim, que as mesmas podem não ser nocivas a peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo, e devem ser de grau alimentar/alimentício significando que devem cumprir com as especificações de pureza recomendadas para enzimas de grau alimentício. Em uma modalidade particular, isso significa que a enzima cumpre com as especificações de pureza recomendadas para enzimas de grau alimentício dadas pelo Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) e pelo Food Chemical Codex (FCC).

[0084] Em uma modalidade particular, a enzima compreende menos do que 30 bactérias coliformes por grama e compreendem uma contagem viável menor do que 50.000/g.

[0085] Em outra modalidade, as composições descritas no presente documento incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. Enzimas podem ser classificadas com base no manual de Nomenclatura de Enzima de NC-IUBMB, 1992, consultar também o site ENZYME na internet: expasy.ch/enzima/. ENZYME é um repositório de informação em relação à nomenclatura de enzimas. O mesmo é primariamente baseado nas recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305). Esta nomenclatura de enzima IUB- MB é baseada na sua especificidade pelo substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular; uma tal classificação não reflete as características estruturais destas enzimas.

[0086] Outra classificação de certas enzimas glicosídeo hidrolase, tais como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase, lisozima e galactosidase, é descrita em Henrissat et al, 2014, "The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013", Nucl. Acids Res. (D1): D490-D495; consultar também cazy.org.

[0087] Assim, a composição da invenção pode também compreender pelo menos uma outra enzima selecionada dentre o grupo que compreende fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC

3.4), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase, tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17);

arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); beta-xilosidase (EC 3.2.1.37); acetil xilana esterase (EC 3.1.1.72); feruloil esterase (EC 3.1.1.73); celulase (EC

3.2.1.4); celobioidrolases (EC 3.2.1.91); beta-glucosidase (EC 3.2.1.21); pululanase (EC 3.2.1.41) e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6) ou qualquer mistura das mesmas.

[0088] Em modalidade específica, a composição da invenção compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Os exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos no WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.

[0089] Em uma modalidade específica, a composição da invenção compreende uma xilanase (EC 3,2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX e Ronozyme® G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma) e Axtra® XB (Xilanase/beta- glucanase, DuPont).

[0090] Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende uma protease (EC 3.4). Os exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products). Ração para Peixes

[0091] Em certas modalidades, as composições para uso no método da invenção são adequadas para uso em ração (ou rações) para peixes, tal como ração (ou rações) para peixes Tilápia-do-nilo. As características das composições descritas no presente documento permitem seu uso como um componente que é bem adequado para a inclusão com uma ração para peixes. Em modalidades particulares, as composições descritas no presente documento são misturadas com um ingrediente de ração para peixes e/ou ração (ou rações) para peixes e denominadas ração em purê. Em certas modalidades, a ração em purê é subsequentemente peletizada.

[0092] A ração para peixes pode compreender qualquer ingrediente adequado para ingestão por peixes (tais como o peixe Tilápia- do-nilo), por exemplo, que compreende fontes de proteína, lipídios, carboidratos, sais, minerais e vitaminas. Os ingredientes de ração para peixes podem ser selecionados e misturados em quaisquer proporções, adequadas para satisfazer as necessidades nutricionais do peixe a ser alimentado com a ração e/ou para manter o custo de matéria-prima da ração dentro dos limites desejados e/ou para alcançar outras propriedades desejadas da ração. Os exemplos não limitantes de ingredientes de ração para peixes podem incluir um ou mais dos seguintes materiais: produtos derivados de planta, tais como sementes, grãos, folhas, raízes, tubérculos, flores, vagens, cascas, óleo, farinha de soja, isolado de proteína de soja, proteína de batata em pó, trigo, cevada, milho, óleo de soja e farinha de glúten de milho; produtos derivados de animais, tais como farinha de peixe, óleo de peixe, leite em pó, leite de desnatado em pó, extrato de osso, extrato de carne, extrato de sangue e similares; aditivos, tais como minerais, vitaminas, compostos aromáticos e enzimas de melhoramento de ração.

[0093] Em modalidades particulares, a ração para peixes pode compreender 0 a 80% de maís; e/ou 0 a 80% de sorgo; e/ou 0 a 70% trigo; e/ou 0 a 70% de cevada; e/ou 0 a 30% de aveia; e/ou 0 a 40% de farinha de soja; e/ou 0 a 10% de farinha de peixe; e/ou 0 a 20% de soro de leite.

[0094] A ração para peixes pode compreender proteínas vegetais. Em modalidades particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% (em p/p). As proteínas vegetais podem ser derivadas a partir de fontes de proteínas vegetais, como leguminosas e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, tais como farelo de soja, farelo de tremoço, farelo de colza e suas combinações.

[0095] Em uma modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. Em outra modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, p.ex., beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza e couve. Em outra modalidade particular, a soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais, tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.

[0096] Em outra modalidade, a ração para peixes pode compreender opcionalmente um ou mais aditivos de ração para peixes adequados. Os exemplos não limitantes de aditivos de ração para peixes adequados incluem inibidores de enzimas, vitaminas lipossolúveis, vitaminas solúveis em água, minerais vestigiais, macrominerais e combinações dos mesmos.

