KR101786386B1 - 대두박추출물로부터 분리된 유산균을 이용한 발효대두박의 제조방법 - Google Patents

대두박추출물로부터 분리된 유산균을 이용한 발효대두박의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대두단백농축제품을 제조하는 과정에서 부산물로 발생하는 대두박 추출액을 사용, 유산균을 고농도로 액상 배양하여 발효대두박의 제조에 필요한 접종균액으로 사용함과 아울러 농수축산업 등 산업용으로 쓰일 수 있는 유산균제품을 값싸게 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히 유산균제품의 단백질 함량을 높이고 항영영인자들을 제거하며, 그 추출액이 최적의 미생물배지 성분을 가지도록 대두박을 추출하는 방법, 상기 추출액에서 고도의 성장을 나타내는 유산균을 스크리닝하는 방법, 상기 방법으로 탐색, 선별되어 상기 추출액에서 높은 비성장속도를 나타내는 유산균 및 상기 유산균을 대두박 추출액에서 고농도로 배양하는 방법, 상기 유산균을 이용하여 대두박 고상발효를 실시하는 방법과 상기 유산균을 이용하여 응용제품을 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 대두박 추출액을 이용한 유산균의 배양 방법은 비교적 짧은 시간 내에 품질이 극대화된 발효대두박을 제조할 수 있도록 하며, 간단한 별도의 배양공정을 통해 다량의 유산균체를 얻을 수 있도록 하는 것이다.

Description

대두박추출물로부터 분리된 유산균을 이용한 발효대두박의 제조방법{A manufacturing methods of fermented soybean meal using lactic acid bacteria}
본 발명은 가축사료의 원료로 사용되는 대두박의 품질을 향상시키기 위한 발효대두박에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 발효대두박을 만드는 과정에서 부산물로 발생하는 추출액을 이용하여 유산균을 고농도로 배양한 후, 상기 유산균을 대두박 발효의 접종균으로 사용하여 소화가 잘되고, 영양적으로 가치가 높아 경제적이면서도 품질이 우수한 발효대두박을 제조하기 위한 것이다.
가축의 생산성을 향상시키기 위해서는 활성제, 항생물질, 항균제, 성장호르몬제 등이 사용되고 있으나, 항생물질 등은 병원균 내성증가 및 축산물에 잔류문제 등으로 최근에는 생균제와 같은 미생물제제의 사용이 증가하고 있다. 이러한 미생물 제제의 사용 목적은 등물체내의 효소분비 촉진, 불소화성 섬유소의 소화율 향상 및 항영양인자의 감소 등을 목적으로 하고 있다.
본원발명은 가축 사료의 주요 원료인 탈지대두박의 소화율을 높이고, 항영양인자를 감소시켜 영양성분의 이용율를 높이기 위한 것이다.
탈지대두박은 생산량 기준으로 전세계 식물성 단백질 사료원료의 60%를 차지한다. 최근 광우병 발병 등으로 동물성 단백질원에 대한 부정적인 시각이 확대되면서 향후에도 수요가 지속적으로 늘어날 것으로 예상된다.
콩 성분 중 트립신 저해제(Trypsin Inhibitor)와 같은 항영양인자들은 열에 약해 대두박 생산과정에서 비활성화되기 때문에, 열에 의한 단백질 변성을 최소화하면서 농축대두단백(Soy Protein Concentrate)을 만들 경우 미생물 발효나 효소를 이용하여 항영양인자들을 분해시키는 방법을 주로 사용한다. 농축대두단백 제품은 특히 이유기 자돈에 주로 사용된다.
최근에는 미생물을 이용한 발효를 통해 소화흡수율, 기호성 등 전체적인 사료효율을 증가시킬 목적으로 대두박을 발효하는 경우가 많아지고 있다. 국내에서도 CJ, 진바이오텍 등의 기업들이 사업화한 바 있다.
전세계적으로 대두박을 발효하기 위해서는 고상발효(Solid Substrate Fermentation)법을 주로 사용하며, 미생물로는 Aspergillus 속으로 대표되는 곰팡이와 Bacillus 속으로 대표되는 세균을 주로 활용하는 호기성 발효( Aerobic Fermentation) 공법이 대세를 이루고 있다.
이러한 호기성 고상발효법은 산소 공급이 필수적이므로 공정 중 오염가능성이 높고, 제국기 등 상당한 수준의 시설 투자가 필요하며, 생산량 증가를 위한 공장 스케일업이 용이하지 않다는 등의 단점을 가지고 있다.
