CN112251370B - 含有枯草芽孢杆菌的复合微生态制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的复合微生态制剂及其在抑制水产病原弧菌中的应用，属于水产微生态领域。本发明将筛选到的枯草芽孢杆菌发酵液和壳寡糖配合，对水产病原弧菌：鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等具有良好的抑制作用，抑制作用显著高于单株枯草芽孢杆菌11#或者单独的壳寡糖，具有明显的协同效果。

Description

含有枯草芽孢杆菌的复合微生态制剂及其应用
技术领域
本发明属于水产微生态领域，特别涉及一种含有枯草芽孢杆菌的 复合微生态制剂及其应用。
背景技术
弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，该病在全世界范 围内广泛发生，其发病率高，危害大，不仅给对虾还给鱼类、贝类、 其他甲壳类等海水养殖生物造成危害。弧菌病的防治一般采用细菌素 和消毒剂等化学类药物治疗，但药物残留和抗药性易造成环境污染， 给人类带来危害。应用较多的噬菌蛭弧菌类制剂已被明令禁止，人们 开始探索更多可以用于弧菌防治的有益菌。
微生态制剂在改善动物机体健康，促进动物生长，提高动物免疫 力，改善调节水质等方面具有良好作用，同时，其绿色环保、无毒副 作用、无残留污染等优点使其成为抗生素最有潜力的替代品。芽孢杆 菌类(Bacillus.sp)细菌具有抗逆性好，生长迅速，适应能力强大能 够产生丰富多样的抗菌物质等优点，是一种理想的益生菌筛选对象。
免疫增强剂可以提高动物免疫能力的制剂，或调节动物免疫系统 并激活免疫功能、增强机体对细菌和病毒等传染性病原体抵抗能力， 目前研究和应用最多的是多糖类和寡糖类这两大类功能性糖类。壳寡 糖是一种具有水溶性好、调节肠道微生态，增强免疫力的新型免疫增 强剂，且相较于其他寡糖，其在较低使用浓度下就具有较好的抑菌能 力，已被广泛应用于食品工业和畜牧业生产，但在水产上的应用及研 究较少。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种含有枯草芽孢杆菌的复合微 生态制剂及其应用
首先，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株， 其保藏编号为CGMCC No.12194。
本发明的枯草芽孢杆菌分离自南美白对虾养殖池塘底泥及水体， 利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提 取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上 游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(SEQ ID No.2)和下游引物5’-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3’(SEQ ID No.3)扩增细 菌16s rRNA基因片段。经过测序得到该菌属于枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。
将筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)命名为11#，于2016 年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 保藏编号为：CGMCC No.12194。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌的发酵方法，采用液体发酵培养 基，培养基组成：蔗糖15-25g/L，酵母粉0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾 0.5-1.5g/L，L-谷氨酸钠3-8g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5 g/L，硫酸锰5.2×10-3g/L，七水合硫酸铜0.15×10-3g/L，七水合硫 酸亚铁0.17×10-3g/L；发酵条件：温度28-40℃，搅拌速率50-150r/min， 通气比：1:0.35，培养时间16-24h，培养密度为1.0×108～109cfu/mL。
本发明还提供一种水产微生态制剂，其含有所述的枯草芽孢杆菌 和壳寡糖。
优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌的发酵液。更优选的， 所述的枯草芽孢杆菌的发酵液根据前述的发酵方法制备。
其中，所述的枯草芽孢杆菌11#和壳寡糖的的体积质量比为 10:1-2。
本发明还提供含有所述的枯草芽孢杆菌或者所述的水产微生态 制剂的预混料或者饲料。
本发明还提供所述的枯草芽孢杆菌或者所述的水产微生态制剂 在制备抑制水产病原弧菌药物中的应用。
具体的，包括利用该菌株或者复合微生态制剂制备成水产病原弧 菌的抑制剂，或是制备成预防弧菌病的制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本发明的枯草芽孢杆菌11#对水产病原弧菌具有良好的抑制 作用，可以作为抗生素和噬菌蛭弧菌的替代品，具有良好的应用前景。
2)本发明的枯草芽孢杆菌11#对环境和养殖动物友好，不会产 生药物残留和耐药性问题。
3)本发明的枯草芽孢杆菌11#发酵液和壳寡糖复配后使用，对 弧菌的抑制作用显著高于单株枯草芽孢杆菌11#或者单独的壳寡糖， 具有明显的协同效果。
附图说明
图1为11#，H8-1(CGMCC No.9356)，5#(CGMCC No.9357)， DBN14101(CGMCCNo.10055)，2#(CGMCC No.13011)，10# (CGMCC No.13010)及副溶血弧菌抑菌能力对比。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1枯草芽孢杆菌11#的分离鉴定