[0097] Em outra modalidade, a ração para peixes pode compreender adicionalmente um ou mais ingredientes de aditivo de ração. Os exemplos não limitantes de ingredientes de aditivo de ração incluem agentes colorantes, compostos aromáticos, estabilizantes, peptídeos antimicrobianos (os exemplos não limitantes de peptídeos antimicrobianos (AMP's) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina,

Defensina, Ovispirina, tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), e variantes ou fragmentos dos mesmos que retêm atividade antimicrobiana), polipeptídeos antifúngicos (AFP's) (os exemplos não limitantes incluem os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos dos mesmos que retêm atividade antifúngica, conforme revelado nos documentos no WO 94/01459 e PCT/DK02/00289) e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre fitases EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26; xilanases EC 3.2.1.8; galactanases EC 3.2.1.89; e/ou beta-glucanases EC

3.2.1.4.

[0098] Em ainda outra modalidade, a ração para peixes pode ainda, adicional e opcionalmente, incluir uma ou mais vitaminas solúveis em água e gordura, minerais vestigiais e macrominerais. Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais vestigiais, formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada à adição à ração, ao mesmo tempo que os macrominerais são usualmente adicionados separadamente à ração.

[0099] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, p.ex., vitamina K3.

[0100] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D- pantotenato.

[0101] Os exemplos não limitantes de minerais vestigiais incluem boro, cobalto, cloreto, crômio, cobre, flúor, iodo, ferro, manganês, molibdênio, selênio, zinco, etc.

[0102] Os exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, potássio, sódio, etc.

Processo de Fabricação

[0103] Em uma modalidade, os métodos descritos no presente documento compreendem administrar a um peixe, tal como um peixe Tilápia-do-nilo, e/ou colocar o intestino de um peixe, tal como a peixe Tilápia-do-nilo, em contato com uma composição descrita no presente documento. Em uma modalidade particular, a composição é um ingrediente em uma ração para peixes (isto é, uma ração em purê) conforme descrito no presente documento.

[0104] Em uma modalidade particular, os esporos bacterianos de acordo com a invenção são mesclados em um carreador de carbonato de cálcio (tal como no 1491 Vicron 45-3FG), para formar o produto (o alvo é, de preferência, 1x108 CFU/g a 1x1010 CFU/g, tal como, por exemplo, 1x109 CFU/g) a partir de um concentrado de esporo seco por aspersão inicial (usualmente a 5-9x109 a 5-9x1011 CFU/g, tal como, por exemplo, CFU/g 5-9x1010 CFU/g). Essa formulação é tipicamente estável sob condições secas por pelo menos 2 anos à RT (23 °C). Para uso, o produto é tipicamente suspenso 1:5 g/g a 1:20 g/g, tal como 1:10 g/g em, por exemplo, água ou óleo vegetal para fornecer uma suspensão de, por exemplo, 1x108 CFU/ml. Esse material é, de preferência, aspergido uniformemente nos péletes de ração pré-formados, por exemplo, a uma taxa de 5% a 20% em v/g, tal como uma taxa de 10% em v/g, e secos, por exemplo, de um dia para o outro a 21 a 30 °C. O nível recuperável resultante de esporos de acordo com a invenção nos péletes é, de preferência, 6-8 x 105 CFU/g de ração a 6- 8 x 108 CFU/g de ração, tal como, por exemplo, cerca de 6-8 x 106 CFU/g de ração. Em uma modalidade específica, a concentração bacteriana nos péletes de ração é de 1 x 105 CFU/g de ração a 8 x 108 CFU/g de ração, tal como de 1 x 105 CFU/g de ração a 8 x 105 CFU/g de ração, tal como de 8 x 105 CFU/g de ração a 1 x 106 CFU/g de ração, tal como de 1 x 106 CFU/g de ração a 1 x 107 CFU/g de ração, tal como de 1 x 107 CFU/g de ração a 1 x 108 CFU/g de ração, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0105] Em uma modalidade ainda mais particular, o purê de ração é peletizado. Os processos de peletização são conhecidos na técnica. Em uma modalidade particular, os péletes são fabricados través de um processo de peletização. Em outra modalidade, os péletes são fabricados através de um processo de extrusão.

[0106] Em uma modalidade, a mistura de ração (ração em purê) pode ser preparada misturando-se a composição que compreende a cepa bacteriana com componentes de ração desejados. Em uma modalidade particular, a ração em purê pode ser condicionada ou não condicionada.

[0107] Em uma modalidade, a ração em purê é condicionada antes do processo de peletização. Em uma modalidade particular, a ração em purê é levada a um condicionador, por exemplo, um misturador em cascata com injeção de vapor. A ração é, no condicionador, aquecida até uma temperatura especificada, tal como, por exemplo, 60 a 120 °C, por exemplo, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, 115 °C ou 120°C injetando-se vapor, medida na saída do condicionador. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4, horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8, horas, 9, horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas e até 24 horas e além. Em uma modalidade particular, a temperatura de processo durante o tratamento com vapor é pelo menos 60 °C. Em uma modalidade mais particular, a temperatura de processo durante o tratamento com vapor é pelo menos 70 °C. Em uma modalidade ainda mais particular, a temperatura de processo durante o tratamento com vapor é pelo menos 80 °C. Em uma modalidade mais particular, a temperatura de processo durante o tratamento com vapor é pelo menos 90 °C.