한편, 혐기성 세균을 이용하는 고상발효법은 호기성 공정의 이와 같은 단점들을 극복할 수 있는 대안으로 꼽히고 있는데, 특히 GRAS(Generally Recognized as Safe, 일반적으로 안전하다고 받아들여지는 물질에 대한 미국 FDA의 기준) 미생물로 잘 알려져 있는 유산균을 이용하여 대두박을 발효하려는 시도들이 근래 생겨나고 있다.
유산균은 대두박의 대표적인 항영양인자 중의 하나인 올리고당을 이용하여 젖산 등 유익한 물질로 변환시키고, 아미노산 대사 등이 활발하여 가축에게 유용하면서도 다양한 생리활성물질들을 만들어 준다. 특히 유산균이 발효과정에서 분비하는 젖산은 다른 미생물의 번식을 억제함으로써 오염을 최소화하는 잇점을 가지고 있다. 그러나 한편으로는 생육과 발효에 있어서 호기성 균들에 비해 속도가 느리기 때문에 Lactobacillus 속 등의 유산균을 주로 사용하는 기존의 혐기적 대두박발효 공정에는 많은 시간이 소요된다는 단점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은, 대두박 내의 당류와 일부 단백질을 포함하는 수용성 추출액을 조제하고 이를 배지로 하였을 때 높은 비성장속도(Specific Growth Rate)를 보이는 유산균을 선별하고, 이 유산균을 기준으로 하는 대두박의 추출 및 발효공정을 창안하였다.
본 발명의 발효대두박은 짧은 발효시간 내에서도 항영양인자들이 충분히 비활성화되고 대두단백질이 상당히 분해되어 소화흡수율이 높아진 것으로 나타났다. 또한 공정부산물로 얻어진 대두박 추출액을 이용하여 상기 유산균을 대량으로 배양하는 방법을 고안함으로써 새로운 부가가치를 창출할 수 있도록 하였다.
KR 10-1139027 B1(2012.04.16)
본 발명의 목적은 유산균을 사용하여 유산균 발효 대두박을 생산하기 위한 것이다. 유산균은 고초균이나 곰팡이를 이용한 호기성 발효공정에 비해 경제성이 있으나 혐기적 조건 등 공정상 문제점이 있었다. 이를 극복하기 위하여 본 발명에서는 대두박 추출액에서 잘 성장하는 유산균을 상기 대두박 추출액을 사용하여 고농도의 유산균 배양액을 제조한 다음, 배양된 상기 유산균을 대두박에 접종하여 발효시킴으로써 발효가 신속하게 진행되도록 하기 위함이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대두박으로부터 특정 성분들을 추출하고, 상기 추출물을 이용하여 유산균을 배양한 다음, 배양된 유산균을 대두박에 접종하여 고상발효시키는 것이다. 또한 상기 유산균 배양액을 재활용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 대두박 추출은 알코올 대신 산성의 물을 용매로 사용하여 대두박 중의 비단백질 성분들을 효과적으로 추출하는 방법을 사용하였다. 대두박 내의 대부분 단백질의 등전점(Isoelectric Point, 이하 pI)이 4.5 정도인 것을 이용하여 pH 4.5 미만의 약산성 물을 용매로 사용하여 추출을 하면 단백질은 침전이 되어 추출이 되지 않고 pH에 영향이 없는 수용성의 과당류, 탄수화물 들이 빠져나오게 되는 원리이다.
본 발명에 사용되는 추출기는 기본적으로 두 개의 장치가 결합된 형태인데, 노즐을 통해 고압으로 분사되는 추출용매 속을 대두박이 이동하면서 통과하는 장치와 추출용매가 흡수된 대두박으로 부터 용매를 압착해 내기 위한 장치가 그것이다. 전자는 스크류컨베이어와 노즐, 펌프 등으로 구성되어 있고 후자는 유압실린더가 장착된 압력장치가 기본이다.
대두박을 대량으로 발효시키기 위해서는 다량의 접종균체가 필요하다. 특히 발효환경을 통제하기 어려운 고상발효의 경우에는 더 그렇다. 일반적으로 액상 발효에 있어서는 균일한 환경을 만들어 내기가 어렵지 않기 때문에 멸균, 온도와 pH 조절, 산소공급(또는 산소차단) 등이 용이하여 많은 양의 접종균체가 필요하지 않다. 보통 ml 당 106 에서 107 cfu(colony forming unit), 또는 부피로 1~5% 정도의 접종균량(inoculum size)를 사용한다.
특히 유산균을 이용하여 대두박을 발효하기 위해서는 충분히 많은 양의 접종균체를 사용하는 것이 여러가지 이점이 있다. 혐기적(또는 통성 혐기성)으로 생육하는 유산균은 호기성 세균이나 효모, 곰팡이 등에 비해 생육속도가 느리므로 유산균을 이용하여 대두박을 효과적으로 발효하기 위해서는 더 많은 양의 접종균체가 필요하다.
