KR101517326B1

KR101517326B1 - 발효 대두박 생산능이 향상된 바실러스 속 균주 및 이를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101517326B1
Application number: KR1020140010729A
Authority: KR
Inventors: 김택범; 권송희; 김비나; 조성준; 강경일; 박승원; 홍영호; 박민주
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2015-05-04
Also published as: US11259545B2; ES2742889T3; CN106795528A; TW201534221A; US20200345035A1; CN106795528B; BR112016016245B1; US10874118B2; DK3101136T3; EP3101136A4; JP6367974B2; JP2017506081A; WO2015115790A1; PL3101136T3; EP3101136B1; BR112016016245A2; EP3101136A1; TWI535385B; US20170020161A1

Abstract

본 발명은 항영양인자 제거 활성, 단백분해효소 활성 및 병원균에 대한 항균활성이 우수하고 점액질 생성능이 저감된 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K2G 균주, 상기 균주를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법, 이로부터 제조된 발효 대두박, 및 이를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 이용하여 제조된 발효 대두박은 트립신 저해인자, 대두올리고당 및 다당류 등 다양한 항영양인자가 거의 소실되고 조단백 함량과 단백질의 용해도가 높을 뿐만 아니라 저분자화로 인해 가축이 소화 흡수하기 용이한 작은 크기의 펩티드로 구성되어 있어 흡수율과 사료효율이 우수한 고품질의 식물성 단백질 사료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효 대두박 생산능이 향상된 바실러스 속 균주 및 이를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법{Bacillus sp. strain with improved productivity of fermented soybean meal and method for producing fermented soybean meal using the same}

본 발명은 발효 대두박 생산능이 향상된 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 항영양인자 제거 및 단백분해효소 활성이 우수하고 병원균에 대해 높은 항균 활성을 나타내면서 발효 과정 중에 점액질 생성능이 저감되어 발효 대두박 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주, 상기 균주를 이용하여 발효 대두박을 제조하는 방법, 이로부터 제조된 발효 대두박, 및 이를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

인간에게 치명적인 광우병 등의 질병이 사료에 첨가되는 동물성 단백질 성분에 기인한 결과로 판정되면서 전 세계적으로 사료에 첨가되는 동물성 단백질을 식물성 단백질로 대체하려는 움직임이 급속도로 진행되고 있다.

사료 시장에서 어분, 육골분 또는 혈장과 같은 동물성 단백질의 대체품으로 사용 중인 식물성 단백질 원료 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 것이 탈지대두박(이하, "대두박"이라 함)이다. 대두박은 콩기름을 짜고 남은 찌꺼기를 의미하는 것으로, 콩깻묵이라고도 한다. 대한민국에서 식물성 단백질 사료원으로 사용되는 대두박은 전체 사료의 60%를 차지하며 물량은 연간 200 만톤에 달하고 있다(2004년 한국단미사료협회).

대두박은 건조물 기준으로 단백질이 55~56 중량%, 가용성 탄수화물이 13~14 중량%, 불용성 탄수화물이 21~22 중량%가 함유되어 있으며, 이밖에 1 중량% 정도의 조지방과 4~6 중량% 정도를 포함하고 있다(한인규, 식물성 단백질사료, 사료가공학, 선진문화사, 67-107, 1998).

한편, 대두박에는 다양한 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF)가 함유되어 있어 사료로 이용되었을 경우 소화율이 저해되는 문제점이 있다(Li et al. J. Anim . Sci,. 68: 1790, 1990). 그 중에서 대표적인 것이 트립신 저해인자(trypsin inhibitor, TI)이며, 육상 동물에서 식이 TI는 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)의 적절한 효소기능을 방해하여 전체 단백질의 이용성을 저하시킨다. 특히 이러한 항영양인자의 영향은 어린 가축의 경우 현저하기 때문에 어린 가축용 사료에 첨가되는 대두박의 사용량을 제한하고 있다. 이외에도, 혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin), 가축의 설사, 복통을 유발하는 라피노스, 스타키오스 등과 같은 올리고당, 영양성분의 흡수를 저해하는 다당류 등이 알려져 있다. 이들 중 일부는 열처리에 의해서 파괴 되지만 이 과정에서 대두단백질이 변성되어 용해도가 감소하고 라이신(lysine) 등의 필수 아미노산이 소실될 수 있다. 이에 최근에는 대두의 단백질을 보다 효율적으로 이용하기 위하여 항영양인자를 제거하여 효율성을 증대시키는 가공방법들이 개발되고 있다.

현재 생산되고 있는 농축 대두단백질(soy protein concentrates), 분리 대두단백질(isolated soy proteins) 또는 가수분해 대두단백질(hydrolized soy protein) 등과 같은 대두단백질 가공품은 화학적 처리 또는 효소적 처리에 의하여 생산되고 있다. 그러나 화학적 가공방법은 생산 단가가 높고 제조과정 중 열처리, 화학적 처리, 열건조 등으로 인하여 단백질 변성, 수용성 아미노산의 소실 등이 일어나 실제 단백질의 용해도가 낮아지는 문제점을 갖는다. 이로 인해 화학적 가공방법은 단백질의 극심한 변성이 일어나지 않을 정도에서 열처리를 하기 때문에 항영양인자인 트립신 억제인자가 대두 단백질 내에 상당량 존재하게 된다.

이와 같은 화학적 가공방법의 문제점을 해결하는 수단으로 바실러스균 또는 곰팡이를 이용한 생물학적 가공방법으로 발효시킨 발효 대두박 제품이 개발되었다(한국특허등록 제10-0645284호, 제10-0459240호 및 제10-0925173호). 상기 발효처리 가공방법은 발효 과정 중에 다수의 항영양인자를 제거할 수 있고 추가로 단백질이나 탄수화물을 소화가 쉬운 저분자 형태로 분해할 수 있기 때문에 소화 흡수율이 우수한 고품질의 사료용 단백소재를 제조할 수 있다.

그러나 상기 발효처리 가공방법은 일반적으로 고체 발효를 이용하는데, 고체 발효는 호기적인 상태와 발효 과정에서 생산되는 발효열을 제거하기 위해서 지속적으로 공기를 불어 넣어주어야 하는 단점이 있다. 또한 상기 발효처리 가공방법은 적정 수준 이상의 항영양인자를 제거하기 위해서는 48시간 이상의 긴 발효시간을 필요로 한다. 이와 같은 긴 발효시간은 제국기의 회전율을 낮게 하여 전체적인 원가상승을 초래한다.

