BR112016016245B1

BR112016016245B1 - Cepa de bacillus sp possuindo produtividade melhorada de farelo de soja fermentado e método para produção de farelo de soja fermentado utilizando a mesma

Info

Publication number: BR112016016245B1
Application number: BR112016016245-5A
Authority: BR
Inventors: Taek Beom Kim; Song Hui Gwon; Bi Na Kim; Seong Jun Cho; Kyung Il Kang; Seung Won Park; Young Ho Hong; Min Ju Park
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2022-10-25
Also published as: DK3101136T3; BR112016016245A2; CN106795528A; US20170020161A1; PL3101136T3; JP6367974B2; US11259545B2; KR101517326B1; US10874118B2; TW201534221A; WO2015115790A1; CN106795528B; ES2742889T3; EP3101136B1; EP3101136A4; JP2017506081A; EP3101136A1; TWI535385B; US20200345035A1

Abstract

CEPA DE BACILLUS SP. COM AUMENTO DE PRODUTIVIDADE DE FARELO DE SOJA FERMENTADO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE FARELO DE SOJA FERMENTADO USANDO A MESMA. A presente invenção refere-se a uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, que é excelente na remoção de fatores antinutricionais e na atividade de protease, e apresenta uma excelente atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos e produtividade reduzida de substâncias viscosas, um método para a produção de um farelo de soja fermentado que utiliza a cepa, um farelo de soja fermentado produzido a partir desta, e uma composição alimentar incluindo o mesmo. O farelo de soja fermentado preparado pela cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, possui alguns fatores antinutricionais, tais como inibidores de tripsina, oligossacarídeos e polissacarídeos de soja, e um alto teor de proteínas brutas, e uma alta solubilidade proteica, e também é composto por pequenos peptídeos digeríveis por animais de criação devido à baixa molecularização, sendo, portanto, efetivamente utilizado como uma ração com proteína vegetal de alta qualidade com excelente taxa de absorção e eficiência alimentar.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001]A presente invenção refere-se a uma nova cepa de Bacillus sp. com aumento da produtividade de farelo de soja fermentado e um método para a produção de um farelo de soja fermentado utilizando a mesma. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma nova cepa de Bacillus amyloliquefaciens com aumento da produtividade de farelo de soja fermentado, que é excelente na remoção de fatores antinutricionais e na atividade de protease, e apresenta uma alta atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos e produção reduzida de substâncias viscosas durante a fermentação, um método para a produção de um farelo de soja fermentado que utiliza a cepa, um farelo de soja fermentado produzido a partir desta, e uma composição alimentar incluindo o mesmo

FUNDAMENTOS

[002]Tendo sido provado que doenças, como a encefalopatia espongiforme bovina, que foram fatais para os seres humanos, são decorrentes de componentes de proteína animal adicionados à ração, há uma tendência global célere de substituir proteínas animais adicionadas à ração por proteínas vegetais.

[003]Um farelo de soja sem gordura (doravante referido como "farelo de soja") é a fonte mais comum de proteínas vegetais utilizada nos mercados de alimentos como um substituto para as proteínas de origem animal, tais como farinha de peixe, farinha de carne e ossos ou plasma. O farelo de soja também é chamado de torta de óleo de soja, que é um subproduto sólido resultante da extração do óleo de soja. Na Coreia, o farelo de soja, utilizado como fonte de proteína vegetal, responde por 60% do fornecimento total de alimentos, chegando a 2 milhões de toneladas por ano (Korea Feed Ingredients Association, 2004).

[004]O farelo de soja contém 55 ~ 56% por peso de proteínas, 13 a 14% por peso de carboidratos solúveis, e 21 ~ 22% por peso de carboidratos insolúveis, com base no peso seco. Além disso, o farelo de soja contém cerca de 1% por peso de gordura bruta e cerca de 4 a 6% por peso de cal (Na-Kyu Han, Vegetable protein feed, Food Processing, Sun-Jin Publishing Co., 67-107, 1998).

[005]Entretanto, o farelo de soja contém uma variedade de fatores antinutri- cionais (ANFs) que podem prejudicar, de forma problemática, a taxa de digestão quando utilizados como ração (Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990). Entre eles, o inibidor de tripsina (TI) é representativo, e em animais terrestres, o TI alimentar é conhecido por interferir nas funções enzimáticas adequadas da tripsina e quimotrip- sina, levando a uma redução na disponibilidade de proteínas totais. Particularmente, uma vez que estes fatores antinutricionais afetam significativamente animais de criação jovens, o uso do farelo de soja na ração de animais de criação jovens é limitado. Além disso, uma substância aglutinante de eritrócitos, a hemaglutinina, oligossacarí- deos que causam diarreia e dor abdominal em animais de criação, tais como rafino- se, estaquiose, etc., ou polissacarídeos que inibem a absorção de nutrientes são conhecidos. Alguns deles são destruídos pelo tratamento térmico. No entanto, por meio deste processo, as proteínas de soja são desnaturadas e, logo, a sua solubilidade é reduzida, e proteínas essenciais, tais como a lisina, etc, podem ser destruídas. Recentemente, o uso mais eficiente das proteínas de soja e métodos de processamento para aumento da eficiência através da remoção de fatores antinutricio- nais foram desenvolvidos.

[006]Os produtos de soja processados atuais, tais como os concentrados de proteína de soja, proteínas de soja isoladas, ou proteínas de soja hidrolisadas, são geralmente produzidos por tratamento químico ou tratamento enzimático. No entanto, o método de processamento químico é caro, e provoca a diminuição da solubilidade da proteína, devido à desnaturação das proteínas, ou a perda de aminoácidos solúveis devido ao tratamento térmico, tratamento químico, ou secagem por calor durante o processo de produção. Por esta razão, o tratamento térmico é realizado, mas não provoca desnaturação proteica extensa durante o método de processamento químico, e, por conseguinte, um fator antinutricional, o inibidor de tripsina está consideravelmente presente no moinho de soja.

[007]Como um meio para a resolução do problema do método de processamento químico, um produto de farelo de soja fermentado preparado por um método de processamento biológico utilizando bactérias Bacillus ou fungos foi desenvolvido (Patente Coreana Nos. 10-0645284, 10-0459240 e 10-0925173). Este método de processamento para tratamento de fermentação é utilizado para remover uma pluralidade de fatores antinutricionais, e para degradar proteínas ou carboidratos em formas digeríveis de baixo peso molecular durante o processo de fermentação, produzindo, desse modo, materiais proteicos de alta qualidade para ração, o que é excelente para a taxa de digestão e absorção.

[008]No entanto, a fermentação sólida é geralmente utilizada no método de processamento para tratamento de fermentação, e a fermentação sólida tem a desvantagem de fornecer ar continuamente, a fim de manter as condições aeróbicas, e remover o calor da fermentação produzido durante o processo de fermentação. Além disso, o método de processamento para tratamento de fermentação requer um longo período de fermentação de 48 horas ou mais para remover os fatores antinutricionais acima do nível ideal. Este longo período de fermentação reduz a velocidade de rotação do fermentador e provoca um aumento do custo geral de produção.

[009]Consequentemente, os presentes inventores desenvolveram um método para a produção de um farelo de soja fermentado por fermentação sólida utilizando uma cepa de Bacillus subtilis TP6 (KFCC11343P, No. de Acesso KCCM11438P), cepa esta que possui características excelentes necessárias para a produção do farelo de soja fermentado, a fim de encurtar significativamente o tempo de fermenta- ção durante a produção do farelo de soja fermentado (publicação de Patente Coreana No. 10-2011-0027535). Por meio deste método, um farelo de soja fermentado com qualidade equivalente ou maior do que a do farelo de soja fermentado convencional pode ser produzido, mesmo com um tempo de fermentação mais curto, utilizando a cepa de Bacillus subtilis TP6, que é excelente na remoção de fatores anti- nutricionais e na atividade de protease.