본 발명에서는 다량의 유산균 접종체를 만들기 위하여 대두박 추출액을 배지로 사용하는 고농도 배양법을 개발하였다. 이를 위해 우선, 상기의 방법으로 제조한 대두박 추출액에서 고도의 생육을 나타내는 유산균을 탐색하였다.
발효균을 선발할 때에는 그 대상물이 지니고 있는 유기 성분 중 가장 많거나 중요한 것을 타겟으로 분해성능이 뛰어난 균을 고르는 것이 일반적이다. 따라서 대두박발효용 미생물을 탐색할 때에는 대두단백질을 분해하는 효소를 많이 생산하는 균을 찾는 것이 통상적인 방법이다. 이는, 대두의 대표적인 항영양인자인 트립신 저해제(Trypsin Inhibitor, TI),와 베타 콘글라이시닌(beta-conglycinin) 등이 단백질로 구성되어 있고, 분자량이 비교적 큰 대두단백질을 가축이 원활하게 소화하기 위해서는 작은 크기의 단백질이나 펩타이드 수준으로 단백질을 분해하는 것이 좋기 때문이다. 거기에 더하여 대두박 고상발효 조건, 이를 테면 수분함량, 온도, pH 등에 적응하여 발효를 일으킬 수 있는 균을 2차적인 조건으로 한다.
본 발명에서의 탐색 방법에 따라 선별된 유산균은 대두박 추출액에서 빠른 생육을 나타내었는데, 대두박 발효에 주로 사용되는 고초균이나 일반 산업용 유산균과 비교가 되지 않을 정도의 고도의 생육속도를 가지고 있는 것으로 나타났다. 이는 선별된 균주가 올리고당, 탄수화물, 단백질 등의 대두박 유기물들을 효과적으로 분해, 이용한다는 증거이고 특히, 유산균을 제외한 보통의 미생물들이 잘 이용하지 못하는 대두의 과당류들, 이를 테면 슈크로즈, 스타키오즈, 라피노즈 등을 탄소원으로 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서는, 상기 선별된 유산균을 대두박 추출액에서 고농도로 배양하기 위해 일반적인 방법과는 다른 새로운 연속배양법을 고안하였다.
본 발명에서의 연속배양법은, 선별된 유산균의 비성장속도가 현저하게 높다는 점에 기초하여 수산화나트륨(sodium hydroxide)과 같은 염기나 탄산 칼슘(calcium carbonate)과 같은 젖산 중화제를 따로 사용하지 않고 특정한 pH가 유지되도록 자동으로 대두박추출액이 투입되도록 한다.
대두박의 항영양인자를 제거하고 조단백 함량을 농축하기 위해서는 단백질 외의 성분을 선택추출하여 제거한 후 효소처리하거나 발효를 시켜야 한다. 이는 대부분의 대두 항영양인자들이 단백질 구조를 가지고 있기 때문이다. 근래들어서는 발효를 통해 그러한 목적을 이루는 경우가 많은데 Bacillus(고초균)속 세균이나 Aspergillus(누룩곰팡이)속 곰팡이, 또는 Saccharomyces(맥주효모/빵효모)속 효모 등을 주로 사용하고 국내의 경우에서는 없지만 일부 유산균을 사용하여 산업화한 예도 있다.
본 발명에서 선별된 유산균은 다른 유산균이나 고초균 등에 비해 상기 대두박 추출액에서의 생육이 현저하게 뛰어나다.
한편, 최근 환경오염에 대한 관심이 증대하면서 생분해 플라스틱(bio-degradable plastic)이 주목받고 있는데 그 중에서도 젖산 중합체인 PLA(Polylactic Acid)가 대표적인다. PLA 제조에 필요한 젖산은 대부분 유산균을 이용한 발효로 생산되는데 본 발명에서의 추출액과 유산균을 사용하면 경제성있는 젖산 제조공정을 만들 수 있다.
본 발명은 많은 시설비와 운영비가 요구되는 기존의 호기적 발효공정을 대체하여, 상대적으로 단순한 공정설비와 낮은 비용으로 발효대두박을 생산할 수 있는 혐기적 발효공정기술로 동물사료 시장에서 원가경쟁력이 높은 발효대두박을 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 발효공정은 기존의 유산균 발효공정에 비하여 발효시간이 월등히 짧고 오염의 가능성이 낮아 안정적으로 운영될 수 있다. 본 발명의 공정으로 제조된 발효대두박은 그 품질에 있어서 기존 호기적 발효공정에서 생산된 그것과 비교하여 경쟁력이 충분히 있다. 특히 가축의 소화흡수를 방해하여 대두박의 사료효율을 현저히 떨어뜨리는 과당류들은 본 발명의 공정에서 탁월하게 제거된다.