이에 본 발명자들은 발효처리 대두박의 제조 시 발효시간을 최대한으로 단축하기 위하여 발효 대두박의 생산에 필요한 우수한 특성을 가진 바실러스 서브틸리스 TP6 균주(KFCC11343P, 국제기탁번호 KCCM11438P)를 이용하여 고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법을 개발하였다(한국특허공개 제10-2011-0027535호). 상기 방법은 항영양인자 제거 활성 및 단백질 분해능력이 우수한 바실러스 서브틸리스 TP6 균주를 이용하여 기존의 발효 대두박에 비해 짧은 발효시간에도 불구하고 동등 이상의 품질을 갖는 발효 대두박을 제조할 수 있다.

그러나 상기 방법은 대두박의 발효 시 대장균이나 살모넬라균에 오염되는 경우, 이러한 병원균에 대한 바실러스 서브틸리스 TP6 균주의 증식 억제능이 낮아 발효 과정 중에 병원균도 함께 증식하게 되는 문제점이 발생할 수 있다.

이에 본 발명자들은 대두박의 고체 발효에 유용한 개량된 특성을 갖는 발효 균주를 선발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항영양인자 제거, 단백분해효소 활성, 및 병원균에 대한 항균 활성이 우수하면서 발효 과정 중에 점액질 생성능이 저감된 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K2G 균주를 개발하였다. 또한 본 발명자들은 상기 균주를 이용하여 대두박을 고체 발효시키면, 종래에 비해 단축된 발효시간 내에 대두 단백질의 가수분해에 의한 저분자화 및 조단백 함량의 증가, 트립신 저해인자의 불활성화, 비소화성 다당류와 같은 항영양인자의 함량 감소 등으로 인해 소화 흡수율과 사료 효율이 증가된 고품질의 발효 대두박을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 발효 대두박 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 이용하여 고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 발효 대두박을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효 대두박을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 고체 발효에 의한 발효 대두박의 제조에 유용한 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주(KCCM11471P)를 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주는 항영양인자 제거 활성, 단백분해효소 활성 및 병원균에 대한 항균 활성이 우수하고 점액질 생성능이 저감되어 고체 발효에 의해 고품질의 발효 대두박을 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주는 활성이 강력한 단백분해효소를 생산하여 대두박의 소화를 저해하는 트립신 저해인자(TI)와 같은 다양한 다당류 항영양인자를 불활성화시킬 뿐만 아니라 고분자인 대두단백질을 대부분 가수분해하여 저분자화함으로써 발효 대두박의 소화 흡수율을 현저히 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주는 대두박의 구성성분 중 탄수화물을 이용하여 활발하게 생육하면서 균체를 구성하는 단백질로 전환시키기 때문에, 발효 대두박 내 조단백 함량을 상대적으로 증가시키며 이는 고품질 사료의 제조에 중요한 의미를 갖는다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 고체 발효에 의한 발효 대두박의 제조에 유용하게 사용될 수 있는 발효 균주를 선별하기 위하여 먼저 다양한 전통 발효식품으로부터 14종의 단백분해효소 생성능이 우수한 균주를 분리한다(표 1 참조).

상기와 같이 분리된 14종의 균주 중에서 가축에 식중독을 일으키는 대표적인 병원균인 대장균 및 살모넬라균에 대해 가장 우수한 항균활성을 나타내는 CJ823 균주를 선별한다.

선별된 CJ823 균주는 종래 고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법에서 발효 균주로 사용된 바실러스 서브틸리스 TP6 균주(KFCC 11343P; 한국특허공개 제10-2011-0027535호)에 비해 대장균과 살모넬라균 에 대해 월등히 우수한 항균활성을 나타낸다(표 2 참조).

또한, CJ823 균주는 실제 발효 과정 중에서도 살모넬라균의 생육을 효과적으로 억제하여 고품질의 발효 대두박 제조에 적합한 것으로 확인된다(표 3 참조).

이처럼 CJ823 균주는 단백분해효소를 고농도로 생산하고 병원균에 대해 우수한 항균활성을 나타내지만, 발효 과정 중에 생산되는 효소에 의해서 원료 대두의 당질, 단백질에서 유래된 레반형의 프락탄(levan form fructan)과 폴리글루타메이트(polyglutamate)의 중합으로 인해 끈적끈적한 점액질이 생성된다. 이러한 점액질의 생성은 발효 대두박의 대규모 생산 시 발효 공정의 제어, 발효물의 이송 등에 문제점을 야기할 수 있다.

이에 본 발명자들은 CJ823 균주의 효소적/생리적 특성은 그대로 유지하면서 점액질의 생성능이 저감된 변이주를 개발하기 위해 CJ823 균주에 UV를 조사하여 돌연변이를 유발한다(도 3 참조).

먼저 254 ㎚의 UV를 CJ823 균주에 조사한 후 탈지유 함유 선별배지에서 콜로니 형태 및 점액질의 형성에 의한 투명환(clear zone) 형성 여부에 따라 16종의 변이주를 선별한다. 선별된 16종의 변이주를 고체 배양 후 단백분해효소 활성과 γ-PGA(Poly-γ-Glutamic Acid) 함량을 분석하여 단백분해효소 활성은 가장 높으면서 상대적으로 낮은 γ-PGAA 함량을 나타내는 U304 변이주를 최종 선별한다(표 4 참조).

최종 선별된 U304 변이주의 동정을 위하여 일차적으로 당 이용성을 분석한 결과, U304 변이주는 생화학적 특성상 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스와 98%의 유사율을 나타내는 것으로 확인된다(표 5 참조).

또한, 16S rRNA 염기 서열 분석 결과, U304 변이주는 서열번호: 1의 16S rRNA 염기 서열을 갖는다. 상기 서열을 근거로 공지 균주와의 서열 상동성 비교 및 계통분류학적 유연관계를 분석한 결과, U304 변이주는 바실러스 아밀로리퀴페시언스와 99.92%의 유사성을 나타내며 계통수에서 가장 유연관계가 높은 것으로 판명된다(도 5 참조).

이에 상기 생화학적 특성, 서열 상동성 및 계통분류학적 우연관계 분석 결과를 종합하여 본 발명에 따른 U304 변이주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 2013년 11월 7일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11471P를 부여 받았다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주는 단백분해효소를 고농도로 생산하고 대장균 또는 살모넬라균과 같은 병원균에 대해 우수한 항균활성을 나타내는 모균주의 특성은 그대로 유지하면서, 폴리-γ-글루탐산과 같은 고분자 물질의 생성이 현저히 저하되어 점액질 생성능이 저감된 개량 균주로서, 고체 발효에 의한 발효 대두박의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 유용성을 확인하기 위하여 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주의 고체 발효에 의한 조단백 함량의 변화를 조사한 결과, 24시간 발효 시 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주로 발효된 대두박은 종래 대두박 발효 균주로 알려진 바실러스 서브틸리스 TP6 균주로 발효된 대두박과 동등 수준 이상의 조단백 함량을 나타냄을 확인한다(표 6 참조).

