CN116948890B - 一种抑制水产弧菌的复合微生态菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制水产弧菌的复合微生态菌剂及其制备方法，首先提供一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KC001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20222086。该菌株能够有效抑制多种常见水产弧菌，并且具有耐盐碱的优点。本发明还提供一种复合微生态菌剂，其包括枯草芽孢杆菌KC001菌剂、粪肠球菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉。该复合微生态菌剂可用于水产动物的弧菌病防治，可显著提高水体受弧菌污染情况下的水产动物存活率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生态菌剂技术领域，具体涉及一种抑制水产弧菌的复合微生态菌剂及其制备方法。
背景技术
弧菌为一类水产养殖业中较为常见的水生动物病原，其存活能力、感染速度、发病速度、死亡率和病原在饲养水体内的残留率均较强。由弧菌属细菌所引起的弧菌病是海水水产类常见疾病，鱼、虾幼苗养殖期间，容易受到弧菌病的危害，其主要症状为：病鱼、虾以体表溃疡为主要特征，严重时头部吻端、体表、出血腐烂，有时内脏器官病变明显。
由于弧菌分布广泛、感染发病迅速且病期久，导致弧菌病在预防和治疗上难度均较大，传统预防和治疗弧菌病的方式除了隔离病鱼、勤换水等方式以外，主要手段是抗生素防治。这是因为抗生素使用起来方便，便于操作，而且见效较快，疗效也较好。然而抗生素的大量使用不仅会导致抗生素滥用、容易导致细菌产生耐药性、影响生态环境，而且有些药物残留严重，还会最终影响人类的健康，不利于大水产养殖业的健康可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制水产弧菌的复合微生态菌剂及其制备方法，该复合微生态菌剂可用于水产动物的弧菌病防治，可显著提高水体受弧菌污染情况下的水产动物存活率。
为此，第一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌，其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KC001，于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO: M20222086。
本发明的第二方面提供一种枯草芽孢杆菌菌剂，其包含本发明第一方面所述的枯草芽孢杆菌KC001的发酵培养物。
在一些实施方式中，所述菌剂为液体菌剂或者固体菌剂。
在一些实施方式中，所述发酵培养物的制备方法包括：将所述枯草芽孢杆菌KC001接种于发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基包括玉米粉5-10 g/L，葡萄糖5-10 g/L，豆饼粉20-30 g/L，鱼粉0.5-1 g/L，碳酸钙10-15 g/L，硫酸铵0.1-0.5 g/L，磷酸氢二钾0.02-0.05 g/L，硫酸镁0.02-0.05 g/L，硫酸锰0.02-0.05 g/L。
在一些实施方式中，所述发酵培养基包括玉米粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，豆饼粉30g/L，鱼粉0.5 g/L，碳酸钙10 g/L，硫酸铵0.1 g/L，磷酸氢二钾0.02 g/L，硫酸镁0.02 g/L，硫酸锰0.02 g/L。
在一些实施方式中，所述发酵培养的温度为28-37℃，培养时间为16-32小时。
在一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌KC001在接种于发酵培养基之前经过菌种活化步骤。
在一些实施方式中，所述菌剂还包括载体；所述载体选自玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉和甘蔗渣粉末中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方式中，所述菌剂的制备方法包括：将所述载体与所述发酵培养物混合均匀，经低温干燥制备得到。
本发明的第三方面，提供一种复合微生态菌剂，其包括本发明第二方面所述的枯草芽孢杆菌菌剂。
在一些实施方式中，所述复合微生态菌剂包括：本发明第二方面所述的枯草芽孢杆菌菌剂、粪肠球菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉。
在一些实施方式中，所述复合制剂按重量份数包括：本发明第二方面所述的枯草芽孢杆菌菌剂50-60份、所述粪肠球菌菌粉25-30份、所述地衣芽孢杆菌菌粉10-15份。
在一些实施方式中，所述复合制剂按重量份数包括：本发明第二方面所述的枯草芽孢杆菌菌剂50份、所述粪肠球菌菌粉30份、所述地衣芽孢杆菌菌粉10份。
在一些实施方式中，所述粪肠球菌菌粉中，活菌数为30×108-35×108CFU/g；所述地衣芽孢杆菌菌粉中，活菌数为30×108-35×108CFU/g。
本发明的第四方面，提供本发明第三方面所述的复合微生态菌剂的制备方法，其包括按重量份数称取各原料并且混合均匀，即制备得到所述复合微生态菌剂。