본 발명에서는 자칫 버려질 수 있는 대두박 추출액을 유산균 배양 배지로 재활용함으로써 원가를 절감할 수 있게 해줄 뿐 만 아니라 공정폐기물이 없는 환경 친화적인 수단을 제공한다. 더욱이 잉여의 추출액을 이용하여 산업용 유산균원말이나 젖산 등의 산물을 얻을 수 있음으로 해서 부가가치를 창출할 수있다. 그 외에도 다양한 미생물을 이용, 대두박추출액의 발효를 통해 산업적으로 가치를 갖는 여러 발효대사산물을 생산할 수 있는 기술적 기초를 제시한다.
또한 본 발명에서와 같이 수용성 대두박 추출액을 미생물배지로 하여 균을탐색하는 기술은, 대두박 외에도 발효할 때 산업적 가치가 증대되는 다양한 유기부산물들을 저비용의 혐기적 공정을 통해 효과적으로 재활용할 수 있는 혁신적 기술토대를 제공한다.
도 1은 발효대두박의 제조공정도이다.
도 2는 후보균주들 중 추출액에서 고도의 생육속도를 나타내는 유산균의 생육곡선이다.
본 발명은 탈지대두박에 유산균을 접종하여 발효대두박을 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 발효대두박의 제조공정도이고, 도 2는 후보균주들 중 추출액에서 고도의 생육속도를 나타내는 유산균의 생육곡선이다.
본 발명에서는 대두박으로부터 추출물을 얻고, 상기 추출물에 혐기조건에서 잘 성장하는 유산균을 선택하여 배양시킨 다음, 배양된 유산균으로 대두박을 혐기성 발효시켜 발효대두박을 제조하는 것이다. 이하 대두박은 통상의 탈지대두박 및 대두박 모두를 통칭하는 것이다.
대두박은 다량의 단백질을 함유하고 있어서 가축사료의 주요 단백질원이다. 대두박의 성분 중에는 스타키오즈, 라피노즈 등의 과당류와 다양한 탄수화물들이 포함되어 있는데 이들은 대부분 수용성이며 가축의 소화를 방해하는 항영양인자(Anti-Nutritional Factor, 이하 ANF)이다. 이들 성분을 제거하고 단백질 비중을 높인 농축대두단백(Soy Protein Concentrate, 이하 SCP)은 이유기 자돈의 사료 등에 사용되는 고급제품인데 에틸알코올과 물의 혼합물을 추출용매로 사용한다. 그러나 용매로 사용되는 알코올은 고가의 회수 장치가 필요하다는 등의 공정 상 단점을 가지고 있다. 또한 잔존 알코올 성분은 미생물의 생육을 저해할 수도 있다.
본 발명에서는 이러한 단점을 가지고 있는 알코올 대신 산성의 물을 용매로 사용하여 대두박의 비단백질 성분들을 추출하였다.
대두박 내의 단백질의 등전점(Isoelectric Point, 이하 pI)이 4.5 정도이기 때문에, pH 4.5 미만의 약산성 물을 용매로 사용하여 추출을 하면 단백질은 침전이 되어 추출이 되지 않고 pH에 영향이 없는 수용성의 과당류, 탄수화물들이 추출되는 것이다. 한편, 용매로 사용된 물을 분리하기 위해 특별히 고안된 기계장치를 사용하였다. 과당류, 탄수화물 등이 고농도로 용해, 분리된 추출액을 얻기 위하여, 적은 양의 추출용매를 사용하면서도 효율이 높은 추출기를 개발하였다.
대두박을 대량으로 발효시키기 위해서는 다량의 접종균체가 필요하다. 액상발효와 달리 고상발효는 균일한 환경을 조성하기 어렵기 때문에 멸균과 발효조건 유지가 쉽지 않다. 따라서 액상발효의 경우 보다는 더 많은 접종균체를 사용하여야 하고 이는 필연적으로 공정비용을 증가 시키게 된다.
일반적으로 유산균 발효과정에서는 젖산이 분비되는데 이는 배지의 pH를 떨어뜨리는 효과를 나타내게 되어 결과적으로 다른 오염균들의 번식을 차단하는 역할을 한다. 한편으로 혐기적(또는 통성 혐기성)으로 생육하는 유산균은 호기성 세균이나 효모, 곰팡이 등에 비해 생육속도가 느리므로 유산균을 이용하여 대두박을 효과적으로 발효하기 위해서는 더 많은 양의 접종균체가 필요하다.