또한, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주의 발효에 의한 대두박 내 트립신 저해인자(TI)의 함량 변화를 조사한 결과, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주로 16시간 발효된 대두박의 TI 함량은 바실러스 서브틸리스 TP6 균주로 24시간 발효된 대두박의 TI 함량에 상응하는 것으로 나타나, 16시간 발효만으로 동등 수준의 항영양인자 저감 효과가 달성됨을 확인한다(표 7 참조).

상기 결과는 고체 발효에 의한 발효 대두박의 제조 시 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주가 고품질 단백질 사료로서 조단백 함량은 높고 항영양인자 함량은 낮은 발효 대두박을 종래에 비해 단축된 발효시간으로 제조할 수 있음을 의미하는 것이다. 이러한 발효시간 단축은 제국기의 회전율을 높여주고 이는 년간 생산 가능한 배치수의 증가로 이어져 소비자에게 더욱 저렴한 값에 고품질의 발효 대두박을 공급할 수 있다는 점에서 본 발명의 우수성을 확인할 수 있다.

이에 본 발명자들은 항영양인자 제거 활성, 단백분해효소 활성, 및 병원균에 대한 항균 활성이 우수하고 점액질 생성능이 저감되어 고체 발효에 의한 고품질의 발효 대두박 제조에 유용하게 사용될 수 있는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 부다페스트 조약 하에 2013년 11월 7일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11471P를 부여 받았다.

발명의 다른 양태에서, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 이용하여 고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법은

a) 대두박에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계;

b) 상기 열처리된 대두박을 냉각한 후 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 접종하는 단계; 및

c) 상기 대두박에 접종된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 고체 배양하여 발효 대두박을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

단계 a)는 원료인 대두박에 수분을 첨가하고 열처리를 수행하는 단계로, 원료 대두박은 고체 발효하기 전에 적당량의 물을 직접 분무, 혼합하여 수분 함량을 조절한 다음 일정한 시간 동안 열처리하는 것이 바람직하다.

발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 a)에서 수분은 대두박의 수분 함량이 30 내지 80%(v/w), 바람직하게는 30 내지 70%(v/w), 더욱 바람직하게는 40 내지 60%(v/w)가 되도록 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 수분 함량 범위를 갖는 대두박은 저 수분으로 인한 발효 속도의 지연을 방지하고 대두박의 이송 및 발효 후 건조 공정에 많은 비용이 소요되는 문제점을 개선할 뿐만 아니라 열효율 측면에서 바람직하다.

이어, 수분이 첨가된 대두박을 열처리하는데, 열처리의 목적은 원료 대두박 중의 잡균을 사멸시키는 동시에 대두 세포벽을 파괴하고 단백질을 변성시킴으로써 목적하는 미생물이 활발히 생육할 수 있는 환경을 제공해 주기 위한 것이다. 열처리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 스팀(steam) 또는 과열 수증기(superheated steam)를 이용하여 수행된다.

발명의 바람직한 구현에에 따르면, 단계 a)의 열처리는 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 60분간 증자하거나 200 내지 300℃의 과열 수증기로 수초 내지 수분의 단시간 동안 열처리하는 것이다. 보다 바람직하게는, 70 내지 130℃의 스팀으로 10 내지 30분간 증자하고, 가장 바람직하게는 80 내지 121.1℃의 스팀으로 10 내지 30분간 증자하는 것이다.

열처리 온도가 낮거나 처리 시간이 짧은 경우에는 잡균의 살균 효과가 저하되고 이후의 발효 공정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으며, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지는 경우에는 대두박 내 단백질의 변성으로 인한 소화율이 감소되어 최종 제품의 품질이 자하되는 문제점이 발생한다. 따라서, 이러한 문제점이 발생하지 않도록 열처리 온도 또는 처리 시간을 상기 범위 내에서 채택하는 것이 바람직하다.

이러한 열처리 과정을 통하여 대두박에 존재하는 오염균이 거의 사멸되고 이후 공정인 고체 발효가 원활하게 진행되는 화학적 환경이 조성되는 효과가 있을 뿐만 아니라 소화율을 저해하는 트립신 저해인자(TI)와 같은 항영양인자가 약간 감소하는 효과도 기대할 수 있다.

단계 b)는 상기와 같이 열처리된 대두박을 고체 발효가 가능한 온도로 냉각한 후 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 접종하는 단계이다. 본 발명에서 대두박의 냉각은 열처리가 종결된 후 자연적으로 진행되는데, 냉각 속도를 높여 과열을 방지하고 균일하게 냉각하기 위하여 컨베이어(conveyor)식 방냉기를 이용한 이송 과정을 거치면 쉽게 진행할 수 있다.

발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 b)에서 대두박은 30 내지 50℃로, 보다 바람직하게는 35 내지 45℃로, 가장 바람직하게는 37℃로 냉각된다.

열처리된 대두박을 냉각한 후 제조된 대두박 배지에 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 배양한 전배양액을 그대로 또는 적절히 살균수로 희석하여 가능한 균일하게 접종하는 것이 바람직하다.

열처리된 대두박에 접종하는 발효 균주의 양은 대두박의 고체 발효를 좌우하는 중요한 요인이 된다. 열처리된 대두박에 대한 발효 균주의 접종량은 접종 직후의 균수가 10⁵ 내지 10⁹ CFU/g이 되게 하는 것이 바람직하다.

접종량이 10⁵ CFU/g 미만인 경우에는 종균 발효액의 소요량이 적은 반면에 대두박을 발효시키는데 많은 시간이 소요되어 제품 생산에 요구되는 발효시간이 길어지고 잡균이 오염될 가능성이 높은 단점이 있다. 반면, 접종량이 10⁹ CFU/g을 초과하는 경우에는 발효시간은 상당히 단축할 수 있으나, 접종용 종균의 생산이 부담이 되는 단점이 있다. 특히 사용하는 발효 균주의 생육 특성과 발효 장치의 종류에 따라 발효 성적이 크게 좌우되므로 생산 단계에서 균주의 특성을 고려하여 접종량을 적절히 선정하는 것이 바람직하다.

단계 c)는 대두박에 접종된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 고체 발효시켜 발효 대두박을 수득하는 단계로, 예컨대 충진층 발효기(packed-bed fermentor)를 사용하여 발효시킨다.

