KR20110027535A - 바실러스균을 이용한 발효 대두박의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 대두박에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계; (b) 상기 열처리 된 대두박을 냉각하고 바실러스 균을 접종하는 단계; 및 (c) 상기 대두박에 접종된 균을 고체 배양하여 발효 대두박을 수득하는 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 발효 대두박에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 발효 대두박 생산에 필요한 우수한 특성을 가진 바실러스균, 구체적으로 바실러스 서브틸러스 TP6 균을 발효 균주로 이용함으로써, 본 발명에 의해 제조된 발효 대두박은 종래 대두박에 비하여 트립신 저해인자, 대두올리고당 및 다당류 등 다양한 항영양인자가 거의 완전히 소실되고 단백질 함량이 높을 뿐만 아니라 저분자화로 흡수율과 사료효율이 우수한 고품질의 식물성 단백질원이다. 특히 항영양인자 제거 기능이 우수한 TP6 균주를 이용하여 기존의 발효 대두박들에 비해 적은 시간을 발효하여 동등이상의 품질을 낼 수 있기 때문에 년간 생산량 향상성을 월등하게 향상 시킬 수 있다는 점에서 우수하다고 할 수 있다.

Description

바실러스균을 이용한 발효 대두박의 제조방법{Method for preparing a fermented soybean meal using Bacillus strains}

본 발명은 식물성 단백질원인 탈지 대두박의 품질을 개량 또는 개선하기 위한 저렴하고 효율적인 발효 대두박의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 발효 대두박에 관한 것이다.

인간에게 치명적인 질병을 일으키는 광우병 등의 질병이 사료에 첨가되는 동물성 단백질 성분에 기인한 결과로 판정되면서 전 세계적으로 사료에 첨가되는 동물성 단백질을 식물성 단백질로 대체하려는 움직임이 급속도로 진행되고 있다.

사료 시장에서 어분, 육골분 또는 혈장 등의 동물성 단백질의 대체품으로 사용중인, 식물성 단백질 원료 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 것은 탈지대두박(이하, "대두박"이라 함)이다. 우리나라에서 식물성 단백질 사료원으로 사용되는 대두박은 전체 사료의 60%를 차지하며 물량은 연간 200 만톤에 달하고 있다(2004년 한국단미사료 협회).

대두박의 대표적인 일반분석 값은 수분 9.5%, 조단백질 49.4%, 전화당 22.1% 및 수용성 질소 27.2%이다. 일반적으로 식물성 단백질은 동물성 단백질에 비하여 단백질 함량이 비교적 낮고, 가축에 필요한 필수 아미노산 조성이 동물성 단백질에 비하여 좋지 않으며 일부 비타민, 광물질 및 UGF(Unknown Growth Factor) 함량이 우수하지 못하다.

더욱이 대두박에는 여러 가지 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF)들이 함유되어 있어 사료로 이용되었을 경우 소화율이 저해되는 문제점이 있다. 그 중에서 대표적인 것은 트립신 저해인자(trypsin inhibitor, 이하, "TI"라 함)이며, 육상 동물에서 식이 TI는 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)의 적절한 효소기능을 방해하여 그 결과 대두 내에 존재하는 전체 단백질의 약 6%정도 이 용성을 저하시킨다. 특히 이러한 항영양인자의 영향은 어린 가축의 경우 현저하기 때문에 어린 가축용 사료에 첨가되는 대두박의 사용량을 제한하고 있다.

생대두박의 TI활성은 약 39 mg/g이지만, 탈지대두박은 제조공정에서 열처리 에 의하여 항영양인자가 파괴되어 상품으로 판매되는 탈지 대두박의 TI활성은 일반적으로 4 mg/g 이하이다. 따라서 육성비육돈이나 모돈에서는 피해가 적으나 자돈에서는 육성비육돈과 달리 대두박 내 항영양인자로 대두박의 사용에 제한을 받게 되므로 급여 단계별로 대체 단백질을 일부 사용해야 한다. 이런 이유로 농축대두 단백이나 정제대두단백과 같은 가공대두제품이 사료로 이용되어 유제품 위주의 사료를 급여 할 때와 유사한 사양성적을 얻고 있다.

현재 생산되고 있는 농축대두단백질(SPC), 분리대두단백질(SPI) 또는 가수분해 대두단백질 등과 같은 대두단백질 가공품은 물리화학적 처리 또는 효소 처리에 의하여 생산되는 것으로 주로 식품가공용으로 생산되는 것이며, 사료로 사용하기에는 고가이다.

따라서 대두박을 양질의 고단백질사료로 사용하기 위해서는 대두단백질의 품질을 향상시킬 수 있는 저렴하고 효율적이며 대량 처리가 가능한 새로운 가공방법의 개발이 요구된다. 더욱이 최근 지구 온난화 등의 지구 기후변화로 곡물 생산량이 감소되고 있어 사료의 주원료가 되는 옥수수 또는 대두박 등의 국제가격이 상승하여 사료산업과 축산농가에 큰 타격을 주고 있는 실정이므로 그 필요성은 더욱 증대 되고 있다.

대두박에는 전술한 TI 이외에 대두 올리고당(soy oligosaccharides)은 설사, 복통을 유발하고 대두 다당류(soy polysaccharides)는 영양성분의 흡수를 저해하는 것으로 알려져 있다. 사료에 대두박을 혼합한 경우 흔히 장염을 일으키는데 그 원인은 명확히 밝혀지지 않았으나 대두박 중의 알코올 가용성 다당류에 기인하는 것으로 추측되고 있다[Krogdahl, A. et al. Feeding atlantic Salmo salar L. soybean products. Aquac. Nutr. 6, 77-84, 200]. 또한 대두 다당류(soy polysaccharides)는 연어 등의 어류와 육계 병아리의 영양성분의 흡수를 저해 하는 것으로 보고되고 있다[Refstie, S. et al. Non-starch polysaccharides in soybean meals and effects on the absorption of nutrients in farmed Atlantic salmon and broiler chickens. Anim. Feed Sci. Technol. 79,331-3451999].

이에 최근에는 이러한 항영양인자 제거를 통한 고품질 사료를 제조하기 위한 방법들로 효소처리 대두단백 파이타제(phytase)를 이용하여 파이테이트를 제거한 제품: HP300(덴마크) - www.hamletprotein.com) 혹은 발효처리 대두단백 (한국특허등록 제10-0645284호, 한국특허등록 제10-0459240호, 한국특허등록 제 10-0925173호, Livestock Rearch for Rural Development 20(9) 2008) 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

이중에서도 발효처리 대두단백은 발효과정 중에서 다수의 항영양인자를 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 추가로 단백질이나 탄수화물을 소화가 쉬운 형태로 분해도 해주기 때문에 가장 소화흡수가 좋은 고품질의 사료용 단백소재라고 할 수 있다.