본 발명에서는 다량의 유산균 접종체를 만들기 위하여 대두박 추출액을 배지로 사용하는 고농도 배양법을 개발하였다. 이를 위해 우선, 상기의 방법으로 제조한 대두박 추출액에서 고도의 생육을 나타내는 유산균을 탐색하였다.
본 발명에서는 아무 것도 추가하지 않은 대두박의 추출액을 액상 배지로 하여 미생물들의 생육속도를 측정하였다. 이는 실제 대두박의 고상발효에서 미생물의 활동을 위해 많은 양의 물이 첨가되기 때문에 미생물이 경험하는 환경은, 대두박의 수용성 유기물질들이 풍부하게 녹아있는 액상에 가깝기 때문이며, 또한 대량의 유산균 접종균체를 얻기 위해 대두박추출액을 사용하기 위함이다. 유산균을 배양하는 배지는 MRS배지를 선택배지로 하였다.
본 발명의 유산균의 균주는 올리고당, 탄수화물, 단백질 등의 대두박 유기물들을 효과적으로 분해, 이용하였으며, 특히 유산균을 제외한 보통의 미생물들이 잘 이용하지 못하는 슈크로즈, 스타키오즈, 라피노즈 등을 탄소원으로 이용하였다. 이와 같이 항영양인자로서 대두박의 성능을 떨어뜨리는 과당류들을 제거한 추출물을 배지로 이용하여 미생물을 배양할 수 있다는 것은 대두박발효를 위한 접종균체 제조에 드는 비용을 절감할 수 있을 뿐 만 아니라 산업용 유산균 원말이나 젓산, 아미노산 등의 부가 생산을 통해 새로운 가치를 만들어 낼 수 있다.
본 발명에서는 선별된 유산균을 대두박 추출액에서 고농도로 배양하기 위해 연속배양법을 창안하였다. 연속배양법은 배치(batch)식 배양법에 비해 적은 배양조에 새로운 배지를 투입하면서 배양산물을 계속해서 얻을 수있다.
본 발명에서의 연속배양법은, 선별된 유산균의 비성장속도가 현저하게 높다는 점에 기초하여 수산화나트륨(sodium hydroxide)과 같은 염기나 탄산 칼슘(calcium carbonate)과 같은 젖산 중화제를 따로 사용하지 않고 특정한 pH가 유지되도록 자동으로 대두박추출액이 투입되도록 한다. 이러한 방법은 별도의 첨가제를 사용하지 않는다는 측면에서 자원 재활용도를 높일 수 있고 공정을 단순화 시킬 수 있다.
대두박의 항영양인자를 제거하고 조단백 함량을 농축하기 위해서는 단백질 외의 성분을 선택추출하여 제거한 후 효소처리하거나 발효를 시켜야 한다. 이는 대부분의 대두 항영양인자들이 단백질 구조를 가지고 있기 때문이다. 근래들어서는 발효를 통해 그러한 목적을 이루는 경우가 많은데 Bacillus(고초균)속 세균이나 Aspergillus(누룩곰팡이)속 곰팡이, 또는 Saccharomyces(맥주효모/빵효모)속 효모 등을 주로 사용한다.
이러한 호기성 미생물들을 이용하여 발효할 경우 초기 투자비, 운전비, 원가 등이 상승하며, 가장 중요하게는 생산규모의 확대가 용이하지 않다. 즉, 호기적 공정에서는 균일하고도 충분한 산소의 공급에 많은 노력이 들어갈 수 밖에 없고, 이 때문에 쌓아 올리는 두께가 제한되어 결과적으로는 시설에 많은 공간이 요구되고 또한 수증기, 물, 공기, 열 등 자원의 이용이 상대적으로 효율적이지 못하다는 것이다.
이와는 대조적으로 혐기적 공정에서는 산소의 공급이 불필요하므로 고가/고비용의 제국기 없이 쌓아 놓는 것 만으로도 발효조건을 유지할 수 있다는 점이 큰 장점이다. 발효과정에서 발생되는 열이 있으므로 발효온도를 유지하기 위한 별도의 시설과 에너지도 필요가 없다. 또한 대표적인 혐기성 미생물인 유산균을 사용할 경우 발효과정에서 생성된 젖산이 발효대두박의 pH를 떨어뜨려 잡균의 오염을 방지할 수 있다.
그러나, 유산균을 이용한 혐기성 발효는 일반적으로 속도가 느리다는 큰 단점을 가지고 있다. 이런 단점을 극복하기 위해 본 발명에서는 대두박 발효과정에서 생육속도가 빠른 유산균을 선별(SLB120)하였다.