本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的枯草芽孢杆菌、本发明第二方面所述的枯草芽孢杆菌菌剂或本发明第三方面所述的复合微生态菌剂在以下(i)、(ii)或(iii)方面的应用：
(i)用于制备抑制弧菌生长的产品；
(ii)用于制备预防和/或治疗弧菌病的产品；
(iii)用于制备饲料添加剂。
在一些实施方式中，所述弧菌包括创伤弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和副溶血孤菌。
在一些实施方式中，所述饲料为水产动物养殖饲料。
在一些实施方式中，所述水产动物包括淡水养殖动物和海水养殖动物。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明筛选得到一株枯草芽孢杆菌KC001，该菌株能够有效抑制多种常见的水产弧菌，并且具有耐盐碱的性能，能够用于水产动物养殖过程中弧菌病的预防和治疗。本发明进一步提供了包含该枯草芽孢杆菌KC001菌剂的复合微生态菌剂，当其用于水产动物的弧菌防治时具有更为优异的技术效果，有望替代抗生素广泛应用于水产动物养殖中。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
本发明提供的枯草芽孢杆菌KC001分离自健康石斑鱼的肠道，经16S rDNA测序及鉴定，属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO: M20222086。
实施例2
本发明提供的枯草芽孢杆菌KC001对多种常见的水产弧菌具有抑制作用。
将枯草芽孢杆菌KC001经菌种活化后接种于LB液体培养基，于37℃培养12h，然后取培养得到的菌液，于3500rpm条件下离心10min，取100μL上清液进行牛津杯法抑菌试验。采用牛津杯法测定上述菌液对创伤弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血孤菌的体外抑菌效果。对抑菌圈进行观察并且测量直径，结果如表1所示。
表1 牛津杯法抑菌试验结果
上述实验结果表明，枯草芽孢杆菌KC001对包括创伤弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血孤菌在内的多种常见水产弧菌具有抑制作用。
实施例3
本实施例对枯草芽孢杆菌KC001的耐盐碱性能进行测试。
（1）将枯草芽孢杆菌KC001在LB平板上划线进行活化，然后接种于LB液体培养基中，37℃培养10 h，得种子液。按2%的接种量将种子液接种于NaCl浓度分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L、35 g/L、45 g/L的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养16小时，测定其OD600的吸光度值（每组三个平行）。根据检测结果，与采用NaCl浓度为10 g/L的培养基相比，枯草芽孢杆菌KC001在NaCl浓度为35 g/L的液体培养基中经过夜培养后菌液的OD600值更高，为前者的1.21倍，表明该菌株具有较佳的耐盐性能。
（2）将步骤（1）得到的种子液按2%接种量接种于pH分别为6.0、7.0、8.0、8.5的LB液体高盐培养基（NaCl浓度为35 g/L）中，37℃、200 rpm培养12小时，测定其OD600的吸光度值（每组三个平行）。根据检测结果，枯草芽孢杆菌KC001在上述pH值的LB高盐液体培养基培养后，OD600值无显著差异，表明该菌具有较宽的pH生长范围。
实施例4
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌KC001菌剂，其制备方法包括：
（1）将枯草芽孢杆菌KC001接种于斜面培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨15 g，酵母粉5g，氯化钠1 g，葡萄糖5 g，琼脂15 g，蒸馏水配至1000 mL，pH值为7.0），在37℃有氧条件下培养12 h，制备得到枯草芽孢杆菌菌落；
（2）将斜面培养的枯草芽孢杆菌菌落接种于种子培养基（蛋白胨15 g，牛肉膏2 g，氯化钠1 g，蒸馏水配至1000 mL，pH值为7.0），在37℃有氧条件下培养12 h，制备得到枯草芽孢杆菌种子液；
（3）将枯草芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：玉米粉5 g，葡萄糖5 g，豆饼粉30 g，鱼粉0.5 g，碳酸钙10 g，硫酸铵0.1 g，磷酸氢二钾0.02 g，硫酸镁0.02 g，硫酸锰0.02 g，蒸馏水配至1000 mL，pH值为7.0；在37℃有氧条件下发酵16 h，制备得到枯草芽孢杆菌发酵液，调整有效活菌数为1×109 CFU/mL，将其作为枯草芽孢杆菌菌液，并用于后续步骤；
（4）将枯草芽孢杆菌菌液与经杀菌处理后的小麦麦麸粉进行喷雾搅拌混合，其中麦麸粉的质量（以kg计）与枯草芽孢杆菌菌液的体积（以L计）的比例为3:1，低温干燥至水分含量约为20%，即制备得到枯草芽孢杆菌KC001菌剂，将其用于后续实施例中复合微生态菌剂的制备。
实施例5