菌种的分离
从江苏南美白对虾养殖池塘采集底泥以及水样样品。用无菌水将 底泥和水样样品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪从每个稀释度取 100μl涂布LB平板，将平板倒置于37℃培养箱，培养24h。挑选不 同形态的菌落接种LB平板分离纯化。
菌株筛选
用牛津杯法对所得菌株进行抑菌能力测定，经过大量分选，得到 一株对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)哈维弧菌(VibrioHarveyi)具有良好抑制能力的菌 株，命名为11#，具体操作如下：
将11#和溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌分别接种到LB液体 培养基，37℃，180rpm振荡培养24h，取致病菌菌液加入软琼脂LB 培养基中，倒入放置了牛津杯的平板上，待琼脂凝固后，取下牛津杯， 每孔加菌液100μl，以无菌水做对照，28℃放置24h后测量抑菌圈直 径。结果如表1所示。结果表明，菌株11#具有良好的抑制水产病原 弧菌的能力。
表1不同病原菌的抑菌圈直径
指示菌 抑菌圈直径(mm)
哈维弧菌 28
溶藻弧菌 32
副溶血弧菌 26
与已保藏菌株抑菌能力对比
将11#，H8-1(CGMCC No.9356)，5#(CGMCC No.9357)， DBN14101(CGMCCNo.10055)，2#(CGMCC No.13011)，10# (CGMCC No.13010)及副溶血弧菌接种到LB液体培养基中，37℃， 180rpm振荡培养24h，取副溶血弧菌菌液加入软琼脂LB培养基中， 倒入放置了牛津杯的平板上，待琼脂凝固后，取下牛津杯，每孔加菌 液100μl，以无菌水做对照，28℃放置24h后观察抑菌效果，结果如 图1所示。结果表明，与已保藏菌株相比，11#具有更好的抑菌能力。
菌株鉴定
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌 DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序 列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTCAG-3’(SEQ ID No.2) 和下游引物5’-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3’(SEQ ID No.3)扩 增细菌16s rRNA基因片段(SEQ ID No.1)。经过测序得到该菌属于 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌在LB平板上呈白色，边缘不 整齐，表面较干燥。
该菌株已于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.12194。
实施例2枯草芽孢杆菌和壳寡糖复合微生态制剂的制备
(1)发酵培养基：蔗糖20g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L， L-谷氨酸钠5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰5.2 ×10-3g/L,七水合硫酸铜0.15×10-3g/L，七水合硫酸亚铁0.17×10-3 g/L；发酵条件：温度37℃，搅拌速率100r/min，通气比：1:0.35，培 养时间16-24h，培养密度为1.0×109cfu/mL；壳寡糖：含量≥95％； 混合比例：11#培养液：壳寡糖＝1000mL:50g
(2)发酵培养基：蔗糖20g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L， L-谷氨酸钠5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰5.2 ×10-3g/L,七水合硫酸铜0.15×10-3g/L，七水合硫酸亚铁0.17×10-3 g/L；发酵条件：温度37℃，搅拌速率100r/min，通气比：1:0.35，培 养时间16-24h，培养密度为1.0×1010cfu/mL；壳寡糖：含量≥95％； 混合比例：11#培养液：壳寡糖＝1000mL:100g。
实施例3复合菌剂在水产养殖池塘中的应用
试验地点在江苏如东南美白对虾养殖池塘。
塘水体面积1亩，平均水深1米，主养南美白对虾，共计放虾苗 8万。对照塘水体面积1亩，平均水深1米，放养密度和种类同试验 塘相当。两塘每天投喂量为1.5％，其他条件相当。试验塘共3口， 对照塘1口，共4口池塘，采用不同的试验处理。
表2试验塘和对照塘的处理方法
实验开始前，每个试验塘从四个角以及中心，水下约50cm处取 水样，按照10倍稀释的方法稀释至10-3，涂布TCBS平板，计数池 塘中溶藻弧菌以及副溶血弧菌数量，48h后，重复取样过程，并计数， 结果如表3。
从表中可以看出，使用复合菌液的池塘中，溶藻弧菌和副溶血弧 菌的抑制率分别为74.58％和53.02％，相较于只使用菌液的抑制率提 高了68.16％和39.86％，且高于使用菌液与使用壳寡糖池塘抑菌率之 和。
表3复合菌液对致病菌的抑制效果(cfu/ml)
类别 试验塘1 试验塘2 试验塘3 对照塘
0h时溶藻弧菌数量 4.13×103 4.25×103 4.98×103 4.17×103
48h时溶藻弧菌数量 1.05×103 2.34×103 4.28×103 4.15×103
抑制率 74.58％ 44.35％ 14.06％ 0
0h时副溶血弧菌数量 2.15×103 2.11×103 2.16×103 2.20×103
48h时副溶血弧菌数量 1.01×103 1.31×103 1.97×103 2.22×103
抑制率 53.02％ 37.91％ 8.80％ 0
实施例4复合微生态制剂的安全性评价