[010]No entanto, este método é problemático, pois a cepa de Bacillus subtilis TP6 tem uma baixa capacidade de inibir a proliferação de agentes patogênicos e, deste modo, os agentes patogênicos também proliferam durante a fermentação quando o farelo de soja está contaminado com E. coli ou Salmonella, durante a fermentação.

[011]Consequentemente, os presentes inventores vêm realizando grandes esforços para selecionar uma cepa de fermentação com características aprimoradas que sejam úteis para a fermentação sólida do farelo de soja. Como resultado, eles desenvolveram uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, que é excelente na remoção de fatores antinutricionais, na atividade de protease e na atividade antimi- crobiana contra agentes patogênicos, e apresenta produtividade reduzida de substâncias viscosas durante a fermentação. Além disso, os presentes inventores descobriram que, quando a cepa é utilizada para realizar a fermentação sólida do farelo de soja, um farelo de soja fermentado de alta qualidade, com melhores taxas de digestão e absorção e eficiência alimentar, pode ser produzido devido à baixa moleculari- zação pela hidrólise das proteínas de soja e aumento do teor de proteínas brutas, à inativação do inibidor da tripsina, ou a uma redução do teor de fatores antinutricio- nais, tais como os polissacarídeos não digeríveis, mesmo por um curto tempo de fermentação, em comparação com o método convencional, completando, assim, a presente invenção.

DIVULGAÇÃO Problema técnico

[012]Um objeto da presente invenção é proporcionar uma nova cepa de Bacillus amyloliquefaciens com aumento da produtividade de farelo de soja fermentado.

[013]Outro objeto da presente invenção é proporcionar um método para a produção de um farelo de soja fermentado por fermentação sólida, utilizando a cepa de Bacillus amyloliquefaciens.

[014]Outro objeto também da presente invenção é proporcionar um farelo de soja fermentado produzido pelo método.

[015]Outro objeto também da presente invenção é proporcionar uma composição alimentar incluindo o farelo de soja fermentado.

Solução Técnica

[016]Em um aspecto, para realizar os objetos acima, a presente invenção proporciona uma nova cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G (KCCM11471P) útil para a produção de farelo de soja fermentado por fermentação sólida.

[017]A cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente in-venção, é caracterizada pela excelente atividade de remoção de fatores antinutricio- nais, atividade de protease e atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, e apresenta produtividade reduzida de substâncias viscosas durante a fermentação, produzindo assim farelo de soja fermentado de alta qualidade por fermentação sólida.

[018]Especificamente, a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, produz uma protease com forte atividade, de modo a inati- var vários fatores antinutricionais polissacarídicos, tais como o inibidor de tripsina (TI), que inibe a digestão do farelo de soja, e hidrolisar proteínas de soja de alto peso molecular em proteínas de baixo peso molecular, melhorando consideravelmente, portanto, as taxas de digestão e absorção do farelo de soja fermentado.

[019]Além disso, embora a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, cresça utilizando os carboidratos dos componentes do farelo de soja, esta converte os carboidratos em proteínas que constituem a célu- la. Assim, o teor relativo de proteínas brutas no farelo de soja fermentado é aumentado, o que é um fator importante na produção de rações de alta qualidade.

[020]Em uma forma de realização preferida, os presentes inventores isolaram 14 tipos de cepas com excelente produtividade de protease, provenientes de vários alimentos fermentados tradicionais, a fim de selecionar cepas de fermentação que podem ser utilizadas para a produção de farelo de soja fermentado por fermentação sólida (vide Tabela 1).

[021]A partir dos 14 tipos de cepas isolados, a cepa CJ823 foi selecionada, pois esta cepa apresenta uma atividade antimicrobiana extraordinária contra E. coli e Salmonella, que são agentes patogênicos representativos que provocam intoxicação alimentar em animais de criação.

[022]A cepa CJ823 selecionada apresenta uma atividade antimicrobiana extraordinária contra E. coli e Salmonella, em comparação com a cepa de Bacillus sub- tilis TP6 (KFCC 11343P; Publicação de Patente Coreana No. 10-2011-0027535), que foi utilizada como uma cepa de fermentação no método de produção convencional do farelo de soja fermentado por fermentação sólida (vide Tabela 2).

[023]Além disso, confirmou-se que a cepa CJ823 inibe de forma eficaz o crescimento de Salmonella durante o processo prático de fermentação, e, portanto, é adequado para a produção de farelo de soja fermentado de alta qualidade (vide Tabela 3).

[024]Para tal, a cepa CJ823 produz alta concentração de protease e mostra uma excelente atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos; no entanto, produz substâncias viscosas pegajosas devido à polimerização de frutano na forma de levana e poliglutamato, que são derivados de açúcares e proteínas de soja brutas gerados pelas enzimas produzidas durante o processo de fermentação. A produção das substâncias viscosas pode causar problemas no controle dos processos de fermentação e transferência de produtos fermentados após a produção em massa do farelo de soja fermentado.

[025]Consequentemente, os presentes inventores provocaram mutações induzidas por UV na cepa CJ823 de modo a desenvolver uma cepa mutante com produtividade reduzida de substâncias viscosas, mantendo as suas próprias características enzimáticas/ fisiológicas (vide FIG. 3).

[026]Primeiramente, a cepa CJ823 é exposta a UV 254 nm, e, em seguida, 16 tipos de cepas mutantes são selecionados dependendo da forma das colônias e da formação da zona clara devido à produção de substâncias viscosas em um meio de seleção contendo leite desnatado. Os 16 tipos de cepas mutantes selecionados são submetidos à cultura sólida, e, em seguida, a atividade de protease e teor de Y- PGA (ácido poli-Y-glutâmico) são analisados para finalmente selecionar uma cepa mutante U304 que apresenta a atividade de protease mais elevada e teor de Y- PGAA relativamente baixo (vide Tabela 4).

[027]Para a identificação da cepa U304 mutante finalmente selecionada, sua assimilação de açúcar foi primeiramente analisada. Como resultado, verificou-se que a cepa mutante U304 tem 98% de semelhança com Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens, em termos de características bioquímicas (vide Tabela 5).

[028]Além disso, os resultados da análise da sequência de RNAr 16S mostrou que a cepa mutante U304 tem a sequência de RNAr 16S de SEQ ID NO. 1. Com base nesta sequência, foram analisadas a homologia de sequência e a relação filogenética entre esta cepa e cepas conhecidas. Como resultado, a cepa mutante U304 mostrou 99,92% de semelhança com Bacillus amyloliquefaciens e a maior relação filogenética com este na árvore filogenética (vide Tabela 5).

[029]Quando as características bioquímicas de homologia de sequência e de relação filogenética foram reunidas, a cepa mutante U304, de acordo com a presente invenção, foi designada como Bacillus amyloliquefaciens K2G.

[030]A cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, é uma cepa melhorada com produtividade reduzida de substâncias visco- sas, devido à redução considerável da produção de polímeros, tais como o ácido poli-Y glutâmico, mantendo ao mesmo tempo as características da cepa parental, incluindo a alta produtividade de protease e uma excelente atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, tais como E. coli ou Salmonella. Portanto, ela pode ser utilizada de forma muito eficaz na produção do farelo de soja fermentado por fermentação sólida.