유산균의 경우 대두 과당류들에 대한 이용성이 뛰어난 반면 상대적으로 단백질가수분해효소의 활성이 낮다는 단점도 있는데 본 발명에서의 유산균은 우수한 단백질분해능을 가져 충분한 경쟁력을 가지고 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 유산균을 동정한 결과 엔터로코커스 속의 훼시움(Enterococus Faecium) 균주로 밝혀졌다.
본 발명에서는 추출된 대두박에 유산균을 접종 혼합한 후 24 시간 정치하는, 단순하면서도 경제적인 공정을 통해 발효대두박 제조에 필요 충분한 발효효과를 얻을 수 있었다. 단, 이런 결과를 위해서는 충분히 많은 접종량이 필요한데 상기와 같이 추출액을 통해 제조된 고농도의 유산균 배양액을 활용하는 것으로 해결할 수 있었다.
본 발명의 추출공정에서 발생하는 추출액은 많은 양의 과당류와 소량의 단백질을 함유하고 있어 미생물의 배양 배지로 사용될 수 있는 가능성이 있다. 특히 라피노즈, 스타키오즈 등을 풍부하게 포함하고 있기 때문에 이를 잘 이용할 수 있는 유산균의 배양 또는 발효에 활용한다면 버려질 수도 있는 자원을 재활용할 수 있게 된다.
본 발명에서 선별된 엔터로코커스 속의 유산균은 다른 유산균이나 고초균 등에 비해 상기 추출액에서의 생육이 현저하게 뛰어나다. 또한 이 유산균은 가축이나 애완용 동물, 그리고 수산용의 사료 등에 첨가되어 소화흡수율을 높이는 유산균류로 잘 알려져 있고 silage나 forage의 접종균으로도 유명하다. 따라서 대두박 발효공정에 필요한 접종균체를 제한 잉여의 균체는 제제화하여 이런 목적의 산업용 미생물제제를 만들기 위한 원말로의 생산이 가능하다. 유산균은 생육이 느리고 살아있는 상태를 오랫동안 유지하기 위한 제제화가 쉽지 않기 때문에 산업용 유산균제제는 고가인 것이 보통이다. 본 발명에서의 유산균은 대두박 추출액에서의 생육이 왕성할 뿐 만 아니라 제제화도 어렵지 않기 때문에 이를 활용한다면 상당한 부가가치를 만들어 낼 수 있을 것이다.
한편, 최근 환경오염에 대한 관심이 증대하면서 생분해 플라스틱(bio-degradable plastic)이 주목받고 있는데 그 중에서도 젖산 중합체인 PLA(Polylactic Acid)가 대표적인다. PLA 제조에 필요한 젖산은 대부분 유산균을 이용한 발효로 생산되는데 본 발명에서의 추출액과 유산균을 사용하면 경제성 있는 젖산 제조공정을 만들 수 있다.
<실시예 1>
추출용매의 양에 따른 대두박 추출액의 성분변화
*미생물의 배양에 적합한 추출액을 만들기 위해 추출용매의 양을 달리하면서 추출액의 성분을 관찰하였다.
추출용매는 염산을 사용하여 pH를 4.4로 조정한 물을 사용하였으며, 물의 온도는 최종 대두박의 온도가 25~30℃가 되도록 40~60℃로 가열하여 사용하였다. 추출용매를 정해진 양 만큼 대두박에 가한 다음 충분히 교반하고 10분 후 50mesh의 체로 여과한 것을 추출액으로 하였다.
추출액 중의 당의 양은 당도계를 사용하여 측정하였으며 단위는 Brix로 하였다. 1 Brix는 100g의 용액에 들어있는 당의 g수로 정의된다. 단백질은 Bradford법에 의해 정량하고 이를 100ml의 추출액 중 들어있는 단백질의 질량(g)으로 표시하였다.
추출용매의 양을 달리 달리하면서 추출액 성분 중 당과 단백질의 양을 측정한 결과
대두박에 추출용매를 1:5의 비율로 가해 추출하였을 때 당농도는 약 5Brix로 나타났고 이때의 단백질 농도는 약 1%였다. 이보다 많은 양의 용매를 사용하였을 때는 당 농가 크게 증가하거나 감소하지 않았으나 많은 양의 추출용매를 사용하는 것은 공정 상 불리할 수 있다는 것을 감안하면 1:5 정도의 비율이 최적이라고 할 수 있다.
추출용매의 pH는 4.2~4.6 사이에서 성분의 큰 변화가 없었고, 추출용매의 온도는 다양한 온도에서도 성분 상의 주목할 만한 변화가 나타나지 않았다. 추출용매를 가열하는 것은 추출된 대두박에 미생물을 접종할 때 그 온도가 일반적인 유산균의 생육 최적온도를 유지할 수 있도록 하기 위함이다.