충진층 발효기에는 회분식 통기배양장치, 밀폐식 배양장치, 연속식 통기배양장치 등 여러 가지 형식이 있으며, 대두박의 고체 발효에 유용한 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.

발명의 바람직한 구현예에 따르면, 충진층 발효기에 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주가 접종된 대두박을 5 내지 50 ㎝ 두께로 올려놓고 20 내지 50℃에서 12 내지 72시간 동안 발효시킨다. 이때, 대두박의 충진층 두께는 두꺼울수록 바람직하고, 30 내지 45℃에서 12 내지 48시간 동안 발효시키는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 37℃에서 24시간 동안 발효시키는 것이다.

본 발명의 방법은 상기 단계 c) 이후에 수득된 발효 대두박을 저온 저습 건조 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

발효 과정에서 대두박 중의 수분은 일부 증발하지만 발효 종료 직후에는 잔존 수분 함량이 20 내지 50%(v/w)로 상당히 높다. 그러나 발효 대두박 제품의 최종 수분 함량은 10 내지 12%(v/w)가 바람직하므로 건조 공정이 필요하다.

또한, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 이용한 고체 발효 시 발효 대두박의 상태가 매우 양호하지만 부분적으로 약하게 엉긴 덩어리를 형성하므로 건조 후 발효 대두박의 입자 크기가 균일하게 분쇄할 필요가 있다.

건조 및 분쇄는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으나, 과도하게 고온에서 건조할 경우에는 발효 대두박 중의 생균이 대부분 사멸되므로 주의하여야 한다. 바람직하게는 생균이 사멸되지 않는 저온에서 건조해야 하며, 저온 저습도의 열풍으로 건조하는 것이 가장 바람직하다. 분쇄 과정은 발효 대두박을 이용하고자 하는 목적에 따라 다양한 크기로 분쇄할 수 있으며, 분쇄 방법으로서 바람직하게는 햄머 밀(hammer mill)을 이용할 수 있다.

상술한 본 발명의 방법에 따라 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 이용하여 대두박을 고체 발효함으로써 대두박에 함유된 TI를 비롯하여 각종 항영양인자가 감소되고 단백질의 가수분해 및 저분자화로 소화 흡수율이 향상되며, 조단백 함량이 증가된 발효 대두박을 수득할 수 있고, 이는 사료로서의 절대적인 가치가 개선된 것으로 동물성 단백질을 대체할 수 있는 고품질 단백질 사료 재료로서 이용가치가 매우 높다.

이에 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 방법에 의해 제조된 발효 대두박을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사료 조성물 내 발효 대두박의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 10 내지 90 중량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 조성물은 투여를 위해서 발효 대두박 이외에 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.

본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 바람직하기로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K2G 균주(KCCM11471P)는 항영양인자 제거 활성, 단백분해효소 활성 및 병원균에 대한 항균 활성이 우수하고 발효 과정 중에 저감된 점액질 생성능을 나타내기 때문에, 이를 종균으로 이용하여 대두박을 고체 발효시키면 대두 단백질의 가수분해에 의한 저분자화 및 조단백 함량의 증가, 트립신 저해인자의 불활성화, 비소화성 다당류와 같은 항영양인자의 함량 감소 등으로 인해 소화 흡수율과 사료 효율이 증가된 고품질의 발효 대두박을 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 단백분해효소 고생산 균주를 선별하기 위한 실시예 1의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 선별된 단백분해효소 고생산 균주의 대장균과 살모넬라균에 대한 생육 저해활성을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 단백분해효소 고생산 균주를 대상으로 점액질 생성능이 저감된 변이주를 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 변이주 선별 과정에서 γ-PGA 함량의 정성 분석을 위해 농도 구배 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
레인 M: 분자량 마커
레인 1: 1 g/L γ-PGA 표준물질
레인 2: 0.5 g/L γ-PGA 표준물질
레인 3: 0.25 g/L γ-PGA 표준물질
레인 4: CJ823 균주
레인 5: U304 변이주
레인 6: U305 변이주
레인 7: U306 변이주
레인 8: U307 변이주
도 5는 상기 과정에 따라 선별된 변이주 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G의 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통수(phylogenic tree)이다.
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 이용한 고체 발효에 의해 수득된 발효 대두박의 가수분해화 정도를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
레인 M: 분자량 마커
레인 1: 원료(생대두박)
레인 2: TP6 발효 20시간
레인 3: K2G 발효 16시간
레인 4: K2G 발효 20시간

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 단백분해효소 고생산 균주의 선별

본 발명자들은 단백분해효소 생성능이 우수한 균주를 분리하기 위해 다양한 전통 발효식품(김치, 장류, 전통민속주, 젓갈 등)으로부터 약 3000천 종의 미생물을 분리하고, 이들 중에서 동정을 통해 확인된 약 1308 종의 사료적합성(단미사료협회, 생균제) 바실러스균을 중심으로 단백분해효소의 발현이 높고, 항균활성을 가지며, 생육속도가 빠른 다기능 균주를 찾고자 하였다.

구체적으로, 단백분해효소 고생산 균주의 선별은 2%(w/v) 탈지유(Difco, USA)가 함유된 YM 한천배지(yeast extract 3.0 g, malt extract 3.0 g, peptone 10.0 g, agar 20.0 g)에서 기질이 분해되어 생기는 투명환의 크기를 비교하여 선별하였다(도 1).

이로부터 선별된 단백분해효소 고생산 균주를 각각 TSB 배지(ezymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3±0.2 at 25℃)에 접종한 후 37℃, 200 rpm 조건에서 12시간 동안 배양하고, 배양액을 탈지유 함유 YM 한천배지에 1.0 ㎕씩 점적(spotting)하였다. 상기 한천배지를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후 배지 위에 형성된 투명환의 지름을 측정하였다.

이때, 종래 고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법에서 발효 균주로 사용된 바실러스 서브틸리스 TP6(KFCC 11343P)를 대조군으로 사용하였다(한국특허공개 제10-2011-0027535호).

균주명	균주 번호	투명환 직경(㎜)	균주 번호	투명환 직경(㎜)
바실러스속	TP6	3.30	CJ823	6.23
	CJ361	5.46	CJ873	5.48
	CJ400	5.88	CJ924	5.69
	CJ434	5.34	CJ933	5.20
	CJ453	6.40	CJ957	4.98
	CJ457	6.10	CJ968	4.87
	CJ739	5.86	CJ974	5.00
	CJ759	5.43	-	-

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 14종의 균주를 단백분해효소 고생산 균주로 선별하였는데, 이들은 모두 바실러스 서브틸리스 TP6에 비해 더 높은 단백분해효소 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 2: 병원균 증식 억제능을 갖는 균주의 분리

가축에 식중독을 일으키는 대표적인 병원균인 대장균 및 살모넬라균의 생육이나 증식을 억제할 수 있는 균주를 분리하고 발효 대두박 생산에 적용하여 살모넬라균이 없는 무독성 제품을 개발하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리한 14종의 단백분해효소 고생산 균주를 대상으로 병원균에 대한 항균활성을 측정하였다.