将复合微生态制剂用无菌水稀释后计数，将复合微生态制剂加入 饲养有斑马鱼和南美白对虾的桶中，使菌液终浓度分别为104、105、 106、107cfu/mL，浸泡2h，对照组加生理盐水，观察5天内是否有发 病及死亡现象。
结果发现5天内，斑马鱼和南美白对虾均无发病和死亡现象，说 明枯草芽孢杆菌11#和壳寡糖的复合微生态制剂无致病性。
尽管已经对上述各实施案例进行了描述，但本领域内的技术人员 一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施案例做出另外的变更和 修改，所以，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的 专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变 换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明 的专利保护范围之内。
序列表
<110> 福建大北农水产科技有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司，江苏大北农水产科技有限公司
<120> 含有枯草芽孢杆菌的复合微生态制剂及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
ccttcggcgg ctggctccta aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt 60
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120
gattactagc gattccagct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac 180
agatttgtgg gattggctta acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc 240
acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300
gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg 360
ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420
ccacctgtca ctctgccccc gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca 480
agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540
ggcccccgtc aattcctttg agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt 600
aatgcgttag ctgcagcact aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta 660
cggcgtggac taccagggta tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt 720
cagttacaga ccagagagtc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc 780
accgctacac gtggaattcc actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga 840
ccctccccgg ttgagccggg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgagccctt 900
tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960
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gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct 1200
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<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (1)

1.一种微生态制剂在制备水产养殖中抑制养殖水体中溶藻弧菌的产品中的应用，其特征在于，所述微生态制剂在水产养殖池塘中的使用量为1L/亩，使用时将所述微生态制剂先与30L塘水混合，均匀泼洒至所述水产养殖池塘中；
所述微生态制剂由枯草芽孢杆菌的发酵液和壳寡糖制成；
所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为：CGMCCNo.12194；
所述枯草芽孢杆菌发酵液与壳寡糖的体积质量比(ml：g)为10:0.5；
所述枯草芽孢杆菌的发酵液的活菌数为1.0×109cfu/mL；
所述枯草芽孢杆菌的发酵液通过如下液体发酵培养基和发酵条件制备：液体培养基含量及组成：蔗糖20g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，L-谷氨酸钠5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰5.2×10-3g/L，七水合硫酸铜0.15×10-3g/L，七水合硫酸亚铁0.17×10-3g/L；发酵条件：温度：37℃，搅拌速率：100r/min，通气比：1:0.35，培养时间：16-24h。
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