하지만 이러한 발효처리 과정의 경우 적정 수준 이상의 항영양인자 제거 효과를 얻기 위해서는 긴 발효시간을 필요로 한다(한국특허등록 제10-0645284호의 경우 36시간, 한국특허등록 제10-0459240호의 경우 48시간). 이와 같은 긴 발효시간은 제국기의 회전율을 낮게 하여 전체적인 원가상승을 초래한다. 이와 같이 종래의 기술들은 발효처리 대두박의 제조과정 중에 긴 발효시간이 요구되어 전체적인 원가상승을 일으키는 문제점이 있었다.

현재까지 바실러스 균, 특히 바실러스 서브틸러스 TP6 균을 이용하여 발효시간을 획기적으로 줄이면서 발효 대두박을 생산하는 연구결과는 보고된 바가 없으며, 특히 대두박의 고체발효 중에 바실러스 균이 생산하는 프로테아제와 기능성 다당류 및 상기 미생물의 프로바이오틱(probiotics)으로서 효능을 적극적으로 활용하는 제품 역시 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 단백질 사료원인 대두박의 개량 및 개선을 위한 발효 대두박의 생산 시스템 구축 및 효율적인 발효시간 감소를 통한 제품의 원가절감을 위하여 예의 노력한 결과, 대두박의 고체발효에 적합한 특성을 가진 발효 균주로서 바실러스 서브틸리스 TP6 균주를 채택하여 대두박을 고체 발효시킴으로써 단백질 함량의 증가와 단백질 품질의 상승, 대두단백질의 가수분해에 의한 저분자화, TI의 불활성화, 비소화성 다당류와 같은 항 영양인자의 함량 감소 등으로 인한 소화 흡수율과 사료효율 증가뿐만 아니라, 기존 발효처리 대두박의 문제점인 긴 발효시간이 획기적으로 개선된 고 품질의 발효 대두박을 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 항영양인자 제거능력 및 단백질 분해능력이 우수하여 발효처리 대두박 제조시 발효시간을 최대한으로 줄 일수 있는 바실러스 균주, 특히 TP6 균주를 이용한 고체발효법에 의한 발효 대두박의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 균을 이용하여 발효시킨 고품질의 발효 대두박을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조방법에 관한 것이다: (a) 대두박에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계; (b) 상기 열처리 된 대두박을 냉각한 후 바실러스 균을 접종하는 단계; 및 (c) 상기 대두박에 접종된 균을 고체 배양하여 발효 대두박을 수득하는 단계.

본 발명자들은 발효에 의하여 대두박의 품질을 개량 및 개선할 수 있는 동시에, 발효시간을 줄이기 위한 생산시스템을 구축하기 위하여 예의 노력한 결과, 발효 균주로서 바실러스 균을 채택하여 대두박을 고체 발효시킴으로써 상술한 문제점이 개선된 발효 대두박을 제조할 수 있음을 확인하였다.

발효 대두박을 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 대두박에 수분 첨가 및 열처리

본 발명의 방법에 이용되는 대두박은 최종 산물인 발효 대두박이 동일한 품질을 유지할 수 있도록, 동일한 지역에서 지속적으로 동일한 종류의 대두박을 공급받아 이를 이용하는 것이 바람직하나, 원료인 대두박의 품질의 차이에 따른 생산물인 발효 대두박의 차이는 원료상의 영양성분의 초기 함량에 따르는 생산물의 성분의 변화이며 발효 자체에는 큰 문제가 되지 않는다. 특히, 대두박의 종류에 따르는 단백질 함량의 차이는 최종 산물의 단백질 함량에 차이를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 이용되는 대두박은 단백질 함량이 높고 트립신 저해인자의 함량이 낮을수록 발효 대두박의 품질은 증가한다.

본 발명의 방법에 따르면, 원료인 대두박을 열처리하기 이전에 가수하는 공정이 필요하다. 즉, 원료 대두박은 고체 발효하기 전에 적당량의 물을 직접 분무, 혼합하여 수분함량을 조절한 다음 일정한 시간 동안 열처리한다. 이때 열처리의 목적은 원료 대두박 중의 잡균을 사멸시키는 동시에 대두 세포벽을 파괴하고 단백질을 변성시킴으로써 목적하는 미생물이 활발히 생육할 수 있는 화학조성을 제공해 주기 위한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 단계 (a)에 수분이 첨가된 대두박은 수분함량이 30 내지 80%(v/w)이고, 보다 바람직하게는 30 내지 70%(v/w)이며, 가장 바람직하게는 40 내지 60%(v/w)이다. 수분함량 범위 30 내지 80%(v/w)는 저 수분으로 인한 발효속도의 지연을 방지하고 대두박의 이송 및 발효 후 건조 공정에서 많은 비용이 드는 문제점의 개선 그리고 열효율 측면에서 바람직하다.

이어, 수분이 첨가된 대두박을 열처리한다. 열 처리 공정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 스팀(steam) 또는 과열수증기(superheated steam)를 이용하여 열처리하는 것이다.

본 발명의 방법에서 상기 단계 (a)의 열처리는 온도 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 60분 동안 증자하거나 200 내지 300℃의 과열수증기로 수초 내지 수분 간 단시간 열처리하는 것이며, 보다 바람직하게는 온도 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 30분 동안 증자하고, 가장 바람직하게는 80 내지 121.1℃의 스팀으로 10 내지 30분 동안 증자하는 것이다.

본 발명의 방법에서 열처리를 실시함에 있어서, 열처리 온도가 낮거나 처리시간이 짧은 경우에는 잡균의 살균 효과가 작거나 이후의 발효 공정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으며, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지는 경우에는 대두박 내 단백질의 변성으로 인한 소화율이 감소되어 최종제품의 품질이 떨어지는 문제점이 발생하므로, 이러한 문제점이 발생하지 않도록 열처리 온도 또는 처리시간을 채택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서 열처리 과정을 통하여, 대두박에 존재하는 오염균이 거의 사멸되고 다음 공정인 고체발효가 원활하게 진행되는 화학적 환경이 조성되는 효과가 있을 뿐만 아니라 소화율을 저해하는 TI가 약간 감소하는 효과도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 이전 또는 이후에 단백질 분해능이 우수한 바실러스 균을 선별하고 전배양하는 단계를 추가적으로 포함한다.