병원균에 대한 항균활성은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium ATCC14028)과 대장균(E. coli KCCM11835)을 대상으로 spot-on-the-lawn test 방법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 14종의 단백분해효소 고생산 균주 각각을 GYP 배지(glucose 10.0 g, yeast extract 8.0 g, polypeptone 2.0 g, pH 7.0)에 접종하고 37℃에서 180 rpm으로 12시간 동안 액상 배양하였다. 상기 단백분해효소 고생산 균주의 배양액 1.5 ㎕를 살모넬라 티피뮤리움 ATCC14028과 대장균 ATCC11835 각각이 1×10⁵ CFU/㎖ 개수로 첨가된 GYP 한천배지(glucose 10.0 g, yeast extract 8.0 g, polypeptone 2.0 g, agar 15.0 g, pH 7.0)에 점적한 후 37℃에서 15시간 동안 정치 배양하였다. 배지 위에 점적한 단백분해효소 고생산 균주의 콜로니 주위에 형성되는 생육 저해환(inhibition zone)의 크기를 관찰하여 활성 역가를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때, 바실러스 서브틸리스 TP6를 대조군으로 사용하였다.

균주명	균주명	대장균 (KCCM11835)	살모넬라 티피뮤리움 (ATCC14028)
바실러스속	TP6	+	++
	CJ361	++	++
	CJ400	++	++
	CJ434	-	-
	CJ453	-	-
	CJ457	-	-
	CJ739	+++	++
	CJ759	-	-
	CJ823	++++	++++
	CJ873	-	-
	CJ924	+++	++
	CJ933	-	-
	CJ957	-	-
	CJ968	++	++
	CJ974	+++	+

상기 표 2에서, '-' 또는 '+'는 생균 저해환의 지름 크기를 기준으로 활성 역가를 결정한 것으로, '-'는 항균 또는 항균활성이 없는 것을, '+'는 저해환의 지름 크기가 10.05 ㎜ 이하인 것을, '++'는 저해환의 지름 크기가 10.05 내지 14.05 ㎜인 것을, '+++'는 저해환의 지름 크기가 14.05 내지 17.05 ㎜인 것을, '++++'는 저해환의 지름 크기가 17.05 ㎜ 이상인 것을 의미한다.

가축에서 가장 빈번하게 발생되는 소화기성 질병의 원인균인 살모넬라균과 대장균을 대상으로 하여 선별된 14종의 단백분해효소 고생산 균주의 항균 스펙트럼을 조사한 결과, CJ823가 가장 우수한 항균력을 보이는 것으로 조사되었다. 선별된 CJ823은 대조군인 바실러스 서브틸리스 TP6에 비해 대장균(++++ vs. +)과 살모넬라균(++++ vs. ++) 모두에 대해서 월등히 높은 항균활성을 나타내었다.

실시예 3: 살모넬라 증식 억제 대두박 적용 실험

상기 실시예 2의 결과에 따르면, 한천배지 상에서 CJ823은 살모넬라균에 대해 우수한 항균활성을 나타내었다. 하지만 실제 대두박 발효 과정 중에서도 살모넬라균에 대한 증식 억제력을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다.

구체적으로, CJ823와 살모넬라 티피뮤리움 ATCC14028을 100℃에서 30분간 증자된 대두박(수분 45%)에 각각 4.5×10⁷ CFU/g과 1.0×10³ CFU/g 농도로 혼합 접종하고 37℃에서 24시간 동안 항습이 유지되는 조건에서 균수 변화를 관찰하였다. 이때, 대두박에 살모넬라 티피뮤리움을 단독 접종한 것을 대조군으로, 살모넬라 티피뮤리움과 바실러스 서브틸리스 TP6를 혼합 접종한 것을 비교군으로 사용하였다.

균주를 접종하고 발효 시작 전과, 12, 16 및 20 시간의 발효 경과 후에 일정량의 대두박을 취하여 0.8% NaCl 살균용액에 희석한 뒤 XLD 한천배지(yeast extract 3 g, lactose 7.5 g, sucrose 7.5 g, xylose 3.5 g, L-lysine 5 g, ferric ammonium citrate 0.8 g, Phenol Red 0.08 g NaCl 5 g, sodium deoxycholate 2.5 g, sodium thiosulfate 6.8 g, agar 13.5 g, final pH: 7.4±0.2 at 25℃)에 100 ㎕를 도포하여 살모넬라 티피뮤리움의 집락수를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

두 균주 사이의 비율 값은 주 발효 균주인 CJ823이 증자된 대두박에서 증식하는 동안 살모넬라 티피뮤리움이 오염된다는 가정 하에서 측정한 것이며, 실제 오염 비율은 발효 대두박 제조 환경에 따라 달라질 수 있다.

발효 시간	살모넬라 티피뮤리움 균수(×10/g)
발효 시간	살모넬라 티피뮤리움 단독	살모넬라 티피뮤리움 + TP6	살모넬라 티피뮤리움 + CJ823
0 시간	2330	2330	2330
12 시간	13900	2400	2000
16 시간	1200000	2300	50
20시간	3100000	2200	35

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 살모넬라 티피뮤리움만 접종한 대조군은 배양 시간이 증가함에 따라 균수가 꾸준히 증가하여 발효 20시간 경과 후에는 3.1×10⁷ CFU/g까지 증가한 반면, 바실러스 서브틸리스 TP6와 혼합 접종한 비교군에서는 살모넬라 티피뮤리움의 균수가 2.2×10⁴ CFU/g 수준으로 억제되었으며, 본 발명에 따른 CJ823과 혼합 접종한 실험군에서는 살모넬라 티피뮤리움의 균수가 이보다 더욱 감소하여 3.5×10² CFU/g 수준이었다.

상기 결과로부터 본 발명에 따른 CJ823이 실제 발효 과정 중에서도 살모넬라균의 생육을 효과적으로 억제하여 고품질의 발효 대두박 제조에 적합함을 알 수 있다.