[0108] Em outra modalidade, o processo de peletização é um processo de extrusão. Os processos de extrusão típicos para fabricação de péletes de ração são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os produtos peletizados ou de extrusão, em que a mistura de ração (ração em purê) é pressionada em péletes ou sob pressão, são extrudados através de uma pequena abertura e cortados em partículas que são subsequentemente secas. Tais partículas têm usualmente um tamanho considerável devido ao material no qual a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com orifícios perfurados) define um limite na queda de pressão permissível através da abertura de extrusão. Também, pressões de extrusão muito altas ao se usar uma pequena abertura aumentam a geração de calor na ração em purê. (Michael S. Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; volume 71; páginas 140 a 142; Marcel Dekker).

[0109] Em uma modalidade particular, a ração em purê é levada a uma extrusora para formar péletes de comprimento variável a partir do extrudado. O aparelho de extrusão pode ser qualquer extrusora do tipo rosca conhecida na técnica. Em uma modalidade particular, a extrusora é uma extrusora de rosca dupla, por exemplo, uma extrusora Werner & Pfleiderer do tipo continua 37". Os parâmetros de extrusão (por exemplo, capacidade, velocidade da rosca, diâmetro de matriz, temperaturas de secagem, tempo de secagem, etc.) são dependentes do processo de extrusão particular e/ou aparelhos de extrusão empregados.

[0110] Em uma modalidade, a velocidade da rosca da extrusora é 1 a 1.000 RPM. Em uma modalidade mais particular, a velocidade da rosca da extrusora é 100 RPM. Em uma modalidade ainda mais particular, a velocidade da rosca da extrusora é 150 RPM. Em uma modalidade ainda mais particular, a velocidade da rosca da extrusora é 200 RPM. Em uma modalidade ainda mais particular, a velocidade da rosca da extrusora é 250 RPM. Em uma modalidade ainda mais particular, a velocidade da rosca da extrusora é 300 RPM.

[0111] Em uma modalidade, o diâmetro de matriz é 0,5 a 5,0 mm. Em uma modalidade mais particular, o diâmetro de matriz é 0,5 mm. Em uma modalidade ainda mais particular, o diâmetro de matriz é 1,0 mm. Em uma modalidade ainda mais particular, o diâmetro de matriz é 1,5 mm. Em uma modalidade ainda mais particular, o diâmetro de matriz é 2,0 mm.

[0112] Os péletes são colocados, então, secos por um tempo especificado, por exemplo, pelo menos 15 minutos, de preferência, 20 minutos, a temperaturas de 60 a 100°C, de preferência, 90 a 100 °C, mais preferencialmente, 90 °C, ainda mais preferencialmente 95 °C, ainda mais preferencialmente, 100 °C.

ASPECTOS PREFERENCIAIS

[0113] Um conjunto de aspectos preferenciais da invenção é dado no presente documento abaixo.

[0114] 1. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0115] 2. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0116] 3. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0117] 4. Cepa de Bacillus subtilis isolada caracterizada por ter uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos

99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para uso em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo.

[0118] 5. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 4 que tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium.

[0119] 6. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada para uso de acordo com o aspecto 5, em que a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas.

[0120] 7. Uma cepa de Bacillus subtilis isolada para uso de acordo com o aspecto 6, em que a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0121] 8. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 7, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes.

[0122] 9. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0123] 10. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 9, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecia a culturas de peixes, resulta na profilaxia de peixe melhorada, necessidade de antibióticos reduzida, custos de produção mais baixos e/ou condições ambientais melhoradas em culturas de peixes em comparação a culturas de peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0124] 11. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 10, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecida a culturas de peixes, resulta em uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos no sangue em circulação e/ou um aumento na lisozima plasmática nos ditos peixes em comparação aos peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0125] 12. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 11, em que a cepa de Bacillus subtilis resulta em uma sobrevivência de peixe de pelo menos 15% após 104 horas, tal como uma sobrevivência de peixe de pelo menos 20%, pelo menos 25% ou pelo menos 30% após 104 horas.

[0126] 13. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 12, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por pelo menos 2 dias, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 dias.

[0127] 14. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 12, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por até 100 dias, tal como até 90 dias, 80 dias, 70 dias, 60 dias ou 51 dias.

[0128] 15. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 12, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por 1 a 100 dias, tal como por 2 a 80 dias, 10 a 70 dias, 20 a 60 dias ou 28 a 51 dias.

[0129] 16. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 15, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,9x106 a 6,0x106 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0130] 17. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 15, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,1x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0131] 18. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 15, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrar, em de 0,1x106 a 0,5x106, de 0,5x106 a 1,0x106, de 1,0x106 a 2,0x106, de 2,0x106 a 3,0x106, de 3,0x106 a 4,0x106, de 4,0x106 a 5,0x106, de 5,0x106 a 6,0x106, de 6,0x106 a 7,0x106, de 7,0x106 a 8,0x106, de 8,0x106 a 9,0x106 ou de 9,0x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0132] 19. A cepa de Bacillus subtilis para uso de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 18, em que o uso resulta na sobrevivência de pelo menos 10% mais dos peixes em comparação a um grupo de controle de peixes, tal como sobrevivência pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, ou tal como pelo menos 70% mais alta, em que o grupo de controle não está recebendo a dita cepa de Bacillus subtilis isolada ou uma composição que compreende a dita cepa de Bacillus subtilis isolada.