발효균주의 선별 및 전배양

고체발효에서는 일반적으로 고체기질의 수분함량이 낮기 때문에 저수분에서 잘 생육하는 아스퍼질러스 오리재 등과 같은 곰팡이가 주로 이용된다. 그러나 곰팡이로 대두박을 발효하는 경우, 생산된 발효 대두박의 성상이 사료로 사용하는데 적합하지 못한 점이 많다. 곰팡이와 바실러스의 공배양 등을 이용하여 대두박을 제조한 한국특허등록 제10-0645284호가 있기는 하나, 실제로 두개를 동시에 키우는 것은 쉽지가 않고(곰팡이는 저수분에서 생육이 좋고, 세균은 수분이 어느 이상 있어야 생육이 좋기 때문) 하나를 후첨가 형식으로 후배양을 진행해서 제품을 만들어야하는 약점이 있다. 이 경우 전체적인 프로세스가 복잡(각 균주를 종배양/주배양을 진행해야하며, 접종시간 및 조건도 다르게 해야함) 해지고, 각각 조건에 맞는 수분함량 등의 변화를 주어야 하는 것이 일반적이다. 이러한 점들은 결국 프로세스의 복잡함 등에 의한 원가 상승을 초래하게 된다.

이에 따라 프로세스 단순화를 위해 단일균주를 통해서 이전에 복잡한 공배양 등을 통해 장시간 발효하여 항영양인자를 낮춘 제품과 동등 이상의 품질을 가지고, 발효시간을 최대한으로 감소시켜서 전체적인 원가를 감소시킬 수 있는 균주를 선정하는 것이 바람직하다.

일반적으로 세균은 곰팡이보다 저수분에서 잘 생육하지 못하기 때문에 바실러스 균을 대두박에 접종하여 본 발명의 목적을 이루기 위해서는 수분이 충분하지 않은 대두박에서도 생육이 활발하며, 생육 중에 목적하는 효소를 다량 생산하는 균주를 사용하는 것이 필수적이라 할 수 있다.

또한 산업적으로 사용되는 대량 고체발효 장치에서는 미생물이 자라는데 필요한 충분한 산소를 공급하기는 어려우므로 저산소 조건에서도 활발히 생육하면서 단백질 가수분해 활성이 우수한 바실러스균이 대두박 발효균주로 바람직할 것이다. 뿐만 아니라 본 발명의 발효대두박의 미래 지향적 가치를 더욱 증대시키기 위해서 포자형성 생균제로서 기능을 가진 균주를 분리하는 것이 보다 바람직하다. 최근 전 세계적으로 사료에 항생물질의 첨가가 금지되고 있는 시점에서 무항생제 사료의 대안으로서 장내 균총의 개선에 의한 건강증진뿐만 아니라 유해균 증식억제, 면역력 향상, 질병 저항성 증진 또는 사료효율 증진 등의 다양한 생리적 기능을 가지고 있는 프로바이오틱(probiotics)의 사용이 적극 권장되고 있다. 프로바이오틱으로는 전통적으로 유산균이 주류를 이루었으나, 최근 포자 형성 세균의 생균제로의 가치가 새롭게 인정되면서 무항생제 사료에 첨가되는 프로바이오틱으로 포자 형성 세균에 대한 관심이 고조되고 있다. 포자 형성 생균제의 대표적인 균주는 바실러스균이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제를 만족시키는 바실러스균을 된장, 청국장 또는 템페(Tempeh) 등과 같은 아시아의 전통적인 고상 대두발효식품으로부터 분리하고자 많은 노력을 한 결과 다수의 우수한 바실러스 균의 분리에 성공하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용하기 위하여 선별된 바실러스 균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우수(Bacillus cereus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 또는 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) 등이다.

보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스이며, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 TP6 균주(KFCC 11343P, 특허 제10-0753002호)이다.

특히 바실러스 서브틸리스 TP6(이하, "TP6 균주"라 함) 균주는 수분함량 40% 이상인 저수분 대두박에서 호기성뿐만 아니라 미호기성 조건에서도 잘 생육하였으며 대두 단백질의 가수분해 활성이 매우 뛰어 났으며 발효 후반기에 폴리감마글루탐산 (poly-γ-glutamic acid)을 생성하는 독특한 특성을 가지고 있었다. 또한 바실러스 서브틸리스 TP6 균주의 경우 발효 시간을 종전의 방법보다 획기적으로 감축시켰다.

추가로 본 발명의 상기 균주는 유산균, 또는 유산균 및 바실러스균의 혼합균주를 접종하는데 사용하는 균주로 선정할 수 있다.

우유 또는 치즈 등에서 분리된 동물성 유산균은 주로 유당(lactose)을 이용하여 생육하지만, 야채 등에서 분리된 식물성 유산균은 포도당, 과당, 설탕 또는 맥아당 등 다양한 당을 이용할 수 있으며, 환경에 대한 적응성이 매우 높아 저 pH 등 가혹한 환경에서도 생육할 수 있으므로 동물성 유산균보다 위에서 생존율이 높고 장관까지 도달하여 살아남는 균수가 많다.

따라서 본 명세서에서 용어 "식물성 유산균"은 식물성 원료로부터 유래된 유산균을 의미한다.

한국의 김치는 식물성 유산균의 대표적인 보고라 할 수 있다. 김치를 담글때에는 고추 가루 또는 마늘 등 향신료가 첨가되므로 김치 중의 유산균은 일반 유산균보다 척박한 환경에서 생육하여, 영양소를 분해, 섭취하는 능력이 뛰어나며 각종 생리활성물질의 생산력도 우수한 것으로 알려져 있다.

따라서 일반 유산균이 아닌 김치에서 분리한 식물성 유산균을 사용하여 대두박을 발효할 경우, 특별한 부원료의 첨가 없이 활발히 생육하며 발효 중 항균물질, 기능성 펩타이드 또는 유기산 등의 생산을 기대할 수 있다.

본 발명에서는 대두박 발효에 적합한 유산균을 김치로부터 선발하고자 노력한 결과, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 선발된 유산균으로 바람직하게는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼이며, 가장 바람직하게는, 본 발명자에 의해 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타럼 P23(KCCM 80048)이다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타럼 P23 균주(이하, "P23 균주"라 함)는 대두박중의 항영양인자인 비전분 다당류를 현저히 감소시켰으며 우수한 유기산 생성능과 내산성을 나타내었다.