[031]A fim de confirmar a utilidade, foram examinadas alterações no teor de proteína bruta pela fermentação sólida da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção. Como resultado, verificou-se que o farelo de soja fermentado pela cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, apresentou teor de proteína bruta equivalente ou superior ao farelo de soja fermentado pela cepa de Bacillus subtilis TP6, que é conhecida como a cepa de fermentação de farelo de soja convencional, após fermentação de 24 horas (vide Tabela 6).

[032]Além disso, foram examinadas as alterações no teor de inibidor de trip- sina (TI) no farelo de soja pela fermentação da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção. Como resultado, verificou-se que o teor de TI no farelo de soja fermentado por 16 horas pela cepa de Bacillus amyloliquefa- ciens K2G, de acordo com a presente invenção, foi equivalente ao teor de TI no farelo de soja fermentado por 24 horas pela cepa de Bacillus subtilis TP6, sugerindo que a redução nos fatores antinutricionais pode ser conseguida a um nível equivalente por uma fermentação de apenas 16 horas (vide Tabela 7).

[033]Estes resultados indicam que após a produção do farelo de soja fermentado por fermentação sólida, a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, é capaz de produzir farelo de soja fermentado com um alto teor de proteínas brutas e um baixo teor de fatores antinutricionais como um alimento proteico de alta qualidade por um curto tempo de fermentação, em comparação com a cepa convencional. A presente invenção é excelente visto que o tempo de fermentação reduzido aumenta a velocidade de rotação do fermentador, aumentando, desta forma, o número de lotes produzidos anualmente, e, consequentemente, pode-se fornecer ao consumidor um farelo de soja fermentado de alta qualidade a um menor custo.

[034]Consequentemente, os presentes inventores depositaram a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, que é excelente na atividade de remoção de fatores antinutricionais, na atividade de protease e na atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, e possui produtividade reduzida de substâncias viscosas, de modo a ser útil na produção do farelo de soja fermentado de alta qualidade por fermentação sólida, sob o Tratado de Budapeste no Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM), em 07 de novembro de 2013, com o No. de Acesso KCCM11471P.

[035]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de um farelo de soja fermentado por fermentação sólida utilizando a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G.

[036]Especificamente, o método de preparação, de acordo com a presente invenção, é caracterizado por incluir as etapas de: a) adicionar água a um farelo de soja para a realização do tratamento térmico; b) resfriar o farelo de soja tratado termicamente e inocular a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G neste; e c) obter um farelo de soja fermentado pela cultura sólida da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G inoculada no farelo de soja.

[037]A etapa a) é uma etapa de adição de água a um farelo de soja como matéria-prima para a realização do tratamento térmico. Antes da fermentação sólida, uma quantidade adequada de água é pulverizada diretamente sobre o farelo de soja bruto, e estes são misturados para controlar o teor de umidade; seguido por um tratamento térmico durante um tempo predeterminado.

[038]De acordo com uma forma de realização preferida da presente inven- ção, a água na etapa a) é adicionada de modo que o teor de água do farelo de soja esteja entre 30 e 80% (v/p), mais preferencialmente, 30 e 70% (v/p), e mais preferi-velmente, 40 e 60% (v/p). O farelo de soja com teor de água dentro do intervalo acima é o preferido em relação à prevenção do atraso da fermentação devido à baixa umidade, à melhoria dos altos custos necessários para a transferência do farelo de soja e o processo de secagem após a fermentação, e à eficiência de aquecimento.

[039]Subsequentemente, o farelo de soja com água adicionada é submetido ao tratamento térmico. O tratamento térmico é realizado com a finalidade de matar uma variedade de germes no farelo de soja bruto, destruir a parede celular da soja, e desnaturar as proteínas, criando, assim, um ambiente para o crescimento ativo do micro-organismo desejado. O processo de tratamento térmico pode ser realizado por vários métodos conhecidos no estado da arte, mas o vapor ou vapor superaquecido é utilizado preferencialmente.

[040]De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, o tratamento térmico da etapa a) é realizado utilizando-se vapor entre 70 e 130°C por 10 a 60 minutos, ou vapor superaquecido entre 200 e 300°C por um curto período de tempo, de alguns segundos a minutos, mais preferencialmente, vapor entre 70 e 130°C por 10 a 30 minutos, e mais preferencialmente, vapor entre 80 e 121,1°C por 10 a 30 minutos.

[041]Se a temperatura do tratamento térmico for baixa ou o tempo de tratamento for curto, haverá problemas em termos de o efeito da esterilização em vários germes não ser suficiente, ou o processo de fermentação subsequente não prosseguir suavemente. Se a temperatura de tratamento térmico for alta ou o tempo de tratamento for longo, ocorrerá a desnaturação das proteínas no farelo de soja que reduzem a taxa de digestão, o que resulta na queda da qualidade do produto final. Portanto, é preferível que a temperatura e o tempo de tratamento térmico sejam adotados dentro de intervalos aceitáveis de modo a evitar estes problemas.

[042]Através do tratamento térmico, pode-se esperar que os contaminantes presentes no farelo de soja sejam praticamente removidos, um ambiente químico adequado para a fermentação sólida subsequente seja formado, e os fatores antinu- tricionais, tais como o inibidor de tripsina (TI), que inibem a taxa da digestão sejam ligeiramente reduzidos.

[043]A etapa b) é uma etapa de resfriamento do farelo de soja tratado termi- camente a uma temperatura adequada para a fermentação sólida, e em seguida, de inoculação da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G no mesmo. Na presente invenção, o resfriamento do farelo de soja é normalmente realizado após o tratamento térmico, onde o processo de resfriamento pode ser facilmente realizado por meio de um processo de transferência usando um transportador de resfriamento, a fim de evitar o superaquecimento, e resfriar uniformemente através do aumento da velocidade de resfriamento.

[044]De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, o farelo de soja na etapa b) é resfriado a 30 a 50°C, mais preferivelmente, 35 a 45°C, e mais preferivelmente, a 37°C.

[045]Após o resfriamento do farelo de soja tratado termicamente, é preferível que o meio de pré-cultura da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, seja uniformemente inoculado no meio de farelo de soja preparado sem alteração ou diluído em água esterilizada.

[046]A quantidade de cepa de fermentação inoculada no farelo de soja tratado termicamente é um fator importante que influencia a fermentação sólida do farelo de soja. A quantidade de cepa de fermentação imediatamente depois da inoculação no farelo de soja tratado termicamente é, de preferência, 1 x 105 a 1 x io9 UFC/g.

[047]Se a quantidade de inoculação for inferior a 1 x io5 UFC/g, uma pequena quantidade de caldo de fermentação de semeadura é necessária, contudo, há desvantagens, pois é necessário muito tempo para a fermentação do farelo de soja para aumentar o tempo de fermentação necessário para a produção, além da possibilidade de contaminação. Em contrapartida, se a quantidade de inoculação for superior a 1 x 109 UFC/g, o tempo de fermentação pode ser consideravelmente reduzido, mas há uma desvantagem, que é o fato de a produção de micro-organismos de semeadura (seed microorganisms), utilizados para inoculação, ser uma questão problemática. Em particular, visto que o desempenho da fermentação é fortemente influenciado pelas características de crescimento da cepa de fermentação e o tipo de fermentador, é preferível que a quantidade de inoculação seja adequadamente determinada tendo em consideração as características da cepa na etapa de produção.

[048]A etapa c) é uma etapa de obtenção de um farelo de soja fermentado por fermentação sólida da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G inoculada no farelo de soja. Por exemplo, a fermentação é realizada utilizando um fermentador de leito fixo.