[0133] 20. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0134] 21. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0135] 22. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0136] 23. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos

99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

[0137] 24. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 23, em que a cepa de Bacillus subtilis tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium.

[0138] 25. O uso de acordo com o aspecto 24, em que a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas.

[0139] 26. O use de acordo com o aspecto 25, em que a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0140] 27. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 26, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes.

[0141] 28. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 26, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0142] 29. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 28, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecia a culturas de peixes, resulta na profilaxia de peixe melhorada, necessidade de antibióticos reduzida, custos de produção mais baixos e/ou condições ambientais melhoradas em culturas de peixes em comparação a culturas de peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0143] 30. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 29, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecida a culturas de peixes, resulta em uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos no sangue em circulação e/ou um aumento na lisozima plasmática nos ditos peixes em comparação aos peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0144] 31. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 30, em que a cepa de Bacillus subtilis resulta em uma sobrevivência de peixe de pelo menos 15% após 104 horas, tal como uma sobrevivência de peixe de pelo menos 20%, pelo menos 25% ou pelo menos 30% após 104 horas.

[0145] 32. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 31, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por pelo menos 2 dias, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 dias.

[0146] 33. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 31, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por até 100 dias, tal como até 90 dias, 80 dias, 70 dias, 60 dias ou 51 dias.

[0147] 34. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 31, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por 1 a 100 dias, tal como por 2 a 80 dias, 10 a 70 dias, 20 a 60 dias ou 28 a 51 dias.

[0148] 35. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 34, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,9x106 a 6,0x106 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0149] 36. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 34, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,1x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0150] 37. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 34, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrar, em de 0,1x106 a 0,5x106, de 0,5x106 a 1,0x106, de 1,0x106 a 2,0x106, de 2,0x106 a 3,0x106, de 3,0x106 a 4,0x106, de 4,0x106 a 5,0x106, de 5,0x106 a 6,0x106, de 6,0x106 a 7,0x106, de 7,0x106 a 8,0x106, de 8,0x106 a 9,0x106 ou de 9,0x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0151] 38. O uso de acordo com qualquer um dos aspectos 20 a 37, em que o uso resulta na sobrevivência de pelo menos 10% mais dos peixes em comparação a um grupo de controle de peixes, tal como sobrevivência pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, ou tal como pelo menos 70% mais alta, em que o grupo de controle não está recebendo a dita cepa de Bacillus subtilis isolada ou uma composição que compreende a dita cepa de Bacillus subtilis isolada.

[0152] 39. Um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma ao dito peixe.

[0153] 40. Um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método ao dito peixe.

[0154] 41. Um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ao dito peixe.

[0155] 42. Um método para melhorar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia- do-nilo, que compreende a etapa de fornecer, tal como administrar, uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ao dito peixe.

[0156] 43. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 42, em que a cepa de Bacillus subtilis tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium.

[0157] 44. O método de acordo com o aspecto 43, em que a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas.

[0158] 45. O método de acordo com o aspecto 44, em que a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0159] 46. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 45, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes.

[0160] 47. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 45, em que a cepa de Bacillus subtilis é fornecida ao dito peixe pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0161] 48. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 47, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecia a culturas de peixes, resulta na profilaxia de peixe melhorada, necessidade de antibióticos reduzida, custos de produção mais baixos e/ou condições ambientais melhoradas em culturas de peixes em comparação a culturas de peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0162] 49. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 48, em que a cepa de Bacillus subtilis, quando fornecida a culturas de peixes, resulta em uma diminuição nos linfócitos, um aumento nos neutrófilos e monócitos no sangue em circulação e/ou um aumento na lisozima plasmática nos ditos peixes em comparação aos peixes que não receberam a dita cepa de Bacillus subtilis.

[0163] 50. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 49, em que a cepa de Bacillus subtilis resulta em uma sobrevivência de peixe de pelo menos 15% após 104 horas, tal como uma sobrevivência de peixe de pelo menos 20%, pelo menos 25% ou pelo menos 30% após 104 horas.

[0164] 51. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 50, em que o fornecimento, tal como administração, compreende um fornecimento, tal como administração, diário por pelo menos 2 dias, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 dias.

[0165] 52. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 50, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por até 100 dias, tal como até 90 dias, 80 dias, 70 dias, 60 dias ou 51 dias.

[0166] 53. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 50, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, diariamente por 1 a 100 dias, tal como por 2 a 80 dias, 10 a 70 dias, 20 a 60 dias ou 28 a 51 dias.

[0167] 54. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 53, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,9x106 a 6,0x106 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0168] 55. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 53, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrada, em uma dose diária de 0,1x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0169] 56. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 53, em que a dita cepa de Bacillus subtilis é fornecida, tal como administrar, em de 0,1x106 a 0,5x106, de 0,5x106 a 1,0x106, de 1,0x106 a 2,0x106, de 2,0x106 a 3,0x106, de 3,0x106 a 4,0x106, de 4,0x106 a 5,0x106, de 5,0x106 a 6,0x106, de 6,0x106 a 7,0x106, de 7,0x106 a 8,0x106, de 8,0x106 a 9,0x106 ou de 9,0x106 a 1,0x107 CFU da cepa de Bacillus subtilis por peixe, tal como por Tilápia-do-nilo.