김치에서 분리한 유산균을 종균 배양하는 배지로는 당업계에 공지된 다양한 배지를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 MRS 브로스(deMan Rogosa Sharpe broth), APT(All Purpose with Tween) 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지이고, 보다 바람직하게는 MRS 브로스 배지이다. 그러나 산업적으로 이용하기에는 MRS 브로스의 가격이 너무 비싸기 때문에 본 발명자는 유산균 종균을 위한 저가 배지를 구성하였으며, 유산균 종균을 배양하기 위한 배지의 탄소원 및 질소원은 CSL(Corn Steep Liquor)로 구성하였다.

또한, 바실러스 균의 종균배양을 위해서는 변형 영양 배지(5 g/L 소이톤, 5 g/L 비프 추출물 및 20 g/L 자일로오스, pH 7.0)를 사용하여 37℃에서 12 내지 24시간 배양하는 것이 바람직하다. 바실러스 균의 배지 역시 산업화를 위한 대량생산시 비용이 부담될 수 있으므로 본 발명자들이 고안한 CSL을 기본으로 한 산업용 배지에서 생육을 시키는 것이 유리하다.

유산균 종균배양을 위해 본 발명자들이 고안한 산업용 배지에 김치에서 분리한 유산균을 접종하고 30℃에서 8 내지 24시간 배양하면 원하는 균의 활성을 얻을 수 있다.

상기 두 균주를 각각의 산업용 종균배지에서 배양하여 종균 배양액의 최종 생균수는 (1~5)x10⁹ cfu/mL 범위가 되게 한다.

(b) 상기 열처리 된 대두박 냉각 및 미생물 접종

이어, 본 발명의 방법에 따르면, 상기 단계 (b)에서 열처리된 대두박을 고체발효가 가능한 온도로 냉각한 다음 바실러스 균을 접종한다.

본 발명에서 대두박의 냉각은 증자가 끝난 다음 자연적으로 진행하면되는데, 냉각 속도를 높여 과열을 방지하고 균일하게 냉각하기 위하여 컨베이어(conveyor)식 방냉기를 이용한 이송과정을 거치면 쉽게 진행할 수 있다(도 1).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 상기 단계 (b)의 냉각된 대두박의 온도는 30 내지 50℃이고, 보다 바람직하게는 35 내지 45℃이며, 가장 바람직하게는 37℃이다.

열처리된 대두박을 냉각한 다음 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제조된 대두박 배지에 바실러스 균을 배양한 전배양액을 그대로 또는 적절히 살균수로 희석하여 가능한 균일하게 접종하는 것이 바람직하다.

열처리된 대두박에 접종하는 미생물의 양은 대두박의 고체 발효를 좌우하는 중요한 요인이 된다. 증자한 대두박에 미생물의 접종량은 접종 직후의 균수가 10⁵ 내지 10⁹ CFU/g이 되게 하는 것이 바람직하다. 접종량이 10⁵ CFU/g 미만인 경우, 종균 발효액의 소요량이 적은 반면에 대두박을 발효시키는데 많은 시간이 소요되어 제품생산을 위한 배양시간이 길어지고 잡균이 오염될 가능성이 높은 단점이 있으며, 10⁹ cfu/g을 초과하는 경우, 발효시간은 상당히 단축할 수 있으나, 접종용 종균의 생산에 부담이 되는 단점이 있다. 특히 사용하는 균주의 생육 특성과 발효장치의 종류에 따라 발효 성적이 크게 좌우되므로 생산단계에서 균주의 특성을 고려하여 접종량을 적절히 선정하는 것이 바람직하다.

(c) 상기 대두박에 접종된 균을 고체 배양하여 대두박 발효물의 수득

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 곰팡이 및 효모가 아닌, 고체발효(배양) 에 일반화되지 않은 바실러스 균을 대두박에 접종하여 배양함으로써 발효 대두박을 제조하는 것이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "고체 발효(배양)"는 콩으로부터 지방(대두유)를 분리하고 남은 탈지대두박을 사용하여 미생물을 배양하는 것을 의미하며, 대두박의 추출물의 이용하는 "액체 배양 또는 액체 발효"와 구별되는 방법이다.

어떤 미생물은 때때로 고체발효과정에서 잘 생육하면서 균체 외 효소와 다른 여러 가지 대사산물을 다량으로 생산하기 때문에 고체발효는 옛날부터 주로 아시아 지역에서 전통식품이나 알콜 음료 생산에 사용되었다. 대두박은 플래이크(flake) 또는 입자 상태의 고체기질이기 때문에 미생물을 이용하여 대두박의 사료가치를 현저히 향상시킬 수 있는 가장 저렴하고 효율적인 발효방법은 고체발효법이다.

본 발명의 방법에서 고체 발효법을 이용하기 위하여 바실러스 균으로부터 선택되는 균주가 사용되는데 발효 대두박의 최종 제품 특성에 따라 균주의 종류 및 접종의 방법을 조절할 수 있다. 바람직하게는 바실러스 서브틸러스 TP6 균주를 사용하는 것이 본 발명의 발효시간을 감축시킬 수 있다.

바실러스 균만을 접종하여 제조하는 발효 대두박은 바실러스 균이 활발히 생육하면서 발효 대두박의 품질을 상승시키는 작용을 하게 되는데 우선적으로 활성이 강력한 프로테아제를 생산하게 된다. 바실러스 균이 생산하는 프로테아제는 대두박의 소화를 저해시키는 단백질인 TI를 가수분해하여 불활성화 시킬 뿐 아니라 고분자인 대두 단백질을 대부분 가수분해 하여 저분자화 함으로 소화흡수율이 증가하는 특징을 나타낸다.

또한, 바실러스 균은 대두박의 구성성분 중의 탄수화물을 이용하여 활발하게 생육하면서 균체를 구성하는 단백질로 전환이 되기 때문에 대두박은 발효 중에 상대적으로 단백질 함량이 증가하는 효과를 나타내게 된다. 이는 사료의 품질을 평가하는 항목 중 가장 중요한 단백질의 함량을 증가시키는 중요한 의미를 갖는다.

그리고 대두박에서 생육한 바실러스 균은 건조 시에 포자(spore)를 형성하면서 높은 비율로 생존하게 됨으로써 발효 대두박을 건조한 후에도 생균으로써 존재하는 특징이 있다. 이 바실러스의 포자로 인해 상술한 포자형성 프로바이오틱으로 가축의 장기능 개선효과가 기대된다.

본 발명의 방법은 유산균 단독 또는 유산균 및 바실러스 혼합균을 접종할 수 있다. 이때 김치에서 분리한 식물성 유산균만을 접종하는 경우 대두박을 원료로 하여 왕성하게 생육하면서 많은 양의 유기산을 생산하며, 또한 알파 갈락토시데이즈 활성을 나타내기 때문에 대두박에 함유하고 있는 갈락토올리고당을 분해하는 특성을 나타낼 뿐만 아니라 대두박 중의 다양한 다당류 항영양인자도 가수분해하여 장염 등을 방지할 수 있고 영양성분의 흡수율이 현저히 향상되는 장점이 있다.

