BR112019002545B1 - Composição para aditivos de ração animal, ração animal e método para preparar uma composição para aditivos de ração animal - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a uma composição de aditivo de ração animal que compreende uma cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 inovadora ou células mortas da mesma, e a um método para produzir as células mortas.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma Lactobacillus salivarius CJLS1511 inovadora, uma composição para adicionar ração animal que compreende a mesma ou células bacterianas inativadas da mesma, e uma método para preparar as células bacterianas inativadas.
[002] Micro-organismo Lactobacillus sp. é um lactobacilo que realiza homofermentação ou heterofermentação, e é normalmente encontrado em intestinos de animais, incluindo seres humanos, e um processo de fermentação de produtos lácteos e legumes. Micro-organismo Lactobacillus sp. é bactéria que produze ácido lático normalmente encontrada no trato intestinal em animais, e realiza homofermentação ou heterofermentação com o uso de produtos lácteos e legumes como seus substratos. Micro-organismo Lactobacillus sp. é conhecido por manter ambiente intestinal em condição ácida em animais, inibir crescimento exagerado de bactérias prejudiciais, tais como E. coli e Clostridium, melhorar diarreia e constipação em animais, e ajuda na síntese de vitamina, e diminuir nível de colesterol sérico, e ter atividade anticancerígena, etc.
[003] Estudos foram conduzidos sobre os probióticos como aditivos de ração, de acordo com as propriedades do micro-organismo Lactobacillus sp. mencionadas acima. Diarreia bacteriana em gado resulta na redução de uma taxa de crescimento e taxa de sobrevivência. Portanto, de modo a aumentar a produtividade de gado, vários antibióticos foram adicionados à dieta animal em uma dose farmacêutica. Nos últimos anos, no entanto, o problema da resistência ao antibiótico tem sido discutido em todo o mundo devido ao seu uso excessivo. Consequentemente, os governos em diversos países começaram a limitar o uso dos antibióticos em ração animal. (Publicação de Patente Aberta à Inspeção n° KR 10-1998-78358) (McEwen e Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, junho de 2002, páginas S93 a S106).
[004] (Documento de Patente 1) Publicação de Patente Aberta à Inspeção n° KR 10-1998-78358
[005] (Documento de Não Patente 1) Clinical infectious Diseases, Volume 34, junho de 2002, páginas S93 a S106
[006] A presente invenção fornece aditivos de ração que contêm um micro-organismo Lactobacillus sp. inovador que têm capacidade para melhorar o ganho de peso corporal do animal, estado imunológico, habilidade antidoença de animais e inibir crescimento exagerado de bactérias prejudiciais no trato intestinal dos animais.
[007] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, são fornecidos Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas.
[008] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecida uma composição para um aditivo de ração animal que compreende Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas.
[009] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecida na forma de um aditivo de ração animal, conforme descrito acima.
[010] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecido um método para preparar o Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativado, que compreende:
[011] cultivar Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) para preparar uma solução de cultura,
[012] aquecer a solução de cultura a uma determinada temperatura que está na faixa de 70 a 160 °C,
[013] resfriar a solução de cultura aquecida a uma determinada temperatura que está na faixa de 10 a 60 °C, e
[014] isolar Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativado da solução de cultura resfriada.
[015] Lactobacillus salivarius CJLS1511, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, ou suas células bacterianas inativadas podem ser excelentes em habilidades de degradação de lipídeo neutro, adsorção de endotoxina, inibição de crescimento bacteriano patogênico e em melhorar atividade de enzima digestiva.
[016] Composições para os aditivos de ração animal ou sua ração misturada, que compreendem Lactobacillus salivarius CJLS1511, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, ou suas células bacterianas inativadas, pode aprimorar o desempenho de crescimento animal e melhorar estado imunológico, desse modo, ajuda o animal a lutar contra doença derivada de patógeno.
[017] A Figura 1 mostra uma imagem microscópica eletrônica de cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 ou suas células bacterianas inativadas.