<실시예 2>
대두박 추출액에서 우수한 생육을 나타내는 유산균의 선별
상기 실시예 1에서 조제된 추출액을 배지로 하여 생육속도가 우수한 유산균을 탐색하였다. 후보 균주들은 가수되어 야외에서 일주일 이상 방치된 대두박에서 MRS 유산균 선택배지를 사용하여 선발되었다.
배지로는 실시예 1의 추출액을 0.25㎛의 pore size를 같는 멤브레인필터를 사용하여 멸균한 것을 사용하였다. 접종균은 MRS배지 Nutrient broth에서 하룻밤 액상 배양한 것을 최종 1% 되게 추출액에 첨가하였다. 각 미생물은 30℃의 온도에서 생육시키면서 12 시간 동안 측정하였다.
도 2의 그래프는 후보 균주들 중 대두박 추출액에서 고도의 생육속도를 나타내는 유산균의 생육곡선을 나타낸다.
선발된 유산균은 대조로 사용된, 김치의 우점 유산균으로 잘 알려져 있는 Weissella koreensis나 유기물분해효소를 다량 분비하는 것으로 알려진 고초균 Bacillus megaterium과 비교하였을 때 월등한 비성장속도를 나타내었다. 접종 후 4~5 시간 만에 대수증식기를 마치고 정지기에 들어가는 것을 알 수 있다.
선발된 유산균(SLB120)의 비성장속도는 1.46 (hr-1)로 측정되었는데 이는, 비교적 생육이 느린 것으로 알려진 유산균의 특성을 감안할 때 이례적으로 빠른 생육을 보여준 것이다.
선발된 유산균(SLB120)의 특성과 관련하여 상기 선발된 유산균은 16s rRNA sequencing을 통해 동정한 결과 Enterococcus속으로 밝혀졌다.
*<실시예 3>
대두박 추출액에서의 선발된 유산균(SLB120) 고농도 연속배양 조건
추출액의 열처리 조건과 선발된 유산균의 생육 간의 상관관계를 조사하였다. 이는 실제 생산공정에서 추출액을 멸균처리할 필요가 있기 때문인데, 균주의 생육에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 멸균효과를 낼 수 있는 가열 온도 조건을 탐색하기 위한 것이다. 다음의 표 1은 각 온도와 시간별로 가열 처리한 추출액에서의 선발된 유산균의 생육곡선을 관찰한 것이다.
선발된 유산균의 생육곡선
멸균조건 OD600 (4시간 배양뒤)
121℃, 10분 1.25
100℃, 10분 2.13
80℃, 20분 2.78
80℃, 10분 3.01
70℃, 10분 3.42
70℃, 20분 3.43
70℃, 30분 3.41
60℃, 10분 3.48
60℃, 20분 3.43
60℃, 30분 3.42
표 1에서와 같이 80℃ 이상으로 추출액을 가열했을 경우에는 선발된 유산균의 생육이 저해되었다. 80℃에서도 20분 이상 가열했을 경우에는 생육이 저해됨을 알 수 있다. 이는 추출액 중 선발된 유산균(SLB120)의 생육에 절대적인 성분이 열에 민감하다는 것을 나타낸다. 결과적으로 선발된 유산균의 배양을 위해 공정 상 추출액을 멸균할 필요가 있을 경우에는 80℃ 이하로 하여야 하고 경과시간은 20분을 넘지 않도록 해야 한다.
한편, 선발된 유산균과 같은 유산균들은 배양과정에서 배지 중에 젖산을 축적 시키게 되는데, 이 결과 배지의 pH를 떨어뜨리게 되면서 스스로의 생육이 억제되게 된다. 따라서 유산균을 고농도로 배양하기 위해서는 생육이 억제되기 시작하는 배지의 pH 값을 알아서 그 이하로 떨어지지 않게 조절할 필요가 있다. 선발된 유산균의 생육이 저해받지 않은 pH 범위를 알아내기 위하여 플라스크 배양을 실시하였다. 경과 시간 별로 채취한 시료의 pH와 생균수를 분석한 결과는 다음의 표 2와 같다.
경과 시간별 pH와 생균수
경과시간(min) pH 생균수(cfu/ml)
0 5.87
140 5.51 1.0 〃109
200 5.20 6.4 〃109
240 5.00 3.5 〃1012
390 4.65 6.5 〃1012
420 4.60 7.0 〃1012
470 4.54 7.7 〃1011
상기 표 2에서와 같이 선발된 유산균은 pH 4.6 까지 생육에 저해를 받지 않는 것으로 나타났다. 최대의 생균수를 나타냈을 때 pH는 4.6이었는데, 이 결과를 바탕으로 연속배양 시 pH 조절범위를 4.6 ~ 5.0으로 하였다. 그리고 선발된 유산균의 최적 생육온도는 32~38℃인 것으로 나타났다.