상기 두 가지 균의 장점을 모두 포함한 발효 대두박을 제조하기 위하여 두개의 균을 동시 또는 시간차를 두고 순차적으로 접종할 수 있으며, 두 개의 균의 성장 조건이 동일하지 않기 때문에 접종비율을 달리하거나 순차적으로 접종을 하는것이 완제품의 품질을 좋게 한다는 점에서 바람직하다. 그러나 동시에 또는 동일 비율로 접종하여도 그 정도가 다를 뿐, 목적하는 효과를 달성하지 못한다는 것을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 단계 (c)에서 목적하는 미생물을 균일하게 접종한 대두박을 충진층 발효기(packed-bed fermentor)에서 발효한다. 충진층 발효기에는 회분식 통기배양장치, 밀폐식 배양장치, 연속식 통기배양장치 등 여러 가지 형식이 있다. 그 어느 장치이던 본 발명의 방법을 제한하지 않으며, 생산규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용한다.

본 발명의 방법에서 충진층 발효기에 대두박을 두께 5 내지 50 cm로 올려놓고 배양온도 20 내지 50℃에서 12 내지 72시간 동안 발효한다. 가능한 한 대두박의 충진층 두께는 두꺼울수록 바람직하고, 배양온도 30 내지 45℃에서 12 내지 48시간 동안 발효하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 37℃에서 24시간 동안 발효하는 것이다.

(d) 상기 수득된 발효 대두박의 건조 및 분쇄

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (c) 이후 에 (d) 상기 발효 대두박을 저온 저습 건조 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함한다.

발효과정에서 대두박 중의 수분은 일부 증발하지만 발효 종료 직후 잔존 수분함량은 20 내지 50%(v/w)로 상당히 높다. 그러나 발효 대두박 제품의 최종수분함량은 10 내지 12%(v/w)가 바람직하므로 건조공정이 필요하다.

또한 대두박을 아스퍼질러스 오리제와 같은 곰팡이로 발효한 경우 균사생성으로 대두박이 딱딱하게 덩어리지고 포자가 날려 건조와 분쇄가 매우 어려운 단점이 있다. 반면에 본 발명에서 세균으로 발효한 경우에는 발효 대두박의 상태가 매우 양호하지만 부분적으로 약하게 엉긴 덩어리를 형성하므로 건조 후 발효 대두박의 입자 크기가 균일하게 분쇄할 필요가 있다.

건조 및 분쇄는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으나 특히 조시 과도하게 고온에서 건조할 경우 발효 대두박 중의 생균이 대부분 사멸되므로 주의한다. 바람직하게는 생균이 사멸되지 않는 저온에서 건조하여야 하며, 가장 바람직하게는 저온 저습도의 열풍으로 건조하는 것이다. 분쇄 과정은 발효 대두박을 이용하고자 하는 목적에 따라 다양한 크기로 분쇄할 수 있으며, 분쇄 방법으로서 바람직하게는 햄머 밀(hammer mill)을 이용한다.

상술한 본 발명의 방법에 따라 대두박을 발효함으로서 대두박에 함유된 TI를 비롯하여 각종 항영양인자가 감소되고 단백질의 가수분해로 소화 흡수율이 향상되며, 단백질 함량이 증가됨으로써 사료로서의 절대적인 가치가 개선되므로 동물성 단백질을 대체할 수 있는 고품질 단백질 사료원인 발효 대두박을 얻게 된다.

그 외에 본 발명의 방법에 의해 제조된 발효 대두박은 유통 중에도 생존력이 강한 바실러스 균이 함유되어 있어 사료를 섭취한 동물의 정장작용을 돕는 기능을 보유하는 장점을 갖는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 발효 대두박에 관한 것이다.

본 발명의 발효 대두박은 상술한 본 발명의 방법에 의해서 제조되는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

바실러스 서브틸리스 TP6 균주를 접종하여 제조하는 발효 대두박은 바실러스 균이 활발히 생육하면서 발효 대두박의 품질을 상승시키는 작용을 하게 되는데 우선적으로 활성이 강력한 프로테아제를 생산하게 된다. 바실러스 균이 생산하는 프로테아제는 대두박의 소화를 저해시키는 단백질인 TI를 가수분해하여 불활성화 시킬 뿐 아니라 고분자인 대두 단백질을 대부분 가수분해 하여 저분자화 함으로 소화흡수율이 증가하는 특징을 나타낸다. 또한, 바실러스 균은 대두박의 구성성분 중의 탄수화물을 이용하여 활발하게 생육하면서 균체를 구성하는 단백질로 전환이 되기 때문에 대두박은 발효 중에 상대적으로 단백질 함량이 증가하는 효과를 나타내게 된다. 이는 사료의 품질을 평가하는 항목 중 가장 중요한 단백질의 함량을 증가시키는 중요한 의미를 갖는다. 그리고 대두박에서 생육한 바실러스 균은 건조 시에 포자(spore)를 형성하면서 높은 비율로 생존하게 됨으로써 발효 대두박을 건조한 후에도 생균으로써 존재하는 특징이 있다. 이 바실러스의 포자로 인해 상술한 포자형성 프로바이오틱으로 가축의 장기능 개선효과가 기대된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발효 대두박은 바실러스균 으로부터 선택되는 미생물의 영양세포 또는 포자를 포함한다. 바람직하게는 바실러스 서브틸러스 TP6 균주이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발효 대두박은 가축의 체지방의 축적을 감소시키는 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid)을 함유한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) TP6 균주를 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 대두박에 대두 항영양인자 제거능력이 탁월한 바실러스 균 특히, 바실러스 서브틸러스 TP6 균주를 접종하여 고체 배양함으로써 단백질 사료원으로서 특성이 개량 또는 개선된 고품질 발효 대두박을 제조하는 방법을 제공한다.

(b) 특히 본 발명은 고체발효시간을 기존 특허나 논문들 대비 12 내지 24 시간 줄이면서도 기존 대비 동등 이상의 품질을 확보할 수 있는 균주(바실러스 TP6) 균주를 이용하였다. 본 발명에 의해 제조된 발효 대두박은 종래 대두박에 비하여 바실러스균이 생산하는 강력한 프로테아제에 의하여 TI는 가수분해 되어 거의 불활성화 되고 대두 단백질이 펩타이드로 저분자화되어 흡수율과 사료효율이 향상된 우수한 고품질의 단백질원이다.