[018] A Figura 2 mostra árvore filogenética de Lactobacillus salivarius CJLS1511.
[019] Doravante no presente documento, a presente invenção será descrita em detalhes. Descrições não descritas no relatório descritivo podem ser reconhecidas e deduzidas de maneira suficiente por uma pessoa versada no campo da técnica ou campos similares a esse, e assim, detalhes serão omitidos.
[020] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecido Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas.
[021] As “células bacterianas inativadas do Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)” podem ser, por exemplo, Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) morto, mais especificamente, Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado por calor.
[022] Os presentes inventores coletaram o fim do intestino delgado de frangos, lavaram com água destilada estéril, semearam com meio MRS, complementaram com 0,001% de bromofenol roxo (BCP) e cultivaram anaerobicamente a 37 °C. Aqui, cerca de 50 cepas de produção de ácido lático foram selecionadas e subcultivadas. Essas cepas foram submetidas a isolamento secundário através de método de separação morfológica, desse modo, se obtém 24 tipos de bacilos. Os 24 tipos dos bacilos foram submetidos a isolamento terciário por comparação em vista da habilidade de atividade antibacteriana e atividade de enzima digestiva, desse modo, se obtém 10 cepas. Resistência a bile, resistência a ácido, e habilidade de adesão de parede celular intestinal animal das cepas de produção de ácido lático foram medidas, e dentre essas, uma cepa na qual a fermentação de açúcar, inibição de crescimento bacteriano patogênico, atividade de enzima digestiva e degradação de um lipídeo neutro são as mais excelentes, foi isolada.
[023] A cepa de produção de ácido lático isolada foi designada como Lactobacillus salivarius CJLS1511 e depositada em 12 de abril de 2016 (n° de acesso: KCCM11829P) no Centro de Cultura coreano de Micro-organismos (KCCM).
[024] As características morfológicas e fisiológicas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 são mostradas na Tabela 1 abaixo.
[025] Adicionalmente, Lactobacillus salivarius CJLS1511 tem um formato de bastonete, conforme mostrado na Figura 1, e não forma esporos. Quando a cepa é eliminada, a diferença entre células vivas e células mortas é confirmada por atividade de glicoproteína em uma superfície de parede celular.
[026] Análise bioquímica de Lactobacillus salivarius CJLS1511 foi conduzida como o uso de um kit API. Como resultado, identificou-se como capacidade para fermentação de carboidratos similar àquela de Lactobacillus salivarius ATCC11741 ou cepa padrão KCCM 40210, conforme mostrado na Tabela 2 abaixo. De acordo com análise de 16s rRNA que foi realizada por Macrogen, Inc., identificou-se como tendo propriedades biológicas moleculares 99% similares àquelas de Lactobacillus salivarius ATCC11741 ou cepa padrão KCCM 40210, conforme mostrado na Figura 2. TABELA 2
[027] Análise de utilização de açúcar de Lactobacillus salivarius CJLS1511
[028] O Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) pode ser excelente na resistência a ácido, resistência a bile, atividade antimicrobiana de atividade de enzima digestiva e degradação de lipídeo neutro, e pode melhorar de maneira eficaz a eficiência de ração e ganho de peso corporal do animal quando usado como aditivos de ração animal ou sua ração misturada.
[029] O Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativado exibe inibição de adesão competitiva com bactérias intestinais prejudiciais, desse modo, se contribui para formação da flora intestinal, e um ácido lipoteicoico, que é um componente de parede celular que é eluído enquanto a membrana celular das células bacterianas inativadas é destruída em um intestino delgado, pode interferir na colonização de bactérias intestinal nocivas na mucosa intestinal. Adicionalmente, os Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativados têm hidrofobicidade e floculabilidade maior que aquelas das células vivas, e assim, podem se ligar aos micro-organismos patogênicos e endotoxinas melhor do que as células vivas, desse modo, se melhora a habilidade antidoença. Adicionalmente, quando animais são alimentados com os micróbios inativados de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), tanto o peso corporal do animal quanto uma razão de conversão de alimentação podem ser melhorados.