[0170] 57. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 39 a 56, em que o tratamento resulta na sobrevivência de pelo menos 10% mais dos camarões em comparação ao grupo de controle de peixes, tal como sobrevivência pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, ou tal como pelo menos 70% mais alta, em que o grupo de controle não está recebendo a dita cepa de Bacillus subtilis isolada ou uma composição que compreende a dita cepa de Bacillus subtilis isolada.

[0171] 58. Uma composição que compreende uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma e um carreador, em que a composição é uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes.

[0172] 59. Uma composição que compreende uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, e um carreador, em que a composição é uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes.

[0173] 60. A composição de acordo com o aspecto 58 ou 59, em que a cepa de Bacillus subtilis tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium.

[0174] 61. A composição de acordo com o aspecto 60, em que a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus,

Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas.

[0175] 62. A composição de acordo com o aspecto 61, em que a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

[0176] 63. A composição de acordo com o aspecto 58 ou 62, em que a cepa de Bacillus subtilis isolada está em forma de esporo.

[0177] 64. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 63, em que o carreador é selecionado a partir do grupo que consiste em líquidos, pastas fluidas e/ou sólidos.

[0178] 65. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 64, em que o carreador é um carreador líquido que é selecionado a partir do grupo que consiste em: água, soluções aquosas e soluções não aquosas.

[0179] 66. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 65, em que o carreador é um sólido que é selecionado a partir do grupo que consiste em: um pó, um pó molhável, um pó seco, um grânulo, carbonato de cálcio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, turfa, trigo, joio de trigo, palha de trigo moída, farelo, vermiculita, celulose, amido, solo (pasteurizado ou não pasteurizado), gipsita, talco, argila (por exemplo, caulim, bentonita, montmorilonita) e gel de sílica.

[0180] 67. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 66, em que a composição é uma ração para Tilápia-do- nilo ou um aditivo de ração para Tilápia-do-nilo.

[0181] 68. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 67, em que a ração para peixes são péletes de ração para peixes, tais como péletes de ração que afundam ou péletes extrudados, tais como péletes flutuantes.

[0182] 69. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 68, em que os péletes de ração para peixes têm a superfície revestida com a cepa de Bacillus subtilis.

[0183] 70. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 69, em que os péletes de ração para peixes têm a superfície revestida em ração para peixes padrão com a cepa de Bacillus subtilis na forma de esporos.

[0184] 71. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 58 a 70, em que a composição compreende de 104 a 108 CFU/g de ração, tal como de 105 a 107 CFU/g de ração, ou tal como de 5 x 106 a 9 x 106 CFU/g de ração da cepa de Bacillus subtilis.

EXEMPLOS Exemplo 1 Depósito de Material Biológico

[0185] O seguinte material biológico foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, EUA, e recebeu o seguinte número de acesso: Depósito Número Data de de Acesso Depósito Bacillus NRRL B- 8 de subtilis O14VRQ 67221 janeiro de 2016 Bacillus NRRL B- 30 de subtilis NZ86 50136 maio de 2008

[0186] A cepa de Bacillus subtilis O14VRQ foi isolada de uma amostra de solo de Virginia, EUA em 5 de maio de 2006 por Michael Frodyma da Novozymes North America Inc.

[0187] A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente a uma pessoa determinada pelas leis de patentes estrangeiras como tendo direito ao mesmo. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como requerido por leis de patentes estrangeiras em países em que as contrapartidas do pedido em questão, ou sua descendência sejam depositadas. No entanto, deve-se entender que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental. Exemplo 2 Quantificação com qPCR das cepas de DFM no intestino de Tilápia Quantificação de Bacillus subtilis no intestino de tilápia

[0188] A extração e quantificação de DNA foram realizadas por procedimentos de extração de DNA padrão (por exemplo, kit de extração de DNA Qiagen PowerLyzer/PowerSoil). As análises por RT- qPCR para quantificar a presença de cepas de B. subtilis NZ86 e O14VRQ totais no intestino inteiro de tilápia, antes e depois da suplementação com qualquer uma das cepas de Bacilli, são mostradas na Tabela 1 e Tabela 2. Tabela 1. Iniciadores e sondas customizados específicos para as cepas NZ86 e O14VRQ de Bacillus subtilis para análise por RT-qPCR.

NZ86 O14VRQ Iniciador CTGTTCTCATGAACTGGGG CCCTTGGGTAATGCTATGTAA direto C AGG (5' – 3') (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 5) Iniciador GCTAACTCTGCAGGTACCC GATGGCTTTCCACAGCGATGG reverso C (SEQ ID NO: 6) (5' – 3') (SEQ ID NO: 3)

NZ86 O14VRQ Sonda AAGGTCGAAGTTGAGGCAA CAACCCCACTAGACCCTCAAT (5'- A AAAGC 6FAM/3'- (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 7) BHQ1) Tabela 2 Quantificação bacteriana das cepas de Bacillus subtilis totais no intestino de Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) após a análise por RT-qPCR. Os valores são média ± padrão de desvio.