[049]O fermentador de leito fixo é dividido em vários tipos, tais como reator em batelada, fechado, e tanque com agitação contínua. O método da presente invenção não está limitado a qualquer um destes, contanto que seja útil para a fermentação sólida do farelo de soja. Preferencialmente, ele pode ser selecionado dependendo da escala de produção.

[050]De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, o farelo de soja inoculado com a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G é aplicado ao fermentador de leito fixo com uma espessura de 5 a 50 cm, e fermentado a 20 a 50°C por 12 a 72 horas. Neste momento, é preferível que o leito fixo do farelo de soja seja mais espesso, e a fermentação seja realizada entre 30 e 45°C por 12 a 48 horas. Mais preferivelmente, a fermentação é realizada a 37°C por 24 horas.

[051]O método da presente invenção pode incluir ainda a etapa de secagem e pulverização do farelo de soja fermentado a baixa temperatura e umidade após a etapa c).

[052]A água no farelo de soja é parcialmente evaporada pelo processo de fermentação, mas o teor de água residual é consideravelmente tão alto quanto 20 a 50% (v/p) imediatamente após a fermentação. No entanto, o teor final de água preferível no produto de farelo de soja fermentado é de 10 a 12% (v/p), e, portanto, é necessário um processo de secagem.

[053]Quando a fermentação sólida é realizada utilizando-se a cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, o farelo de soja fermentado está em excelentes condições, mas aglomerados são ligeiramente formados. Portanto, após o processo de secagem, o processo de pulverização do farelo de soja fermentado é necessário para formar um tamanho de partícula uniforme.

[054]Os processos de secagem e pulverização podem ser realizados por vários métodos conhecidos no estado da arte. No entanto, quando o processo de secagem é realizado excessivamente a uma temperatura elevada, uma determinada quantidade de bactérias vivas no farelo de soja fermentado pode ser morta, e por isso deve ser realizado com cuidado. Preferencialmente, o processo de secagem é realizado a uma temperatura baixa sem matar as bactérias vivas. Mais preferencialmente, o processo de secagem é realizado com ar quente a baixa temperatura e umidade. No processo de pulverização, o farelo de soja fermentado pode ser pulverizado em vários tamanhos, dependendo da finalidade de utilização, e de preferência, por meio de um moinho de martelos.

[055]Quando a fermentação sólida do farelo de soja é realizada utilizando a cepa amyloliquefaciens K2G, de acordo com o método da presente invenção descrito acima, vários fatores antinutricionais, incluindo TI no farelo de soja, são reduzidos, a taxa de digestão e absorção é melhorada por meio da hidrólise e baixa mole- cularização das proteínas, e o teor de proteínas brutas também é aumentado, melhorando, desse modo, a ração em valor absoluto. Logo, ele é altamente valioso como um material proteico de alta qualidade para ração, sendo uma alternativa às pro- teínas animais.

[056]De outro modo, a presente invenção proporciona uma composição alimentar que inclui o farelo de soja fermentado que é produzido pelo método descrito acima.

[057]O teor de farelo de soja fermentado na composição alimentar, de acordo com a presente invenção, pode ser controlado apropriadamente dependendo do tipo e idade do animal de criação que a utilizará, da forma de aplicação, dos efeitos desejados, etc. Por exemplo, o teor pode ser de 1 a 99%, por peso, de preferência, 10 a 90% por peso, e mais preferivelmente, 20 a 80% por peso, mas não está limitado aos mesmos.

[058]Para a administração, a composição alimentar da presente invenção pode ainda incluir uma mistura de um ou mais de um ácido orgânico, tal como ácido cítrico, ácido fumárico, ácido adípico, ácido láctico, etc.; fosfato, tal como fosfato de potássio, fosfato de sódio, polifosfato, etc.; um antioxidante natural, tal como polife- nol, catequina, tocoferol, vitamina C, extrato de chá verde, quitosana, ácido tânico, etc., além do farelo de soja fermentado. Se necessário, podem ser adicionados outros aditivos típicos, tais como, um agente anti-influenza, um tampão, um agente bacteriostático, etc. Além disso, um diluente, um agente de dispersão, um tensoati- vo, um ligante ou um lubrificante pode ser acrescentado também para formular a composição em uma preparação injetável, tal como uma solução aquosa, uma suspensão, uma emulsão, etc., uma cápsula, um grânulo, ou um comprimido.

[059]Além disso, a composição alimentar da presente invenção pode ser utilizada em conjunto com vários agentes auxiliares, tais como aminoácidos, sais inorgânicos, vitaminas, um antioxidante, um agente antifúngico, um agente antimicrobia- no, etc., um suplemento nutricional, um acelerador de crescimento, um acelerador de digestão e absorção, e um agente profilático, além dos ingredientes principais, incluindo uma ração com proteína vegetal, tal como trigo, cevada, milho pulverizado ou fragmentado, etc, uma ração com proteína animal, tal como farinha de sangue, farinha de carne, farinha de peixe, etc., gordura animal e óleo vegetal.

[060]Quando a composição alimentar da presente invenção é utilizada como um aditivo, a composição alimentar pode ser adicionada isoladamente ou utilizada em conjunto com outros componentes de acordo com o método usual. A composição alimentar pode ser preparada na forma de administração de uma formulação de liberação imediata ou uma formulação de libertação prolongada, em combinação com transportadores não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores comestíveis podem ser amido de milho, lactose, sacarose, ou propilenoglicol. O transportador sólido pode ser administrado na forma de comprimidos, pós, trociscos, etc., e um transportador líquido pode ser administrado na forma de xaropes, suspensões líquidas, emulsões, soluções, etc. Além disso, o agente de administração pode incluir um conservante, um lubrificante, um acelerador de solução, ou um estabilizador, outros agentes para melhorar doenças inflamatórias e uma substância útil para a prevenção de vírus.

[061]A composição alimentar da presente invenção pode ser aplicada à dieta de um animal, ou seja, rações para muitos animais, incluindo mamíferos, aves, peixes e crustáceos. Pode ser utilizada em mamíferos com importância comercial, como porcos, gado, cabras, etc., animais de jardim zoológico, tais como elefantes, camelos, etc, animais domésticos, tais como cães, gatos, aves etc. Aves comercialmente importantes, incluindo galinhas, patos, gansos, etc., e peixes e crustáceos comercialmente cultivados, como a truta e camarão, também podem ser incluídos.

[062]A composição, alimentar de acordo com a presente invenção, pode ser misturada em uma quantidade de aproximadamente 10 a 500 g, de preferência, de 10 a 100 g por 1 kg, com base no peso seco de ração animal. Depois de ter sido completamente misturada, a composição alimentar pode ser fornecida como pasta, ou pode ser ainda submetida a um processo de sedimentação, extensificação, ou extrusão, preferencialmente.