本实施例提供一种复合微生态菌剂I-1，按重量份数计其原料组成为：枯草芽孢杆菌KC001菌剂50份、粪肠球菌菌粉30份、地衣芽孢杆菌菌粉10份；其中，粪肠球菌菌粉中活菌数为30×108 CFU/g，地衣芽孢杆菌菌粉中活菌数为30×108 CFU/g。
通过将上述原料混合均匀，即制备得到复合微生态菌剂I-1。
实施例6
本实施例提供一种复合微生态菌剂I-2，按重量份数计其原料组成为：枯草芽孢杆菌KC001菌剂50份、粪肠球菌菌粉30份、地衣芽孢杆菌菌粉15份；其中，粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉中活菌数与实施例5中相同。
通过将上述原料混合均匀，即制备得到复合微生态菌剂I-2。
实施例7
本实施例提供一种复合微生态菌剂I-3，按重量份数计其原料组成为：枯草芽孢杆菌KC001菌剂50份、粪肠球菌菌粉25份、地衣芽孢杆菌菌粉10份；其中，粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉中活菌数与实施例5中相同。
通过将上述原料混合均匀，即制备得到复合微生态菌剂I-3。
实验例1
选用健康凡纳滨对虾，体长10~12 cm，随机分为5个处理组，每个处理组三个平行，每个平行100尾。处理组1投喂常规饲料，其他各组在该常规饲料的基础上添加以下成分：处理组2：添加0.1%（w/w）复合微生态菌剂I-1；处理组3：添加0.1%（w/w）实施例4制备得到的枯草芽孢杆菌KC001菌剂；处理组4：添加0.1%（w/w）对照添加剂1，该对照添加剂1与复合微生态菌剂I-1相比不含有枯草芽孢杆菌KC001菌剂；处理组5：添加0.1%（w/w）复合微生态菌剂I-3。
将上述各处理组按照相同的常规方法进行饲养，水源为砂滤海水，温度28~30℃，每个平行分别饲养在单独的玻璃纤维缸中，在试验的第30天统计每组对虾的存活情况；在试验的第30天，每个平行留下50只对虾，向缸中投入副溶血弧菌，使得养殖水体中副溶血弧菌的终浓度为2.5×107CFU/mL，以投入副溶血弧菌的当天为第0天，于第5天时统计对虾存活情况。计算各处理组的对虾存活率的平均值，结果如表1所示。
表1
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1. 一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KC001，于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO: M20222086。
2.一种枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌KC001的发酵培养物。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂或者固体菌剂。
4. 如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述发酵培养物的制备方法包括：将所述枯草芽孢杆菌KC001接种于发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基包括玉米粉5-10 g/L，葡萄糖5-10 g/L，豆饼粉20-30 g/L，鱼粉0.5-1 g/L，碳酸钙10-15 g/L，硫酸铵0.1-0.5 g/L，磷酸氢二钾0.02-0.05 g/L，硫酸镁0.02-0.05 g/L，硫酸锰0.02-0.05 g/L。
5.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂还包括载体；所述载体选自玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉和甘蔗渣粉末中的一种或两种以上的组合。
6.一种复合微生态菌剂，其特征在于，所述复合微生态菌剂由权利要求2-5任一项所述的枯草芽孢杆菌菌剂、粪肠球菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉组成。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2-5任一项所述的枯草芽孢杆菌菌剂或权利要求6所述的复合微生态菌剂在制备抑制弧菌生长的产品方面的应用；所述弧菌为创伤弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌或副溶血弧菌。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2-5任一项所述的枯草芽孢杆菌菌剂或权利要求6所述的复合微生态菌剂在制备预防弧菌病的产品方面的应用；所述弧菌为创伤弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌或副溶血弧菌。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2-5任一项所述的枯草芽孢杆菌菌剂或权利要求6所述的复合微生态菌剂在制备饲料添加剂方面的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述饲料为水产动物养殖饲料；所述水产动物包括淡水养殖动物和海水养殖动物。
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