Dia 51, Concentração Tratamentos (CFU g-1) Controle ND NZ86 1,07 ± 0,2 x 104 O14VRQ 1,23 ± 0,3 x 103 ND, não detectada Exemplo 3 Melhoramento de O14VRQ de B. subtilis em Mecanismos de Defesa Imunológica no Sangue do Peixe Tilápia-do-Nilo

[0189] Três tanques por tratamento, com 20 peixes Tilápia- do-nilo em cada tanque de 352,39 litros (80 galões), foram usados para comparar níveis de leucócitos no sangue periférico após respectivamente 14 e 28 dias. Todas as Tilápias-do-nilo foram alimentados com quantidades padrão de péletes de ração para peixes comerciais que foram tratados com a cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 (O14VRQ) ou NRRL B-50136 por aspersão de superfície diretamente no pélete de ração 24 horas antes da alimentação ou que foram alimentados com quantidades padrão não tratadas de péletes de ração para peixes comerciais. Especificamente, uma suspensão de esporos em água da bactéria de tratamento foi preparada a uma concentração preferencial de 1,0 x 107 CFU/g de ração. A suspensão foi aspergida uniformemente em péletes de ração secos (que afundam) a uma taxa preferencial de 1,0 ml de suspensão de esporos a 10,0 g de péletes de ração e deixada secar de um dia para o outro a 23 °C. A concentração bacteriana recuperável resultante nos péletes foi 0,9 a 1,2 x 107 CFU/g de ração. Os péletes tratados foram adicionados a cada tanque especificado a uma taxa de 3% (em p/p) do peso corporal da Tilápia-do-nilo por dia. Para todos os peixes neste estudo, a inoculação alvo foi uma média de 4,8 g de ração/peixe/dia ou 4,8 x 107 CFU/peixe por dia. No início do teste (Tempo 0 h), todos os peixes (100%) estavam saudáveis e eram similares em tamanho.

[0190] Nos dias 14 e 28, os níveis de leucócito no sangue periférico da Tilápia-do-nilo foram medidos.

[0191] A Tabela 3 mostra a porcentagem de níveis de leucócito no sangue periférico da Tilápia-do-nilo alimentada com a cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 (O14VRQ) ou NRRL B-50136 (NZ86) nos dias 14 e 28 em comparação a m controle.

Dia 14 Tipos de célula Controle NRRL B-50136 O14VRQ Linfócitos, % 82,8 86,0 80,8 Neutrófilos, % 8,58a,b 5,75a 12,4b Monócitos, % 8,33 7,67 6,75 Eosinófilos, % 0,25 0,50 0,17 Dia 28 Controle NRRL B-50136 O14VRQ

Linfócitos, % 88,9a 92,5a 81,7b Neutrófilos, % 6,92a 4,33a 12,1b Monócitos, % 3,92a,b 2,92a 5,50b Eosinófilos, % 0,25 0,25 0,75 Valores expressos como médias abc As letras sobrescritas na mesma linha indicam diferenças significativas entre grupos (P < 0,05) após o teste de HSD de Tukey.

[0192] A porcentagem de neutrófilos no sangue periférico é significativamente aumentada pela alimentação de O14VRQ de B. subtilis no dia 14 e ainda mais significativamente no dia 28, em comparação à NRRL B-50136 de B. subtilis e ao controle. Adicionalmente, no dia 28, os monócitos são também significativamente melhorados por O14VRQ. Exemplo 4 Melhoramento dos Mecanismos de Defesa Imunológica no Rim ou Baço após a alimentação com O14VRQ de B. subtilis.

[0193] As Tilápias-do-nilo foram tratadas de acordo com o exemplo 2. O perfil de leucócitos no sangue do rim e baço foi medido para a Tilápia-do-nilo tratada como uma medida para o mecanismo de defesa imunológica.

[0194] A Tabela 4 mostra o perfil de leucócitos no sangue do rim e baço para Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) sob diferentes dietas probióticas de Bacillus subtilis. n=9 por grupo.

Células Positivas para MFI de Células RHO (%) Positivas para RHO Tratamentos HKL SL HKL SL Controle 90,9 27,2a,b 380 46,4a.b NZ86 (NRRL B- 90,7 23,8a 387 32,5a 50136)

Células Positivas para MFI de Células RHO (%) Positivas para RHO O14VRQ 94,0 48,5b 475 69,4b Valores expressos como médias ab As letras sobrescritas na mesma linha indicam diferenças significativas entre grupos (P < 0,05) após o teste de HSD de Tukey.

[0195] Um aumento na proporção de células positivas para rodamina (RHO) e na intensidade de fluorescência média (MFI) de leucócitos do rim cefálico e baço estimulados por PMA (acetato miristato de forbol) (HKL e SL, respectivamente) foi observado na Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) após a suplementação de O14VRQ de B. subtilis probiótica (n=9). Isso demonstra a capacidade significativa de O14VRQ de B. subtilis para aumentar a porcentagem de Células Positivas para RHO em comparação à cepa de B. subtilis NZ86 (NRRL B-50136) e ao controle. Exemplo 5 Melhoramento de teor de Neutrófilo e Lisozima no sangue após a alimentação com O14VRQ de B. subtilis.

[0196] As Tilápias-do-nilo foram tratadas de acordo com o exemplo 3, e a proporção dos níveis de neutrófilo nas células sanguíneas nos peixes Tilápia foi medida no dia 28. A proporção dos níveis de lisozima foi medida nos dias 14 e 51, respectivamente.