실시예 4: 변이주의 선발

상기 실시예 1 내지 3에서 선별된 CJ823은 단백분해효소를 고농도로 생산하고 병원균에 대해 우수한 항균활성을 나타내지만, 발효 과정 중에 생산되는 효소에 의해서 원료 대두의 당질, 대두단백에서 유래된 레반형의 프락탄(levan form fructan)과 폴리글루타메이트(polyglutamate)의 중합으로 인해 끈적끈적한 점액질이 생성되었다. 대규모 산업화 과정에서 이러한 점액질의 과량 생성은 교반을 어렵게 하여 발효물 내의 용존 산소, 온도 등을 제어하는데 문제가 되고 이송을 어렵게 하는 등의 문제가 발생하였다.

이에 본 발명자들은 CJ823의 효소적/생리적 특성은 그대로 유지하거나 향상되면서 점액질의 생성능이 저감된 변이주를 개발하기 위하여, 하기와 같이 CJ823에 UV를 조사하여 돌연변이를 유발하였다. 변이주 선별과정은 도 3에 나타난 바와 같다.

먼저, CJ823를 TSB 한천배지(ezymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, agar 15.0 g, final pH: 7.3±0.2 at 25℃)에 도말하여 37℃에서 12시간 동안 배양하여 균주를 활성화하였다.

본 배양은 미리 준비한 TSB 배지(ezymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3±0.2 at 25℃)에 종균 현탁액을 1% 접종한 후 37℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 후 배양액을 25℃에서 8000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리하여 균체와 상청액을 분리한 후 균체만 취하여 0.8% NaCl 살균용액으로 세척하였다. 세척 후 회수된 균체를 UV 램프(VIBER LOURMAT, 115 V, 60 Hz)를 이용하여 254 nm 파장의 자외선을 조사하여 인공돌연변이 시켰다.

선별배지인 2% 탈지유 함유 TSA 한천배지(enzymatic digest of casein 15 g, enzymatic digest of soybean meal 5 g, NaCl 5 g, agar 15 g, final pH 7.3±0.2 at 25℃)에 도말하여 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 배양 후 형성된 투명환의 크기(직경, ㎜)를 캘리퍼스(Caliper, CD-20CPX, Mitutoyo, Kanagawa, Japan)로 측정하고, 단백질 분해활성이 높은 16종의 변이주를 1차 선발하였다.

이어서 선발된 16종의 변이주를 각각 열처리된 대두박에 접종하여 20시간 동안 배양하였으며, 이로부터 얻은 배양액을 25℃에서 8000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리하여 균체와 상청액을 분리하였다. 분리된 상청액의 γ-PGA 함량 은 문헌(Goto et al. Biosci . Biotechnol. Biochem ,. 56:1031-1035., 1992)에 개시된 방법에 따라 분리 및 정제하여 동결건조 후 회수된 γ-PGA의 무게를 측정하였다.

단백분해효소 활성은 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였고, γ-PGA 함량은 하기 2가지의 정성 및 정량 분석법을 이용하여 측정하였다.

먼저, γ-PGA 활성의 정성 분석을 위하여 상기에서 분리된 상청액 40 ㎕를 5× 염색 완충액 10 ㎕와 혼합한 후 5 내지 20%의 농도 구배 SDS-폴리아마이드 겔에 로우딩하여 농도 구배 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후 코마시 염색 시약으로 표준 단백질을 염색한 후 탈색하고, 다시 메틸렌 블루(methylene blue)로 폴리-γ-글루탐산을 염색하여 정성 평가하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 레인 4의 CJ823(모균주)의 상청액에서는 고분자의 폴리-γ-글루탐산이 검출되었으나, 레인 5의 U304 변이주의 상청액에서는 고분자 물질 생성능이 매우 약화된 반면 높은 단백분해효소 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

한편, γ-PGA 함량의 정량 분석은 고체발효 상등액에 동량의 증류수로 희석한 후 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 수득된 상징액에 6 M HCl로 pH를 3.0으로 조절한 다음 4℃에서 하루 동안 정치시켰다. 그런 후 25,000×g에서 30분간 다시 원심분리한 후 침전체를 회수하였다. 침전체를 100~200배의 증류수에 완전히 용해시킨 후 25,000×g에서 30분간 원심분리하여 불순물을 제거하고 4℃에서 하루 동안 투석(dialysis)하여 염을 제거하였다. 이를 동결건조하여 γ-PGA를 회수하였고, 이로부터 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

변이주	γ-PGA (g/L)	단백분해효소 (U/g)	변이주	γ-PGA (g/L)	단백분해효소 (U/g)
TP6	1.61	150	U609	6.13	15
CJ823	25.36	450	U610	11.09	450
U101	11.19	330	U611	21.77	260
U102	13.36	220	U612	12.05	400
U103	14.83	320	U813	10.12	180
U304	4.96	500	U814	23.13	370
U305	24.50	400	U815	1.06	260
U306	16.70	280	U816	5.26	100
U307	5.52	120	U1019	13.01	400

표 4에 나타난 바와 같이, 변이주의 대부분은 CJ823 대비 낮은 γ-PGA 함량을 보였으며, 이들 중에서 단백분해효소 활성은 가장 높으면서 상대적으로 낮은 γ-PGA 함량을 나타내는 U304 변이주를 최종 선발하였다. 특히, U304 변이주는 대조군인 바실러스 서브틸리스 TP6보다 낮은 γ-PGA 함량을 나타내면서 이보다 3배 이상 높은 단백분해효소 활성을 나타내었다.

최종 선발된 U304 변이주는 단백분해효소를 고농도로 생산하고 병원균에 대해 우수한 항균활성을 나타내는 모균주의 특성은 그대로 유지하면서 폴리-γ-글루탐산과 같은 고분자 물질의 생성이 현저히 저하되고 낮은 γ-PGA 함량을 나타내어 점액질 생성능이 저감된 것을 특징으로 한다.

실시예 5: U304 변이주( K2G )의 16S rRNA 유전자 염기서열 결정 및 계통수 분석

점액질 생성능이 저감된 U304 변이주의 동정을 위해, 균을 새로운 NA 한천배지에 접종하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 형성된 집락은 0.8% NaCl 살균용액에 희석 후 63종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 BCL ID card (bioMNitek Inc., Hazewood, USA)에 주입하였고, 15분 간격으로 결과들이 VITEK 2 Compact software(bioMVitek)에 통합적으로 저장 분석되면서 14시간 후 동정이 완료되었다.

16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 범용 프라이머(universal primer)로서 서열번호 2 및 3의 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')을 이용하되, 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭 후, 동정에 중요한 50~900 bp염기 서열을 포함하는 1,333 bp를 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 해독하였다. 16S rRNA 염기 서열 분석 결과, U304 변이주는 서열번호: 1의 16S rRNA 염기 서열을 갖는다.