(c) 이러한 발효시간 감소는 제국기 회전율을 증가시켜 년간 생산량을 획기적으로 증가시키게 되고, 이는 제품의 원가를 낮추게 되어 소비자에게 싼 값에 고품질의 발효 대두박을 제공할 수 있는 이점이 있다.

(d) 본 발명의 방법은 고체 발효에 일반적으로 이용되지 않는 바실러스 균을 발효 균주로 이용함으로써, 본 발명에 의해 제조된 발효 대두박은 종래 대두박에 비하여 바실러스균이 생산하는 강력한 프로테아제에 의하여 TI는 가수분해 되어 거의 불활성화되고 대두 단백질이 펩타이드로 저분자화 되어 흡수율과 사료효율이 향상된 우수한 고품질의 단백질원이다.

(e) 더욱이 본 발명의 방법으로 생산된 발효대두박은 바실러스 균의 활발한 증식으로 인하여 양질의 단백질인 균체단백질이 생산되므로 단백질의 절대량이 증가되는 동시에 대두박에 함유된 탄수화물이 미생물 생육에 필요한 에너지원으로 소비됨으로써 상대적으로 단백질 함량이 증가되는 등 단백질 사료로서의 가치가 더욱 상승하게 된다.

(f) 본 발명에 의해 제조된 발효 대두박에는 유통 중에도 생존력이 강한 바실러스 균을 다량 함유하고 있기 때문에 발효 대두박을 섭취한 동물의 정장작용을 돕는 기능을 보유하는 특징을 가지고 있다. 항생제 사용금지에 따른 대안으로서 프로바이오틱이 권장되고 있는 점을 고려할 때 본 발효대두박의 미래 지향적 가치는 더욱 크다고 할 수 있다.

(g) 더욱이 본 발명에서는 폴리감마글루탐산 생산능을 가진 바실러스 균을 사용하여 대두박을 발효함으로써 부가적으로 가축의 체지방의 축적을 감소시킬 수 있는 효과도 얻을 수 있다.

가축의 성장을 촉진하기 위하여 고에너지 사료를 섭취하게 하면 가축의 체지방이 증가한다. 그러나 최근 소비자들은 건강에 대한 관심이 높아지면서 동물성 지방의 섭취를 가능한 감소시키기를 원하며 따라서 가축의 체지방을 감소시킬 수 있는 사육방법 또는 사료개발이 폭 넓게 요구된다. 폴리감마글루탐산은 우리나라 청국장 또는 일본의 나또(natto)의 끈적끈적한 점질물의 주성분으로 다양한 기능을 가진 기능성 성분이며, 특히 최근 가축의 체지방의 축적을 감소시키는 것이 밝혀졌다.

(h) 상술한 바와 같이 본 발명의 발효 대두박은 우수한 품질과 다양한 기능성을 가진 고단백질 사료원으로서 사료에 폭넓게 적용될 수 있다. 또한 발효시간을 기존 시간 대비 12 내지 24시간 줄일 수 있다.

도 1은 대두박을 원료로 하여 발효 대두박을 제조하는 본 발명의 일 실시예를 보여주는 개략도이다.
도 2는 L. plantarum P23 단독 배양, B. subtilis TP6 단독 배양, L. plantarum P23 및 B. subtilis TP6의 혼합 배양한 경우의 트립신 저해인자의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 L. plantarum P23 단독 배양, B. subtilis TP6 단독 배양, L. plantarum P23 및 B. subtilis TP6의 혼합 배양한 경우의 단백질 패턴 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 균을 접종하지 않은 증자 대두박의 당 분석 크로마토그램을 보여준다.
도 5는 B. subtilis TP6 균주로 발효한 대두박 발효물의 당 분석 크로마토그램을 보여준다.
도 6은 B. subtilis TP6 및 L. plantarum P23 균주로 발효한 대두박 발효물의 당 분석 크로마토그램을 보여준다.
도 7은 B. subtilis TP6 발현에 따른 단백질 분해 효과 및 알레르겐 제거 효과를 나타낸다. M: 마커; (1): 생대두박; (2): 37도 45%; (3): 37도 50%; (4): 45도 45%; (5): 45도 50%.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 대두박의 수분함량 별 바실러스 균과 유산균의 생육

세균을 배양하기에 적합한 대두박의 수분함량을 결정하기 위하여 대두박의 수분함량이 30%, 40%, 50% 및 60%가 되도록 균일하게 가수하고, 가수한 대두박 50g을 비커(250 mL)에 넣고 알루미늄 호일로 비커의 상부를 덥고 고무줄로 묶은 다음 80℃에서 30분 동안 증자한 다음 방냉하였다.

여기서 대두박 발효에는 본 발명의 구현예에 따라 가장 바람직한 균주로 선정한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TP6(KFCC 11343P) (이하, "TP6" 균주라 함) 균주와 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) P23(KCCM80048)(이하, "P23" 균주라 함) 균주를 사용하였다. TP6 균주의 종배양에는 자일로즈 2%, 소이톤 0.5% 및 비프 익스트렉 0.5%를 함유하는 배지를 사용하였으며, P23 균주는 MRS브로스(Difco)를 이용하여 온도 37℃에서 24시간 동안 전배양하였다.

증자한 대두박의 온도가 약 30℃까지 냉각되면, 클린벤치에서 상기 각 종균배지에서 전배양한 각 종균을 수분함량을 달리한 각 증자한 대두박에 5% 접종하고 오염과 수분 증발을 방지하기 위하여 비커를 알루미늄 호일로 밀폐한 상태로 인큐베이터에서 37에서 72시간 발효 한 다음, 각 대두박 발효물의 균수 및 pH 값을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 정리하였다:

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 접종 후 초기 균수가 약 1x10⁷ CFU/g임을 고려하면, 대두박의 수분함량이 30%인 경우에는 발효 후 P23 및 TP6 균이 거의 증식하지 않음을 확인할 수 있다. 대두박의 수분함량이 40%인 경우에는 (4.5~7.0)x10⁸ CFU/g, 그리고 수분함량 50%에서는 (1.3~2.5)x10⁹ CFU/g 수준까지 증식하였다.

수분함량이 증가할수록 균의 생육은 더욱 활발해져, 수분함량 60%인 경우에는 발효 후 P23과 TP6의 최종 균수가 3.2 x 10⁹ CFU/g 수준까지 증가 하였으며, P23 균주의 경우 유기산 생성에 의해 발효 후 pH가 뚜렷이 감소하였다.