Efeitos Vantajosos

[063]A cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G (KCCM11471P), de acordo com a presente invenção, é excelente na atividade de remoção de fatores antinutri- cionais, na atividade de protease e na atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, e apresenta produtividade reduzida de substâncias viscosas durante a fermentação. Assim, quando a cepa é utilizada como um micro-organismo de semeadura para realizar a fermentação sólida do farelo de soja, um farelo de soja fermentado de alta qualidade com melhores taxas de digestão e absorção e eficiência alimentar pode ser produzido devido à baixa molecularização pela hidrólise das proteínas de soja e aumento do teor de proteínas brutas, à inativação do inibidor da tripsi- na, ou a uma redução do teor de fatores antinutricionais, tais como os polissacarí- deos não digeríveis.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[064]A FIG. 1 mostra os resultados do Exemplo 1 para a seleção de cepas com alta produtividade de protease de acordo com a presente invenção;

[065]A FIG. 2 mostra os resultados de medição da atividade de inibição do crescimento das cepas com alta produtividade de protease, selecionadas no Exemplo 1, contra E. coli e Salmonella;

[066]A FIG. 3 mostra um fluxograma para a seleção de uma cepa mutante com produtividade reduzida de substâncias viscosas a partir das cepas com alta produtividade de protease de acordo com a presente invenção;

[067]A FIG. 4 mostra os resultados do gradiente de concentração em SDS- PAGE para a análise qualitativa do teor de Y-PGA pelo processo de seleção da cepa mutante de acordo com a presente invenção, onde a Linha M: marcador de peso molecular Linha 1: 1 g/L de Y-PGA padrão Linha 2: 0,5 g/L de Y-PGA padrão Linha 3: 0,25 g/L de Y-PGA padrão Linha 4: cepa CJ823 Linha 5: cepa mutante U304 Linha 6: cepa mutante U305 Linha 7: cepa mutante U306 Linha 8: cepa mutante U307;

[068]A FIG. 5 é uma árvore filogenética que mostra a relação filogenética da cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G mutante selecionada de acordo com os procedimentos acima; e

[069]A FIG. 6 mostra os resultados de SDS-PAGE para um grau de hidrólise de farelo de soja fermentado que é obtido por fermentação sólida de Bacillus amylo- liquefaciens K2G de acordo com a presente invenção, Linha M: marcador de peso molecular Linha 1: matéria-prima (farelo de soja bruto) Linha 2: fermentação por TP6 durante 20 horas Linha 3: fermentação por K2G durante 16 horas Linha 4: fermentação por K2G durante 20 horas.

MODO PARA INVENÇÃO

[070]Daqui em diante, a presente invenção será descrita detalhadamente com referência aos Exemplos. No entanto, é evidente para os técnicos no assunto, ao qual a presente invenção se refere, que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o escopo da presente invenção não pretende estar limitado a estes Exemplos.

Exemplo 1: Seleção de cepas com alta produtividade de protease

[071]De modo a isolar as cepas com excelente produtividade de protease, os presentes inventores isolaram cerca de 3000 tipos de micro-organismos de uma variedade de alimentos fermentados tradicionais (kimchi, pasta de feijão fermentado, vinho popular tradicional, peixe salgado, etc.), e destes, cerca de 1300 tipos de ce- pas de Bacillus adaptáveis para alimentação (Korea Feed Ingredients Association, probióticos) foram identificados. A partir das cepas, pretendeu-se encontrar cepas multifuncionais que apresentam alta expressão de protease, uma atividade antimi- crobiana e uma taxa de crescimento rápido.

[072]Detalhadamente, a seleção de cepas com alta produtividade de protease foi realizada comparando-se o tamanho da zona clara que foi formada devido à degradação do substrato em placa de ágar YM contendo leite desnatado a 2% (p/v) (Difco, EUA) (3,0 g de extrato de levedura, 3,0 g de extrato de malte, 10,0 g de peptona, 20,0 g de ágar) (FIG. 1).

[073]As cepas com alta produtividade de protease, então selecionadas, foram inoculadas em meio TSB (digestão enzimática de 17,0 g de caseína, digestão enzimáti- ca de 3,0 g de farelo de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato dipotássico, 2,5 g de dextrose, pH final: 7,3 ± 0,2 a 25°C), respectivamente, seguido de cultura a 37°C e 200 rpm por 12 horas. Cada 1,0 μL dos caldos de cultura foram colocados (spotted) em placa de ágar YM contendo leite desnatado. As placas de ágar foram incubadas a 37°C por 16 horas e o diâmetro da zona clara formada na placa foi medido.

[074]Neste momento, o Bacillus subtilis TP6 KFCC (11343P), utilizado como cepa de fermentação no método convencional para a produção de farelo de soja fermentado por fermentação sólida, foi usado como grupo controle (Publicação de Patente Coreana No. 10-2011-0027535).

[075]Conforme mostrado na Tabela 1, 14 tipos de cepas foram selecionados como cepas com alta produtividade de protease, e todas estas apresentaram maior atividade de protease do que o Bacillus subtilis TP6.

Exemplo 2: Isolamento de cepas com atividade inibitória sobre a proliferação de agentes patogênicos

[076]A fim de isolar cepas capazes de inibir o crescimento ou proliferação de E. coli e Salmonella, que são agentes patogênicos representativos que causam intoxicação alimentar em animais de criação, e de desenvolver produtos não tóxicos isentos de Salmonella, através da aplicação das cepas para a produção de farelo de soja fermentado, 14 tipos de cepas com alta produtividade de proteases, que foram isolados no Exemplo 1, foram submetidos à medição da atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos.

[077]A atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos foi medida pelo teste spot-on-the-lawn em Salmonella typhymurium (ATCC14028) e E. coli (KCCM11835).

[078]Detalhadamente, 14 tipos de cepas com alta produtividade de protease foram inoculados em meio GYP (10,0 g de glicose, 8,0 g de extrato de levedura, 2,0 g de polipeptona, pH 7,0), respectivamente, seguido de cultura líquida a 37°C e 180 rpm por 12 horas. Cada 1,5 μL dos caldos de cultura das cepas com alta produtividade de protease foram colocados em placa de ágar GYP (10,0 g de glicose, 8,0 g de extrato de levedura, 2,0 g de polipeptona, ágar 15,0 g, pH 7,0), a qual cada 1 x 105 UFC/mL de Salmonella typhymurium ATCC14028 e E. coli ATCC11835 foram adicionados, seguido por cultura estática a 37°C por 15 horas. O tamanho da zona de inibição que foi formada em torno das colônias de cepas com alta produtividade de protease colocadas na placa foi examinado para determinar o título de atividade. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. Neste momento, o Bacillus subtilis TP6 foi utilizado como grupo controle.

[079]Na Tabela 2, "-" ou "+" determinam o título de atividade com base no diâmetro da zona de inibição de bactérias vivas, e "-" indica que não há atividade anti- microbiana ou antimicrobianos; "+" indica que o diâmetro da zona de inibição é de 10,05 milímetros ou menos; "++" indica que o diâmetro da zona de inibição é de 10,05 a 14,05 mM; "+++" indica que o diâmetro da zona de inibição é de 14,05 a 17,05 mm; e "++++" indica que o diâmetro da zona de inibição é de 17,05 mm ou mais.

[080]Foram examinados os espectros antimicrobianos de 14 tipos de cepas com alta produtividade de protease contra Salmonella e E. coli, que são as causas mais comuns de doença gastrointestinal em animais de criação. Como resultado, CJ823 apresentou o melhor poder antimicrobiano. O CJ823 selecionado mostrou atividade antimicrobiana extraordinária contra E. coli (+ vs ++++) quanto Salmonella (++++ vs ++), em comparação com o grupo controle de Bacillus subtilis TP6.

Exemplo 3: Teste para a aplicação de farelo de soja inibidor de proliferação de Salmonella

[081]De acordo com os resultados do Exemplo 2, CJ823 na placa de ágar apresentou excelente atividade antimicrobiana contra Salmonella. No entanto, o experimento seguinte foi realizado a fim de confirmar se a cepa também apresentou capacidade de inibição de proliferação contra Salmonella durante a fermentação prática do farelo de soja.