[0197] A Figura 1 ilustra a proporção dos níveis de neutrófilo e lisozima nas células sanguíneas dos peixes Tilápia em relação aos mesmos níveis em Tilápia-do-nilo não tratada (controle).

[0198] Os resultados mostraram um aumento significativo na proporção de níveis de neutrófilo e lisozima nas células sanguíneas nos peixes Tilápia no dia 28 (neutrófilo) e nos dias 14 e 51 (lisozima) após a alimentação com O14VRQ de B. subtilis.

Exemplo 6 Expressão de mRNA de citocina pró-inflamatória do intestino médio da Tilápia-do-nilo

[0199] Os peixes Tilápia-do-nilo foram alimentados com O14VRQ de B. subtilis por 51 dias, em tal tempo, a expressão de mRNA das citocinas pró-inflamatórias IL-1B, TNFa, e actB foi quantitativamente avaliada por RT-qPCR com o uso de iniciadores e sondas específicos para essas citocinas conforme mostrado na Tabela 5. Tabela 5. Iniciadores e sondas específicos para os genes de Oreochromis niloticus para análises por RT-qPCR TNF-α IL-1β actβ Iniciador ATAGCTTCTCAGA GGCATCAAAGGCA CTCCATCGTC direto CCACGGC CAAACCTC CACCGCAAA (5' – 3') (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 14) Iniciador GCAAACACGCCA GGTGTCGCGTTTG CTGCGCCTG inverso AAGAAGGT TAGAAGAG AGTTGTGTAT (5' – 3') (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 12) G (SEQ ID NO: 15) Sonda CACGCTGTGGAC CAAGCCAACCCTC CAAACGCCC (5'FAM/ZE GGAAACCAAC CACCTGGAG AACAACTTCA N/ (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 13) GCTCT 3'IBFQ) (SEQ ID NO: 16)

TNF-α IL-1β actβ Tamanho de amplicon 145 150 131 (pares de bases) Número XM_00344312 AY428948.1 KF747686.1 de acesso 7.4 Extração de RNA, síntese de cDNA e RT-qPCR

[0200] Aproximadamente 50 mg do intestino médio foram removidos na necrópsia da tilápia (n=9) no dia 51 e colocados em 1 ml de RNA posteriormente (Sigma) e armazenados a -20 °C. As amostras foram removidas do RNA posteriormente, cortadas em pedaços menores e colocadas em tampão RLT (Qiagen, Germantown, MD, EUA) para extração de RNA. Os tecidos foram homogeneizados com o uso de um homogeneizador Omni TH (Omni International, Kennesaw, GA, EUA) em velocidade média por 1 minuto. A suspensão resultante foi adicionalmente quebrada, passando-se o lisado através de uma agulha 23G fixada a uma seringa estéril de 3 ml. O RNA total foi extraído dos diferentes tecidos com o uso do minikit RNeasy (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. Durante o processo de extração, as amostras foram tratadas com DNase (NEB, Ipswich, MA, EUA) para eliminar DNA genômico nas colunas. As concentrações de RNA total foram medidas pelo uso de um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Apenas RNA com uma razão de 260/280 acima de 1,9 foi usado para síntese de cDNA. As amostras de RNA foram armazenados a -80 °C. O DNA de complementaridade foi sintetizado a partir de mRNA (1 µg) com o uso do kit de transcrição reversa de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific)

seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram diluídas a 5 ng/µl com água isenta de nuclease (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) e armazenadas a -20 °C.

[0201] A ferramenta NCBI primer-BLAST foi usada para projetar iniciadores e sondas de interleucina-1beta (IL-1β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e beta–actina (actβ), com sequências que abrangem regiões de éxon-éxon (Tabela 5). A análise de expressão de gene foi executada através de RT-qPCR em um volume de amostra total de 10 µl, contendo iniciadores diretos e reversos 300 nM (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), sonda de 6-carboxifluoresceína (FAM) 150 nM (Integrated DNA Technologies) e 2x Primetime Gene Expression Master Mix e 12,5 ng de cDNA. Todas as amostras foram executadas em triplicata em um Sistema CFX Connect em tempo real (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). As amostras foram aquecidas até 95 °C por 3 min uma vez, e, então, 38 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 55 °C por 1 min. Os valores de ciclo quantitativo (Cq) resultantes foram automaticamente determinados pelo instrumento termociclador. Nenhuma amostra de controle de modelo (NTC) foi incluída para cada par de iniciadores e combinação de sondas para descartar contaminação de DNA. A expressão dos genes imunológicos foi normalizada com o uso do gene de referência para actβ na dieta de controle de não tratamento.