따라서 본 실험의 결과에 의해 산업적 수준으로 세균을 증식시키기 위해서 대두박의 초기 수분 함량은 40% 이상이 되어야 한다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 대두박의 열처리 조건

대두박의 발효에 있어서 가수한 대두박의 열처리는 잡균의 오염뿐만 아니라 대두박의 화학적 환경이 발효에 적합하도록 하는 중요한 요인이므로, 본 발명자들은 대두박의 열처리 조건을 검토하였다. 발효기간 동안에 오염균이 발생되지않고 접종 균주가 활발히 생육할 수 있는 가능한 한 최소한의 열처리 조건을 확립하기 위하여, 대두박의 수분함량을 60%로 조절한 다음 250 mL 비이커에 각각 50 g을 담고 비이커 상부를 알루미늄 호일로 밀폐하고 60℃, 80℃, 105℃ 및 121.1℃인 오토클레이브(autoclave)에서 각각 10~30분간 열처리 한 후 방냉하였다.

증자 조건을 달리한 각 증자대두박에 실시예 1과 동일한 방법으로 전배양한 TP6 및 P23 균주의 종배양액을 각각 5% 접종하고 37℃에서 72시간 동안 배양하였으며, 발효 과정에 잡균 오염 여부와 배양 종료 후 발효대두박 중의 각 생균수와 pH를 측정하였다. 대두박 발효에 미치는 열처리 조건을 하기 표 2에 나타냈다.

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 60℃의 조건에서는 30분간 살균을 한 경우 발효 24시간 후에 오염되어 원하는 발효를 진행할 수 없었다. 그러나 80℃ 이상에서 10분 이상 열처리한 경우에는 72시간 발효가 진행되는 동안에도 오염이 발생되지 않았으며 1x10⁹ CFU/g 이상으로 균이 생육하였다.

실시예 3: 유산균 및 바실러스 균을 각각 배양 했을때 발효대두박의 품질 특성 변화

원물 대두박 중량의 70% 및 100%의 물을 균일하게 대두박에 분무하고 0℃에서 30분간 증자한 대두박에 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전배양한 P23과 TP6 균주종 배양액을 각각 5% 또는 두 균주의 종배양액을 동시에 5%씩 접종하여 발효를 진행하면서 배양 시간별로 트립신 저해인자(TI)의 함량과 단백질 분해 정도를 SDS-PAGE로 분석하여 각각 도 2 및 3에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, TP6 균주를 단독 배양한 경우 TI활성의 변화를 측정한 결과 가수량 70% 일때 배양 24시간 후 TI활성이 현저히 감소하였으며 그 이후 완만히 감소하여 배양 72시간 후에는 완전히 불활성화되었다. 가수량 100% 일 때는 불활성화 속도가 더욱 빨라져, 발효 24시간 후 TI가 거의 완전히 불활성화되었으며 그 이후에는 거의 변화를 볼 수 없었다. 한편, P23 균주를 단독 배양한 경우에는 72시간 발효 후에도 TI의 잔존량이 높았다. TP6 균주와 P23 균주를 혼합 배양한 경우에는 TP6 균주를 단독 배양한 경우와 거의 비슷한 경향이였다.

또한, 도 3에서 발효에 따른 단백질 패턴의 변화를 살펴보면, TP6 단독배양의 경우 발효 48시간 후에 고분자 펩타이드가 가수분해 되어 밴드가 거의 사라졌음을 알 수 있었다. 그러나 P23 균주를 단독 배양한 경우에는 원물에 비하여 단백질 패턴의 변화가 거의 없었다. 한편 TP6 균주와 P23 균주를 혼합 배양한 경우에는 TP6 균주를 단독 배양한 경우와 거의 비슷하였다.

한편, 균을 접종하지 않은 증자 대두박의 다당류 분석결과는 도 4에, TP6 균주로 발효한 대두박 발효물의 다당류 분석결과는 도 5에, 그리고 TP6 및 P23 균주로 발효한 대두박 발효물의 다당류 분석결과는 도 6에 각각 나타내었다. 도 4 및 5를 비교하면 크로마토그램의 당 패턴이 거의 동일 함을 알 수 있다. 이것은 TP6균주는 프로테아제를 비롯하여 여러가지 효소활성은 높으나 대두 다당류를 거의 가수분해 하지 못한다는 것을 나타낸다. 그러나 도 4 및 5와 김치에서 분리한 유산균 P23과 TP6 균주를 혼합 발효한 도 6을 비교하면 대두박 중의 항영양인자인 다당류가 P23 균주에 의해 대부분 가수분해 되어 소실되었음을 알 수 있다.

실시예 4: 유산균과 바실러스 균의 대두박에서 혼합배양

수분함량을 50%로 조절하고 110℃에서 15분간 열처리 한 대두박에 종균배지에서 배양한 TP6 및 P23 균주의 접종비를 달리하거나 접종시간을 달리하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 구체적으로, "혼합배양 1"은 초기에 TP6 균주를 5% 접종하고 20시간 배양된 발효대두박에 종균 배지에서 20시간 배양한 P23 균주를 5% 접종한 후 28시간 동안 추가적으로 발효를 진행한 것이고, "혼합배양 2 및 3"은 초기에 TP6 균주와 P23 균주의 접종비를 각각 1:0.5 및 1:1로 달리하여 접종하고 48시간 발효한 것이다.

상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, TP6 균주를 단독 배양한 경우나 P23을 추가 접종하거나, 동시에 접종비를 달리하여 혼합배양 하여도 최종균수와 TI 값은 큰 차이가 없다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 단독 및 혼합배양 등 발효방법을 달리하여도 본 발명에서 기대하는 대두박 발효물을 얻을 수 있을 것이다.

그러나 발효대두박의 품질은 최종 균수, 산도, 풍미등에서 약간씩 차이가 있으므로 바람직하게는, 목적하는 제품의 사양에 따라 식물성 유산균, 바실러스 균 그리고 상기 식물성 유산균과 바실러스균의 혼합 균으로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물의 접종시간과 접종비를 적절히 조절할 필요가 있다.

실시예 5: 발효 대두박의 품질 특성

수분함량을 30%로 조절한 후 121℃에서 20분간 살균한 대두박에 살균수를 균일하게 분무하여 수분함량을 60%로 조절하였다. 수분함량을 조절한 대두박에 각각의 종균 배지에서 24시간 배양한 TP6 및 P23 균주를 대두박의 10%(v/w)되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 발효를 진행하였다. 발효가 끝난 대두박을 건조한 후 이화학적 특성을 살펴본 결과를 하기 표 4에 나타내었다:

상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 TP6 균주의 단독 발효 대두박은 원물 대두박과 비교하여 단백질 함량이 현저히 증가되었을 뿐만 아니라 항 영양인자인 트립신 저해인자, 대두올리고당과 다당류가 감소되어 사료의 가치를 몇 단계 상승시킨 제품이라 할 수 있다. 더욱이 대두박 발효물에는 2.0x10⁹ CFU/g DM의 생균과 폴리감마글루탐산이 함유되어 있어 그 가치는 더욱 높다고 할 수 있다.