[082]Detalhadamente, tanto CJ823 quanto Salmonella typhymurium ATCC14028 foram inoculados em farelo de soja (teor de umidade de 45%) que foi submetido ao vapor a 100°C por 30 minutos, a uma densidade de 4,5 x 107 UFC/g e 1,0 x 103 UFC/g, respectivamente, e as alterações no número de células foram examinadas a 37°C e umidade constante por 24 horas. Neste momento, Salmonella typhymurium isoladamente foi inoculada no farelo de soja, o qual foi utilizado como grupo controle. A mistura de Salmonella typhymurium e Bacillus subtilis TP6 foi inoculada no farelo de soja, o qual foi utilizado como grupo de comparação.

[083]As cepas foram inoculadas, e uma quantidade predeterminada de farelo de soja foi retirada antes da fermentação e após fermentação por 12, 16 e 20 horas. O farelo de soja foi diluído em 0,8% de solução estéril de NaCl, e, em seguida, cada 100 μL do mesmo foi aplicado em uma placa de ágar XLD (3 g de extrato de levedu- ra, 7,5 g de lactose, 7,5 g de sacarose, 3,5 g de xilose, 5 g de L-lisina, 0,8 g de citrato de amônio férrico, 0,08 g de vermelho fenol, 5 g de NaCl, 2,5 g de desoxicolato de sódio, 6,8 g de tiossulfato de sódio, 13,5 g de ágar, pH final: 7,4 ± 0,2 a 25°C) para contar o número de colônias de Salmonella typhymurium, e os resultados são apresentados na Tabela 3 abaixo.

[084]A relação entre as duas cepas foi medida tendo em vista o pressuposto de que a contaminação por Salmonella typhymurium ocorre pela proliferação da cepa principal de fermentação CJ823 no farelo de soja vaporizado. A razão de contaminação real pode diferir dependendo das condições ambientais para a produção do farelo de soja fermentado.

[085]Conforme mostrado na Tabela 3, no grupo controle inoculado com apenas Salmonella typhymurium, como o tempo de cultura foi aumentado, o número das bactérias foi progressivamente aumentado para 3,1 x 107 UFC/g após a fermentação de 20 horas. Em contrapartida, no grupo de comparação inoculado com uma mistura com Bacillus subtilis TP6, o número de Salmonella typhymurium foi inibido a 2,2 x 104 UFC/g. No grupo experimental inoculado com a mistura de CJ823, de acordo com a com a presente invenção, o número de Salmonella typhymurium foi reduzido ainda mais a 3,5 x 102 UFC/g.

[086]Estes resultados indicam que CJ823, de acordo com a presente inven- ção, inibe de forma eficaz o crescimento de Salmonella durante um processo prático de fermentação, e, portanto, é adequado para a produção de farelo de soja fermentado de alta qualidade.

Exemplo 4: Seleção de cepas mutantes

[087]CJ823 selecionada nos Exemplos 1 a 3 produz alta concentração de protease e apresenta uma excelente atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, no entanto, produz substâncias viscosas pegajosas devido à polimerização de frutano na forma de levana e poliglutamato, que são derivados de açúcares e proteínas de soja brutas gerados pelas enzimas produzidas durante o processo de fermentação. A produção excessiva de substâncias viscosas num processo industrial de grande escala impede a agitação, e existem dificuldades no controle do oxigênio dissolvido no produto fermentado e da temperatura, e na transferência.

[088]Consequentemente, os presentes inventores provocaram mutações induzidas por UV na cepa CJ823 de modo a desenvolver uma cepa mutante com produtividade reduzida de substâncias viscosas, mantendo ou melhorando as suas próprias características enzimáticas/ fisiológicas. O processo de seleção da cepa mutante está descrito na FIG. 3.

[089]Primeiramente, CJ823 foi plaqueada em placa de ágar TSB ((digestão enzimática de 17,0 g de caseína, digestão enzimática de 3,0 g de farelo de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato dipotássico, 2,5 g de dextrose, 15,0 g de ágar, pH final: 7,3 ± 0,2 a 25°C), e cultivadas a 37°C por 12 horas para ativar a cepa.

[090]Nesta cultura, 1% de uma suspensão do micro-organismo de semeadura foi inoculada em meio de TSB (digestão enzimática de 17,0 g de caseína, digestão enzimática de 3,0 g de farelo de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato dipotássico, 2,5 g de dextrose, pH final: 7,3 ± 0,2 a 25°C), preparada antecipadamente, e cultivada, com agitação, a 37°C e 180 rpm. Após a cultura, o caldo de cultura foi centrifugado a 25°C e 8000 rpm por 10 minutos para separar o sobrenadante e o sedimento de células. Apenas o sedimento de células foi retirado e lavado com 0,8% de solução estéril de NaCl. Após a lavagem, a mutação artificial foi induzida pela irradiação por UV (254 nm) no sedimento celular recuperado utilizando uma lâmpada de UV (Viber Lourmat, 115 V, 60 Hz).

[091]A célula foi plaqueada numa placa de ágar TSA contendo leite desnatado a 2% (digestão enzimática de 15 g de caseína, digestão enzimática de 5 g de farelo de soja, 5 g de NaCl, 15 g de agar, pH final de 7,3 ± 0,2 a 25°C), que é um meio de seleção, e cultivada a 37°C por 20 horas. Após a cultura, as dimensões (diâmetro, mm) da zona clara formada foram determinadas utilizando Caliper (CD- 20CPX, Mitutoyo, Kanagawa, Japão), e 16 tipos de cepas mutantes com alta atividade proteolítica foram selecionados primeiramente.

[092]Subsequentemente, cada um dos 16 tipos de cepas mutantes, então selecionados, foi inoculado em farelo de soja tratado termicamente, e cultivado por 20 horas, e o caldo de cultura obtido do mesmo foi centrifugado a 25°C e 8000 rpm por 10 minutos para separar o sedimento de células e o sobrenadante. O teor de Y-PGA no sobrenadante foi determinado medindo-se o peso de Y-PGA que foi recuperado após isolamento e purificação e secagem por congelamento, de acordo com o processo descrito no documento (Goto et al., Biosci. Biotechnol. Biochem 56: 1031-1035, 1992).

[093]A atividade da protease foi medida de acordo com o método descrito no Exemplo 1, e o teor de y-PGA foi medido por dois métodos de análise qualitativa e quantitativa a seguir.

[094]Primeiramente, para a análise qualitativa da atividade de Y-PGA, 40 μL do sobrenadante separado foram misturados com 10 μL de solução tampão de coloração 5X, e, em seguida, colocados em um gel de gradiente de SDS-poliamida de 5 a 20% para realizar o gradiente de concentração por SDS-PAGE. Após a eletroforese, a proteína padrão foi corada com o reagente corante de Comassie, seguido de descoloração. Em seguida, o ácido poli-y glutâmico foi corado com azul de metileno para realizar a análise qualitativa.

[095]Conforme mostrado na FIG. 4, o ácido poli-Y-glutâmico foi detectado no sobrenadante de CJ823 (cepa parental) da Linha 4, mas a capacidade de produção de polímero foi bastante reduzida e a alta atividade de protease foi observada no sobrenadante da cepa mutante U304 da Linha 5.