본 발명의 연속식 배양방법에서의 발효조의 온도는 32~38℃, pH는 4.5~4.9로 하여 자동으로 조절되도록 하였다. pH의 조절을 위해서는 별도의 염기나 젖산 중화제를 사용하지 않고 추출액이 자동으로 주입되도록 하였다. 주입되는 추출액은 멸균을 위하여 80℃ 온도에서 20분간 가열처리 한 후 상온으로 식힌 것을 사용하였다.
<실시예 4>
선발된 유산균을 이용한 고상발효에서의 대두박의 성분 변화
상기 실시예 1에서와 같이 추출된 대두박에 상기 실시예 4에서와 같이 배양된 선발된 유산균을 접종한 후 30℃ 온도에서 24 시간 동안 발효하였다. 이후 50℃ 온도의 트레이 건조기에서 건조하였고 이를 분석한 결과 발효대두박의 성분 또는 특성의 변화는 다음의 표 3과 같았다.
발효대두박의 성분특성
항목 대두박 발효대두박
수분 함량(%) 12 10
pH 6.5 5.2
조단백질 함량(%) 48 56
트립신 저해제(mg/g) 8.0 1.20
라피노즈 함량(%) 1.70 0.02
스타키오즈 함량(%) 2.10 0.05
KOH 용해도 약 80 70.7
펩신 소화율 94.7
유산균 생균 ND 1.4X10^8
상기 표 3을 보면, 조단백질 함량은 56%로 증가하였으며 대표적인 항영양인자인 트립신 저해제는 8mg/g에서 1.2mg/g으로 상당한 비율 감소하였다. 한편 가축에게 고창(flatulence)을 일으킴으로써 해로운 역할을 하는 대두박 내의 라피노즈와 스타키오즈는 각각 0.2mg/g과 0.5mg/g으로 현저하게 감소하였음을 알 수 있다.
이상의 결과는, 본 발명에서의 발효공정은 발효대두박을 제조하는데 있어서 충분한 성분 변화와 특성 변화를 일으켰다는 것을 나타낸다. 특히 라피노즈와 스타키오즈의 함량은 다른 호기성 세균이나 공팡이, 또는 효모를 사용한 발효공정과 비교하여 현저하게 떨어졌는데 , 이는 유산균발효만이 갖는 특장점이 극대화된 결과라고 할 수 있다. 한편 발효결과로 대두박의 pH가 5.2로 떨어졌는데, 이는 젖산이 생성된 결과 때문이고 젖산은 풍미를 높여 기호성을 증대시키는 등 좋은 영향을 준다.
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Claims (3)

  1. 엔터로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)균을 이용한 발효대두박의 제조방법에 있어서,
    상기 발효대두박의 제조방법은 먼저 대두박에 추출용매를 1:5의 비율로 혼합하여 추출하되,
    상기 추출용매는 염산을 물에 혼합하여 pH가 4~5인 약산인 것을 사용하였으며, 물의 온도는 최종 대두박의 온도가 25~30℃가 되도록 40~60℃로 가열하여 대두박추출액을 얻는 단계; 및
    상기 대두박추출액을 배지로 하여 엔터로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)균을 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 유산균을 대두박에 접종하고 온도 30~35℃, 수분함량 50~65%의 조건에서 발효시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 유산균 발효대두박의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    대두박으로부터 추출된 대두박추출액은 당 농도 9~15%, 단백질 농도가 1~2% 범위인 것을 특징으로 하는 유산균 발효대두박의 제조방법.
  3. 발효대두박을 이용한 유산균제제의 제조방법에 있어서,
    상기 유산균제제의 제조방법은 먼저 대두박에 추출용매를 1:5의 비율로 혼합하여 추출하되,
    상기 추출용매는 염산을 물에 혼합하여 pH가 4~5인 약산인 것을 사용하였으며, 물의 온도는 최종 대두박의 온도가 25~30℃가 되도록 40~60℃로 가열하여 대두박추출액을 얻는 단계; 및
    상기 대두박추출액을 배지로 하여 엔터로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)균을 배양하는 단계; 및
    상기 대두박추출액에서 배양된 엔터로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)균을 농축하여 농축 균체를 얻는 단계; 및
    상기 농축 균체를 이용하여 엔터로코커스 훼시움(Enterococcus faecium)균 원말로 제제화 하는 것을 특징으로 하는 유산균제제의 제조방법.
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