유전자 염기 서열과의 유사성은 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program: National Institute of Biotechnology Information)과 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다(도 5).

특성	결과	특성	결과
β-Xylosidase	+	D-Mannitol	+
L-Lysine-arylamidase	-	D-Mannose	+
L-Aspartate arylamidase	-	D-Melezitose	-
Leucine arylamidase	(+)	N-Acetyl-D-glucosamine	-
Phenylalanine arylamidase	+	Palatinose	(+)
L-Proline arylamidase	-	L-Rhamnose	-
β-Galactosidase	-	β-Glucosidase	(+)
L-Pyrrolydonyl- arylamidase	+	β-Mannosidase	-
α-Galactosidase	+	Phosphoryl choline	-
Alanine arylamidase	+	Pyruvate	+
Tyrosine arylamidase	+	α-Glucosidase	-
β-N-Acetyl-glucosaminidase	(-)	D-Tagatose	-
Ala-Phe-Pro arylamidase	+	D-Trehalose	(+)
Cyclodextrine	-	Insulin	-
D-Galactose	-	D-Glucose	(+)
Glycogene	-	D-Ribose	-
myo-Inositol	-	Putrescine assimilation	-
Methyl-A-D-glucopyranoside acidification	+	Kanamycin resistance	(-)
Ellman	-	Oleandomycin resistance	-
Methyl-D-xylosdie	-	Esculin hydrolyse	+
α-Mannosidase	-	Tetrazolium Red	-
MALTOTRIOSE	-	Plomixin_B resistance	-
Glycine ARYLAMIDASE	(-)

63종류의 생화학적 검사 결과를 바이텍 2 컴팩트 소프트웨어(Vitec 2 Compact Software)로 분석한 결과, 98%의 확률로 바실러스 서브틸리스/바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus subtilis/amyloliquefacien)로 분류되었다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 계통도 분석 결과 U304 변이주는 표준 균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 아종. 플란타룸(Bacillus amyloliquefaciens subsp . plantarum) FZB42T(CP000560)과 가장 가까운 근연 관계를 나타내었고, 16S rDNA 유전자 서열 상동성은 99.92%(1332 bp / 1333 bp)로 확인되었다.

이에 상기 생화학 특성과 계통분류학적 유연관계 분석 결과를 종합하여 본 발명에 따른 U304 변이주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로 명명하였고, 부다페스트 조약 하에 2013년 11월 7일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM11471P로 기탁하였다.

실시예 6: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 를 이용한 대두박 발효 시 발효시간에 따른 조단백 함량 변화

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 이용한 대두박 발효 시 발효시간에 따른 조단백 함량의 변화를 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 대두박 400 g을 수분 함량을 45%로 맞추어 100℃에서 30분간 증자하고, 40℃ 이하로 냉각시켰다. 이어서, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 TSB 한천배지(ezymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, agar 15.0 g, final pH: 7.3±0.2 at 25℃)에 도말하고 37℃에서 12시간 동안 배양하여 균주를 활성화하였다. 활성화된 균주를 0.8% NaCl 살균용액 9 ㎖에 약 2 백금(A_660nm에서 0.2 정도로 희석함)을 현탁하였고, 이 현탁액을 종균으로 사용하였다. 본 배양은 미리 준비한 40 ㎖의 TSB 배지(ezymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3±0.2 at 25℃)에 종균 현탁액을 1% 접종한 후 37℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하였다.

준비된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G의 배양액 40 ㎖(5.0×10⁷ cfu/㎖)을 수분 함량을 45%로 맞추어 증자된 대두박에 넣고 잘 혼합한 후 37℃에서 20시간 동안 항습이 유지되는 조건에서 정치 배양하였다. 상기 배양 시료를 60℃ 건조기에서 수분 함량 10% 이하가 될 때까지 건조한 후 킬달 장치(Kjeldahl system, Kjltec 2100)를 사용하여 각 시료의 조단백 함량을 측정하였다. 이때, 발효 시작 전과 발효 12, 16 및 20시간 경과 후에 조단백 함량을 측정하였고, 대조군으로 바실러스 서브틸리스 TP6를 사용하였다. 이로부터 측정된 조단백 함량(%, 수분 10% 보정)을 하기 표 6에 나타내었다. 이때, 대조군으로 바실러스 서브틸리스 TP6를 사용하였다.

구분	TP6 (%, 수분10% 보정)	K2G (%, 수분10% 보정)
생대두박	50.86±0.15	50.86±0.15
증자 대두박	50.91±0.12	50.91±0.12
발효 0시간	51.19±0.38	51.19±0.38
발효 12시간	54.21±1.18	55.59±0.66
발효 16시간	55.07±0.79	56.46±0.19
발효 20시간	55.86±0.75	57.32±0.28
발효24시간	56.36±0.80	58.02±0.45

표 6에 나타난 바와 같이, 24시간 발효를 기준으로 할 때, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로 발효된 대두박은 종래 대두박 발효 균주로 알려진 바실러스 서브틸리스 TP6로 발효된 대두박과 동등 이상 수준의 조단백 함량을 나타내었다

상기 결과로부터 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G가 고품질 단백질 사료로서 발효 대두박의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 를 이용한 대두박 발효 시 발효시간에 따른 TI 함량 변화

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 이용한 대두박 발효 시 발효시간에 따른 트립신 저해인자(TI)의 함량 변화를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 6에서와 같이 대두박 400 g을 수분 45%로 맞추어 100℃에서 30분간 증자하고, 증자된 대두박에 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 4.5×10⁷ cfu/㎖의 농도로 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 항습이 유지되는 조건에서 배양하였다. 발효 시작 전과 발효 16, 20 및 24시간 경과 후에 TI 함량을 AACC-71-10(American association of cereal chemists, 1995)에 따라 측정하였고, 이로부터 측정된 TI 함량(㎎/g)을 하기 표 7에 나타내었다. 이때, 대조군으로 바실러스 서브틸리스 TP6를 사용하였다.

구분	TP6 (TI, ㎎/g)	K2G (TI, ㎎/g)
생대두박	4~5	4~5
증자 대두박	2~2.5	2~2.5
발효16시간	1.26	0.39
발효20시간	0.53	0.00
발효24시간	0.38	0.00

표 7에 나타난 바와 같이, 발효 16시간 경과 후 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로 발효된 대두박은 0.39 ㎎/g의 TI 함량을 나타내었는데, 이는 종래 대두박 발효 균주로 알려진 바실러스 서브틸리스 TP6로 24시간 발효된 대두박의 TI 함량에 상응하는 것으로, 16시간 발효만으로 동등 수준의 항영양인자 저감 효과를 보여주었다.