[096]Entretanto, para a análise quantitativa do teor de Y-PGA, o sobrenadan- te da fermentação sólida foi diluído com uma quantidade igual de água destilada, e, em seguida, centrifugado a 20000 x g por 20 minutos. O pH do sobrenadante obtido foi ajustado para 3,0 utilizando HCl a 6 M, e deixado a 4°C por um dia. Em seguida, o sobrenadante foi centrifugado a 25000 x g por 30 minutos, e, em seguida, o sedimento foi recuperado. O sedimento foi completamente dissolvido em 100 ~ 200 vezes o volume de água destilada, e centrifugado a 25000 x g por 30 minutos para remover as impurezas. Os sais foram removidos por diálise a 4°C por um dia. O material resultante foi liofilizado para recuperar o Y-PGA, e os resultados obtidos a partir deste são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[097]Conforme mostrado na Tabela 4, a maior parte das cepas mutantes apresentou um baixo teor de Y-PGA em comparação com CJ823. Destas, a cepa mutante U304, que apresentou a maior atividade de protease e teor de Y-PGA relativamente baixo, foi finalmente selecionada. Particularmente, a cepa mutante U304 apresentou o menor teor de y-PGA e atividade protease três vezes maior ou mais do que o grupo controle de Bacillus subtilis TP6.

[098]A cepa mutante U304 finalmente selecionada é caracterizada pelo fato de apresentar produtividade reduzida de substâncias viscosas, reduzindo consideravelmente a produção de polímeros, tais como o ácido poli-y glutâmico, mantendo ao mesmo tempo as características da cepa parental, incluindo a produção de alta concentração de protease e uma excelente atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos.

Exemplo 5: Determinação da sequência de RNAr 16S da cepa mutante U304 (K2G) e Análise Filogenética

[099]A fim de identificar a cepa mutante U304 com produtividade reduzida de substâncias viscosas, a cepa foi inoculada em uma nova placa de ágar NA, e cultivada a 37°C por 16 horas. As colônias formadas foram diluídas com 0,8% de solução estéril de NaCl, e depois injetadas em um cartão de identificação BCL (bioMNitek Inc., Hazewood, EUA), que consiste de 63 tipos de meios secos e reagentes bioquímicos, e os resultados foram integralmente armazenados no software Vitek 2 Compact (bi- oMVitek) a cada 15 minutos, e a identificação foi concluída após 14 horas.

[0100]Como um iniciador universal para a identificação de bactérias por análise da sequência de RNAr 16S, 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3') e 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') de SEQ ID NOs. 2 e 3 foram utilizados, e após a amplificação de RNAr 16S por PCR, um produto de 1333 pb, contendo uma sequência de bases de 50 ~ 900 pb que é importante na identificação, foi traduzido usando um BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc., EUA). O resultado da análise da sequência de RNAr 16S mostrou que a cepa mutante U304 tem a sequência de RNAr 16S de SEQ ID NO. 1.

[0101]A similaridade de sequência foi determinada pelo programa de busca de similaridade BLAST (National Institute of Biotechnology Information) e a posição foi determinada em uma árvore filogenética após o alinhamento múltiplo de sequências (FIG. 5).

[0102]Os resultados dos 63 tipos de testes bioquímicos foram analisados pelo software Vitec 2 Compact. Como resultado, a cepa foi classificada como Bacillus subtilis/ Bacillus amyloliquefaciens, com uma probabilidade de 98%. Conforme mostrado na FIG. 5, os resultados da análise filogenética mostraram que a cepa mutante U304 tem relação mais próxima com a cepa padrão, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42T (CP000560) e a homologia de sequência de DNAr 16S foi de 99,92% (1332 pb/ 1333 pb).

[0103]Entretanto, quando as características bioquímicas e os resultados da análise filogenética foram reunidas, a cepa mutante U304, de acordo com a presente invenção, foi designada como Bacillus amyloliquefaciens K2G, e depositada sob o Tratado de Budapeste no Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM), em 7 de novembro, de 2013, com o No. de Acesso KCCM11471P.

Exemplo 6: Alterações no teor de proteína bruta de acordo com o tempo de fermentação após a fermentação do farelo de soja utilizando Bacillus amyloliquefaci- ens K2G

[0104]De modo a analisar as alterações no teor de proteína bruta de acordo com o tempo de fermentação após a fermentação do farelo de soja utilizando Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, foi realizado o seguinte experimento.

[0105]Primeiramente, 400 g de farelo de soja foram preparados de forma a ter um teor de água de 45%, e vaporizados a 100°C por 30 minutos, e, em seguida, resfriados a 40°C ou menos. Subsequentemente, o Bacillus amyloliquefaciens K2G foi plaqueado em placa de ágar TSB (digestão enzimática de 17,0 g de caseína, digestão enzimática de 3,0 g de farelo de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato dipotás- sico, 2,5 g de dextrose, 15 g de ágar, pH final: 7,3 ± 0,2 a 25°C), e cultivado a 37°C por 12 horas para ativar a cepa. Aproximadamente dois loops de cepa ativada foram suspensos em 9 mL de solução de NaCl estéril a 0,8% (diluída para 0,2 a A660nm), e esta suspensão foi utilizada como micro-organismo de semeadura. Nesta cultura, 1% da suspensão de micro-organismo de semeadura foi inoculada em 40 mL de meio TSB (digestão enzimática de 17,0 g de caseína, digestão enzimática de 3,0 g de farelo de soja, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de fosfato dipotássico, 2,5 g de dextrose, pH final: 7,3 ± 0,2 a 25°C), preparada antecipadamente, e cultivada com agitação a 37°C e 180 rpm.

[0106]40 mL do caldo de cultura de Bacillus amyloliquefaciens K2G foram preparados, de forma a ter um teor de água de 45%, adicionados ao farelo de soja vaporizado, e misturados bem, seguido por cultura estática a 37°C e umidade constante por 20 horas. A amostra de cultura foi seca em um secador a 60°C até que o teor de água estivesse em 10% ou menos, e, em seguida, o teor de proteína bruta em cada amostra foi medido usando um sistema de Kjeldahl (Kjltec 2100). Neste momento, o teor de proteína bruta foi medido antes da fermentação e depois da fermentação por 12, 16 e 20 horas, e o Bacillus subtilis TP6 foi utilizado como grupo controle. O teor de proteína bruta (%, correção para 10% de umidade) medido a partir do mesmo é mostrado na Tabela 6 abaixo. Neste momento, o Bacillus subtilis TP6 foi utilizado como grupo controle.

[0107]Conforme mostrado na Tabela 6, com base na fermentação de 24 horas, o farelo de soja fermentado por Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, mostrou que o teor de proteína bruta é equivalente ou maior do que o do farelo de soja fermentado por Bacillus subtilis TP6, que é conhecido como a cepa de fermentação convencional de farelo de soja.

[0108]Estes resultados indicam que o Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado de forma eficaz na produção de farelo de soja fermentado como um alimento proteico de alta qualidade. Exemplo 7: Alterações no teor de TI de acordo com o tempo de fermentação após a fermentação do farelo de soja utilizando Bacillus amyloliquefaciens K2G

[0109]De modo a analisar as alterações no teor de inibidor de tripsina (TI) de acordo com o tempo de fermentação após a fermentação do farelo de soja utilizando Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, foi realizado o seguinte experimento.

[0110]Especificamente, tal como no Exemplo 6, 400 g de farelo de soja foram preparados de forma a ter um teor de água de 45%, e vaporizados a 100°C por 30 minutos, e, em seguida, o Bacillus amyloliquefaciens K2G foi inoculado no farelo de soja vaporizado a uma densidade de 4,5 x 107 UFC/mL, seguido de cultura a 37°C e umidade constante por 24 horas. O teor de TI foi medido de acordo com a AACC-71-10 (American Association of Cereal Chemists, 1995) antes da fermentação e após fermentação por 16, 20 e 24 horas, e o teor de TI (mg/g) medido a partir do mesmo é mostrado na Tabela 7 abaixo. Neste momento, o Bacillus subtilis TP6 foi utilizado como grupo controle.