[0202] A Figura 2 mostra a expressão das citocinas pró- inflamatórias TNFα e IL-1β no intestino médio da Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) após suplementação probiótica por 51 dias. O presente trabalho mostrou que a funcionalidade do intestino da tilápia foi influenciada imunologicamente após a administração das cepas de B. subtilis O14VRQ e NZ86. Tal suplementação resultou em níveis elevados das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α, em que o efeito intensificado foi significativo (p < 0,05) com dieta O14VRQ. Essas citocinas são marcadores biológicos que promovem respostas inflamatórias durante o evento de invasão ou colonização do intestino. A suplementação dietária da tilápia com a cepa O14VRQ resultou em contagens probióticas temporárias menores. Parece, assim, que o intestino da tilápia é mais sensível no nível de expressão de gene a sua cepa probiótica de B. subtilis. A suplementação dietária com probióticos pode levar a um nível de expressão de gene imunológico aumentado no intestino, conforme evidenciado em outro estudo com o uso de Pediococcus acidilactici na tilápia. A abundância das duas citocinas levaria ao recrutamento de mais células linfoides ao sítio de colonização/invasão. Os níveis aumentados dessas citocinas estão associados a respostas inflamatórias crescentemente reguladas, com recrutamento de células fagocíticas ao intestino. O trabalho de microscopia deste estudo demonstrou um ligeiro aumento nos linfócitos intraepiteliais (IEL) após suplementação com O14VRQ (dados não mostrados). A implicação de todos esses seria que a cepa de B. subtilis O14VRQ parece resultar em um estado mais alto de imunidade no nível de intestino, em relação à cepa NZ86, o que poderia ser benéfico contra insultos patogênicos. Exemplo 7 Sumário do melhoramento bacteriano de DFM

[0203] aUma compilação de melhoramentos imunológicos fornecidos por uma ou ambas as bactérias DFM (Micróbio de Alimentação Direta) testadas é fornecida na Tabela 6. Ambas as cepas testadas têm a capacidade para melhoramentos significativos de parâmetros de imunidade específicos embora ocasionalmente diferentes.

Tabela 6. Sumário dos resultados imunológicos observados a partir da suplementação da Tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) com endósporos de Bacillus subtilis por 51 dias

Parâmetro de Cepa de Cepa Imunidade Inata B. subtilis O14VRQ de B. subtilis NZ86 (NRRL (NRRL B-50136) B-67221) Lisozima √* √* Plasmática Atividade √ √* Complementar Alternativa Neutrófilos no √* sangue periférico Explosão Fagocítica e Respiratória: √ √ leucócitos de rim cefálico e baço Níveis de expressão de TNF-α e IL-1β: √* √ intestino * denota significância estatística (p<0,05)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de Bacillus subtilis isolada que é ser a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B- 67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

2. Cepa de Bacillus subtilis isolada que é ser a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B- 67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para uso em um método para aumentar o peso do peixe Tilápia-do-nilo, melhorar a saúde geral do intestino do peixe Tilápia-do-nilo e/ou melhorar a resposta imunológica de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

3. Cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para uso em um método para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

4. Cepa de Bacillus subtilis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, que tem atividade contra patógenos, tais como uma ou mais cepas de Vibrio e/ou cepas de Photobacterium.

5. Cepa de Bacillus subtilis, de acordo com a reivindicação 4, em que a cepa de Vibrio é selecionada a partir do grupo que consiste em Vibrio fischeri, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ou qualquer combinação das mesmas.

6. Cepa de Bacillus subtilis, de acordo com a reivindicação 5, em que a cepa de Vibrio é Vibrio parahaemolyticus.

7. Cepa de Bacillus subtilis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a cepa de Bacillus subtilis resulta em uma sobrevivência de peixe de pelo menos 15% após 104 horas, tal como uma sobrevivência de peixe de pelo menos 20%, pelo menos 25% ou pelo menos 30% após 104 horas.

8. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem número de acesso ao depósito NRRL B- 67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

9. Uso de uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos 99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 para melhorar o bem-estar, condição geral, saúde e/ou rendimentos de peixes, tais como o peixe Tilápia-do-nilo.

10. Composição que compreende uma cepa de Bacillus subtilis isolada que é a cepa de Bacillus subtilis O14VRQ que tem o número de acesso ao depósito NRRL B-67221 ou uma cepa que tem as características de identificação da cepa de Bacillus subtilis NRRL B-67221 ou um mutante da mesma e um carreador, em que a composição é uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes.

11. Composição que compreende uma cepa de Bacillus subtilis isolada que tem uma sequência de 16S rDNA que tem pelo menos 98,00%, por exemplo, pelo menos 98,05%, pelo menos 98,10%, pelo menos 98,15%, pelo menos 98,20%, pelo menos 98,25%, pelo menos 98,30%, pelo menos 98,35%, pelo menos 98,40%, pelo menos 98,45%, pelo menos 98,50%, pelo menos 98,55%, pelo menos 98,60%, pelo menos 98,65%, pelo menos 98,70%, pelo menos 98,75%, pelo menos 98,80%, pelo menos 98,85%, pelo menos 98,90%, pelo menos 98,95%, pelo menos 99,00%, pelo menos 99,05%, pelo menos 99,10%, pelo menos 99,15%, pelo menos 99,20%, pelo menos 99,25%, pelo menos 99,30%, pelo menos 99,35%, pelo menos 99,40%, pelo menos 99,45%, pelo menos 99,50%, pelo menos 99,55%, pelo menos 99,60%, pelo menos 99,65%, pelo menos 99,70%, pelo menos 99,75%, pelo menos 99,80%, pelo menos 99,85%, pelo menos

99,90%, pelo menos 99,95% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, e um carreador, em que a composição é uma ração para peixes ou um aditivo de ração para peixes.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a cepa de Bacillus subtilis isolada está em forma de esporo.

13. Composição, de acordo com qualquer das reivindicações 10, 11 ou 12, em que o carreador é selecionado a partir do grupo que consiste em líquidos, pastas fluidas e/ou sólidos.