이러한 발효시간 감소는 제국기의 회전율을 높여주고 이는 년간 생산 가능한 배치수의 증가로 이어져 소비자에게 더욱 저렴한 값에 고품질의 발효 대두박을 공급할 수 있다는 점에서 본 발명의 우수성을 확인할 수 있다.

실시예 8: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 를 이용한 대두박 발효 시 대두단백질의 가수분해화 정도 및 KOH 용해도 측정

대두박은 단백질 함량이 높은 식물성 사료 원료이지만 항영양인자 및 소화 흡수율이 낮은 단백질의 함유로 인해 특히 어린 가축의 성장에 부족한 단점도 있다. 이런 단점을 개선하는 방법 중의 하나가 미생물을 이용한 발효를 통해 가수분해된 펩티드 형태로 만들거나 소화가 쉽게 일어나도록 저분자량의 단백질로 분해하는 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G는 단백분해효소 고생산 균주로서, 이를 이용하여 제조된 발효 대두박은 상기 균주로부터 분비된 단백분해효소에 의해 대두단백질이 분해될 것으로 예상하였다.

이를 확인하기 위해 먼저 본 발명에 따른 발효 대두박의 가수분해 정도를 측정하였다. 상기 실시예 6에서와 같이 대두박 400 g을 수분 45%로 맞추어 100℃에서 30분간 증자하고, 증자된 대두박에 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 4.5×10⁷ cfu/㎖의 농도로 접종하고 37℃에서 24시간 항습이 유지되는 조건에서 배양하였다. 이로부터 수득된 배양액을 25℃에서 8000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리하여 균체와 상청액을 분리하였다. 분리된 상청액 40 ㎕를 5× 염색 완충액 10 ㎕와 혼합한 후 SDS-PAGE(10%)를 수행하여 분자량에 따른 단백질 이동상을 확인하였다. 전기영동 후 폴리아마이드 겔을 쿠마시 브릴리언트 시약(Coomassie Brilliant R250)으로 염색하여 조성물질의 단백질 조성과 분자량을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 대조군으로 생대두박과 바실러스 서브틸리스 TP6으로 제조된 발효 대두박을 사용하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로 제조된 발효 대두박은 생대두박 또는 다른 균주로 제조된 발효 대두박과 비교하여 크기가 작은 분자 쪽으로 단백질의 밀도가 치우쳐져 있는 것을 확인할 수 있다. SDS-폴리아마이드겔 상에서 위의 밴드가 분자량이 큰 단백질이고 아래의 밴드가 분자량이 작은 단백질을 나타낸다. 상기 결과로부터, 동일한 분자량일 경우, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 이용한 발효에 의해서 대두박 내 분자량이 큰 단백질이 분자량이 작은 단백질로 가수분해되었음을 확인하였다.

한편, 종래 보고에 따르면, KOH(potassium hydroxide) 용해도가 80%인 대두박과 이보다 낮은 농도(55% 내지 68%)의 대두박을 이용하여 4회의 육계 사양 실험을 수행한 결과, KOH 용해도가 낮은 대두박을 급여한 육계의 체중, 사료 섭취량 및 사료 효율이 KOH 용해도가 80%인 대두박을 급여한 육계에 비하여 유의하게 낮거나 낮아지는 경향을 보였다(Abulto et al. J. Appl. Poult. Res. 7:189-195, 1998b).

이에 본 발명에 따른 발효 대두박의 KOH 용해도를 문헌(Parsons et al. J Anim Sci ., 69: 2918-24, 1991)에 개시된 방법에 따라 측정하였다. 간략히 설명하면, 상기와 같이 준비된 발효 대두박 0.1 g을 0.2% KOH 용액에 첨가하고 20분간 혼합한 다음 여과하여 여액에 대한 질소 함량을 킬달 장치로 측정하여 용해도를 환산하였으며, 그 결과를 표 8 나타내었다.

구분	TP6 (KOH, %)	K2G (KOH, %)
생대두박	80.17±2.38	80.17±2.38
증자 대두박	73.35±3.32	73.35±3.32
발효16시간	78.38±2.85	85.03±3.07
발효24시간	78.99±3.01	85.20±3.60

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 증자된 대두박에서는 KOH 용해도가 80%에서 70%까지 낮아지는 경향을 보였으나, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G를 이용한 고체 발효가 진행되면서 KOH 용해도는 다시 85%까지 상승하였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G로부터 분비된 단백분해효소에 의해 대두단백이 분해되면서 KOH가 상승한 것으로 판단된다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11471P

20131107

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11438P

20050121

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Bacillus sp. strain with improved productivity of fermented soybean meal and method for producing fermented soybean meal using the same <130> PA13117KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1333 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens K2G 16s rRNA <400> 1 acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 60 ggttgtctga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 120 acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 180 gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 240 cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 300 tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 360 gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 420 taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 480 tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 540 cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 600 gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 660 gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 720 tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 780 gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 840 tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 900 ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 960 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1020 agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1080 acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1140 aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1200 agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1260 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1320 cgaagtcggt gag 1333 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 518F <400> 2 ccagcagccg cggtaatacg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 800R <400> 3 taccagggta tctaatcc 18

Claims

고체 발효에 의해 발효 대두박을 제조하는 방법에 있어서, 기탁번호 KCCM11471P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 대두박에 접종하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 대두박의 제조방법.
제1항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
a) 대두박에 수분을 첨가하고 열처리하는 단계;
b) 상기 열처리된 대두박을 냉각한 후 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 접종하는 단계; 및
c) 상기 대두박에 접종된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주를 고체 배양하여 발효 대두박을 수득하는 단계.
제2항에 있어서, 단계 a)에서 수분이 첨가된 대두박이 30 내지 80%(v/w)의 수분 함량을 갖는 방법.
제2항에 있어서, 단계 a)의 열처리가 대두박을 70 내지 130℃에서 10 내지 30분간 열처리하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 단계 b)에서 대두박이 30 내지 50℃로 냉각되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 단계 b)에서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주가 접종 직후에 10⁵ 내지 10⁹ CFU/g의 균수가 되도록 접종되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 단계 c)에서 고체 배양이 30 내지 45℃에서 12 내지 48 시간 동안 실시되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 단계 c)에서 수득된 발효 대두박을 건조 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
기탁번호 KCCM11471P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 발효 대두박.
제10항에 따른 발효 대두박을 포함하는 사료 조성물.