[0111]Conforme mostrado na Tabela 7, o farelo de soja fermentado por Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, mostrou teor de TI de 0,39 mg/g após a fermentação de 16 horas, o que corresponde ao encontrado no farelo de soja fermentado por 24 horas pelo Bacillus subtilis TP6, que é conhecido como a cepa de fermentação convencional de farelo de soja, o que sugere que a redução dos fatores antinutricionais pode ser conseguida a um nível equivalente pela fermentação de apenas 16 horas.

[0112]A presente invenção é excelente visto que o tempo de fermentação reduzido aumenta a velocidade de rotação do fermentador, aumentando, desta forma, o número de lotes produzidos anualmente, e, consequentemente, pode-se fornecer ao consumidor um farelo de soja fermentado de alta qualidade a um menor custo.

Exemplo 8: Medição do grau de hidrólise da proteína de soja e sua solubilidade em KOH após a fermentação do farelo de soja utilizando Bacillus amyloliquefa- ciens K2G

[0113]O farelo de soja é uma matéria-prima vegetal para ração que possui um alto teor de proteínas, mas tem uma desvantagem, que é ser insuficiente para animais de criação jovens, principalmente, devido aos fatores antinutricionais e às proteínas com baixas taxas de digestão e absorção. Um dos métodos para melhorar esta desvantagem é o de preparar as proteínas sob a forma de peptídeos hidrolisados ou degradá-las em proteínas de baixo peso molecular, sendo de fácil digestão por fermentação que utiliza um micro-organismo. O Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, é uma cepa com alta produtividade de protease, e, portanto, espera-se que as proteínas de soja no farelo de soja fermentado, preparado com o uso da mesma, possam ser degradadas pelas proteases secretadas pela cepa.

[0114]Para confirmar isto, o grau de hidrólise do farelo de soja fermentado, de acordo com a presente invenção, foi medido em primeiro lugar. Tal como no Exemplo 6, 400 g do farelo de soja foram preparados de forma a ter um teor de água de 45%, e vaporizados a 100°C por 30 minutos, e, em seguida, o Bacillus amyloli- quefaciens K2G foi inoculado no farelo de soja vaporizado a uma densidade de 4,5 x 107 UFC/mL, seguido de cultura a 37°C e umidade constante por 24 horas. O caldo de cultura obtido a partir deste foi centrifugado a 25°C e 8000 rpm por 10 minutos para separar o sobrenadante e o sedimento de células. 40 μL do sobrenadante separado foram misturados com 10 μL de solução tampão de coloração 5x, e, em seguida, a SDS-PAGE (10%) foi realizada para examinar a migração das proteínas de acordo com o seu peso molecular. Após a eletroforese, o gel de poliamida foi corado com Comassie Brilhante R250 para examinar a composição e o peso molecular da proteína, e os resultados são mostrados na FIG. 6. Neste momento, o farelo de soja bruto e o farelo de soja fermentado preparado pelo Bacillus subtilis TP6 foram utilizados como grupo controle.

[0115]Conforme mostrado na FIG. 6, verificou-se que o farelo de soja fermentado preparado pelo Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, apresentou uma alta densidade de proteína na região de baixo peso molecular, em comparação com o farelo de soja bruto e o farelo de soja fermentado preparado por outra cepa. No gel de SDS-poliamida, as bandas superiores indicam as proteínas de alto peso molecular e as bandas inferiores indicam as proteínas de baixo peso molecular. Estes resultados indicam que, no caso dos farelos de soja com os mesmos pesos moleculares, as proteínas de alto peso molecular no farelo de soja fermentado por Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção, são hidrolisadas em proteínas de baixo peso molecular.

[0116]De acordo com os relatórios anteriores, a suplementação alimentar de frangos de corte foi realizada quatro vezes usando o farelo de soja apresentando solubilidade em KOH (hidróxido de potássio) de 80% e o farelo de soja apresentando baixa solubilidade (55% a 68%). Como resultado, o peso, o consumo de ração e a eficiência alimentar dos frangos de corte, que foram alimentados com o farelo de soja apresentando baixa solubilidade em KOH, foram mais baixos ou diminuídos em comparação com os frangos alimentados com o farelo de soja apresentando solubilidade em KOH de 80% (Abulto et al., J. Appl Poult Res. 7: 189-195, 1998b).

[0117]Assim, a solubilidade em KOH do farelo de soja fermentado, de acordo com a presente invenção, foi medida de acordo com o processo descrito no documento (Parsons et al., J Anim Sci, 69: 2918-24, 1991). Resumidamente, 1,0 g de farelo de soja fermentado, então preparado, foram adicionados à solução de KOH a 0,2% e misturado por 20 minutos, seguido por filtração. O teor de nitrogênio no filtrado foi medido usando um sistema de Kjeldahl e convertido para solubilidade. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

[0118]Conforme mostrado na Tabela 8, a solubilidade em KOH do farelo de soja vaporizado foi reduzida de 80% para 70%, mas a solubilidade em KOH foi aumentada para 85% durante a fermentação sólida por Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção. Estes resultados sugerem que (a solubilidade em) KOH foi aumentada devido à degradação das proteínas de soja pela protease secreta- da por Bacillus amyloliquefaciens K2G, de acordo com a presente invenção.

Aplicabilidade industrial

[0119]A cepa de Bacillus amyloliquefaciens K2G (KCCM11471P), de acordo com a presente invenção, é excelente na atividade de remoção de fatores antinutricio- nais, na atividade de protease e na atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos, e apresenta produtividade reduzida de substâncias viscosas durante a fermentação. Assim, quando a cepa é usada como um micro-organismo de semeadura para realizar a fermentação sólida do farelo de soja, um farelo de soja fermentado de alta qualidade com melhores taxas de digestão e absorção e eficiência alimentar pode ser produzido devido à baixa molecularização pela hidrólise de proteínas de soja e um aumento no teor de proteínas brutas, inativação de inibidores de tripsina, ou uma redução do teor de fatores antinutricionais, tais como os polissacarídeos não digeríveis.

Claims

1. Método para a produção de um farelo de soja fermentado por fermentação sólida, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende inocular a cepa de Bacillus amyloliquefaciens, com o No. de Acesso KCCM11471P, em um farelo de soja.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar água a um farelo de soja para a realização do tratamento térmico; b) resfriar o farelo de soja tratado termicamente e inocular a cepa de Bacillus amyloliquefaciens, com o No. de Acesso KCCM11471P, no mesmo; e c) obter um farelo de soja fermentado pela cultura sólida da cepa de Bacillus amyloliquefaciens, com o No. de Acesso KCCM11471P, inoculada no farelo de soja.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a água adicionada ao farelo de soja na etapa a) tem um teor de água de 30 a 80% (v/p).

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento térmico da etapa a) é realizado por meio do aquecimento do farelo de soja a uma temperatura de 70 a 130 °C por 10 a 30 minutos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o farelo de soja na etapa b) é resfriado a uma temperatura de 30 a 50 °C.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de cepas de Bacillus amyloliquefaciens, com o No. de Acesso KCCM11471P, imediatamente após a inoculação na etapa b) está na faixa de 1 x 105 a 1 x 109 UFC/g.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura sólida na etapa c) é realizada a uma temperatura de 30 a 45 °C por 12 a 48 horas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de secagem e pulverização do farelo de soja fermentado obtido na etapa c).

9. Cepa de Bacillus amyloliquefaciens CARACTERIZADA pelo fato de que apresenta o No. de Acesso KCCM11471P.