실시예 6: 배양 조건에 따른 TI 함량 변화

소화흡수를 막는 항영양인자 중의 하나인 트립신 저해인자의 함량 변화를 측정하기 위하여, 발효대두박의 트립신 저해인자 함량을 측정하였다. TI함량 측정은 한국단미사료협회에 의뢰하여 진행하였으며 방법은 AOAC 방법이 사용되었다. 아래의 실험군들에 대해 살펴보면 "대두"군 : 일반대두, "대두박"군 : 대두에서 대두유를 짜고 남은 부분, "발효 24시간"군 : 대두박 100g을 수분 45%로 맞추어 증자(90도 15분)하고, 증자된 대두박에 TP6균주를 5ml의 2X10⁹cfu/ml 을 접종하고 37℃에서 24시간 항습이 유지되는 조건에서 발효하였다. 발효 후 TI(트립신 저해인자)의 함량변화는 하기 표 5와 같다.

	TI(mg/g)
대두	5~20
대두박	4~8
발효24시간	0.32

발효 24시간에서 트립신 저해인자의 함량은 한국특허등록 제10-645284호에 기재된 36시간 발효한 결과의 TI함량인 0.6mg/g의 50%수준인 0.32mg/g으로 24 시간 발효만으로 이전 실험결과와 동등 이상의 항영양인자 저감효과를 보여주었다.

실시예 7: TP6 균주 단일 배양시 대두박 발효시간에 따른 조단백 함량 변화

(발효온도는 37℃로 진행하였다)

대두박 100g을 수분 45%로 맞추어 증자(90도 15분)하고, 증자된 대두박에 TP6균주를 5ml의 2X10⁹cfu/ml 을 접종하고 37℃에서 24시간 항습이 유지되는 조건으로 발효하였다. 발효시 단백질 함량 변화는 하기 표 6과 같다.

	조단백% (수분10%로 보정)
생대두박	49.11261
증자	49.73485
0시간	49.83154
18시간	56.55319
21시간	56.23199
24시간	57.85988

발효시간 24 시간 수준에서 기존특허(한국등록특허 제10-0645284호)의 혼합 균주를 이용한 36시간 발효결과, 기존특허(한국등록특허 제10-0459240호)의 단일균주를 이용한 48 시간 발효한 결과와 비교하여 동등 이상 수준의 단백질 함량을 얻으면서도 기존특허나 논문들에 비하여 발효시간을 12 내지 24 시간 줄일 수 있었다. (배합비 상에서 총조단백함량이 중요하기 때문에 단백질제의 역할을 하는 대두박가공품의 경우 조단백함량이 중요하다.) 이러한 발효시간 감소는 제국기의 회전율을 높여주고 이는 년간 생산가능한 배치수의 증가로 이어져 소비자에게 더운 싼 값에 좋은 품질의 발효대두박을 공급할 수 있다는 점에서 본 발명의 우수성을 확인할 수 있다.

실시예 8 : TP6 균주 단일 배양시 대두박 발효시간에 따른 조단백 함량 변화 (발효시간은 24시간)

대두박 100g을 수분 45%로 맞추어 증자(90℃ 15분)하고, 증자된 대두박에 TP6균주를 5ml의 2X10⁹cfu/ml 을 접종하고 37℃에서 24시간 항습이 유지되는 조건에서 발효하였다. 발효시 단백질 함량 변화는 하기 표 7과 같다.

	라피노스 (%)	스타키오스 (%)
생대두박	1.35	4.71
증자	0.50	5.42
0시간	0.25	1.11
18시간	0.03	0.75
21시간	0.01	0.04
24시간	ND	0.03

선정된 TP6 균주를 통해 24시간 발효를 진행한 결과 항영양인자인 라피노스(raffinose)와 스타키오스(stachyose) 비율이 현저하게 감소하였으며, 기존특허(한국등록특허 제10-049240호)의 48시간 발효결과와 거의 동등한 수준의 결과를 24시간 발효를 통해 얻을 수 있었다.

실시예 9: TP6 발효에 따른 단백질 분해효과 및 알레르기 유발물질(β- 콘글라이시닌 , 글라이시닌)의 제거 효과

발효시간은 모두 24시간으로 동일하고 온도조건 및 수분 조건을 변화시켜서 발효실험을 진행하였다. 발효조건은 상기 실시예 7 내지 8과 동일하며, 증자시 수분%만 변화를 주었고, 각각의 수분%는 각각 도 7의 2 레인은 37도 45%, 3 레인 37도 50%, 4 레인 45도 45%, 5 레인 45도 50%이었다. 도 7의 결과를 볼 때 생대두박내의 알레르기 유발물질인 β-콘글라이시닌과 글라이시닌은 37℃ 배양 조건으로 수분함량 45 내지 50%사이에서 가장 제거가 잘 되었음을 확인할 수 있으며, 고분자 단백질들이 저분자 펩타이드 형태로 분해되어 소화흡수에 적합한 형태로 변하였음을 알 수 있다.

Claims (12)

1. 다음의 단계를 포함하는 발효 대두박의 제조방법:
   (a) 대두박에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계;
   (b) 상기 열처리된 대두박을 냉각하고 바실러스균을 접종하는 단계; 및
   (c) 상기 대두박에 접종된 균을 고체 배양하여 발효 대두박을 수득하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 수분이 첨가된 대두박은 수분함량이 30 내지 80%(v/w)인 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 열처리는 대두박을 온도 70 내지 130℃로 10 내지 30분 동안 열처리하는 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 냉각된 대두박의 온도는 30 내지 50℃인 것인 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 바실러스 균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우수(Bacillus cereus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 클라우시(Bacillus clausii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) TP6 균주인 것인 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 고체 배양은 온도 30 내지 45℃에서 12 내지 48 시간 동안 실시되는 것인 방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 단계 (c) 이후에 (d) 상기 발효 대두박을 건조 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
   
9. 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 발효 대두박.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 발효 대두박은 바실러스균의 영양세포 또는 포자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 대두박.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 발효 대두박은 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid)이 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 대두박.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) TP6 균주인 것인 발효 대두박.

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