[030] Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas podem incluir, adicionalmente, um agente protetor. Exemplos do agente protetor incluem pelo menos um dentre levedura, extrato de levedura, monossacarídeos, polissacarídeos, amidos e açúcares, tais como açúcar bruto e açúcar refinado. Especificamente, o agente protetor pode incluir pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em extrato de levedura, dextrose e açúcar bruto. Quando o agente protetor é usado, é possível evitar que Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas do ambiente externo evitem contaminação, e prolongar sua vida útil.
[031] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecida uma composição para um aditivo de ração animal que compreende Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas. Especificamente, a composição para um aditivo de ração animal pode incluir células bacterianas inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P).
[032] A composição para os aditivos de ração animal pode incluir, adicionalmente, um excipiente. O excipiente não é particularmente limitado, e pode ser qualquer excipiente que seja convencionalmente usado na técnica. Exemplos de excipiente podem incluir sacarídeos, tais como lactose, D-manitol, D-sorbitol, sacarose, etc., gomas, tais como goma xantana, goma guar, goma arábica, etc., amidos, tais como amido de milho, amido de batata, etc., sais inorgânicos, tais como fosfato de cálcio, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio precipitado, etc.
[033] A composição para os aditivos de ração animal pode incluir o Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) descrito acima ou suas células bacterianas inativadas em uma quantidade de 1,0x108 ufc a 1,0x1010 ufc por 1 g da composição. Especificamente, a quantidade pode ser de 1,0x108 ufc a 3,0x109 ufc, e pode ser de 5x108 ufc por 1g da composição com exemplo.
[034] A composição para aditivos de ração animal pode ter uma forma em pós, pelotas, grânulos e semelhantes. A quantidade de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) ou suas células bacterianas inativadas na composição para aditivos de ração animal pode ter uma faixa de 0,1% em peso a 10% em peso, especificamente 0,1% em peso a 7% em peso. Quando a composição inclui a cepa ou suas células bacterianas inativadas na faixa descrita acima, é possível maximizar degradação de lipídeo neutro, adsorção de endotoxina, inibição de crescimento bacteriano patogênico e aumentar atividade de enzima digestiva da composição para adição à dieta animal.
[035] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecida uma ração animal preparada com o uso da composição para aditivos de ração animal, conforme descrito acima. A ração animal pode ser preparada misturando-se a composição para aditivos de ração animal, de acordo com modalidades exemplificativas da presente invenção, com uma ração animal convencional. Uma quantidade da composição para aditivos de ração animal da presente invenção na ração animal pode ser de 0,1% em peso a 1% em peso do peso total da ração animal.
[036] A ração animal não é particularmente limitada, e pode ser uma ração para animais domésticos. O termo “animal doméstico” se refere a animais e animais de estimação para produzir produtos pecuários e produtos aquáticos que são úteis para os seres humanos, tal como leite, carne, ovos, cabelo, couro, penas, etc. Especificamente, a ração animal é fornecida aos animais domésticos, tais como cachorros, vacas, galinhas, porcos, cavalos, etc. Mais especificamente, a mesma pode ser fornecida a aves, mais especificamente, a frangos.
[037] A ração animal pode incluir componentes, tais como carboidratos, proteínas, lipídeos, vitaminas, minerais, etc., aqueles que são nutrientes essenciais para o crescimento animal. A ‘proteína’ pode ser uma proteína animal ou uma proteína vegetal, por exemplo, carne, ave, carne de peixe, proteína de soja, proteína do leite, glúten ou semelhantes. Exemplos do ‘carboidrato’ podem incluir cereais ou grãos, tais como milho, arroz, trigo, cevada, aveia, soja ou misturas dos mesmos. O ‘lipídeo’ pode ser uma gordura animal, uma gordura vegetal e gorduras derivadas de carne, ou semelhantes. De outra forma, é possível incluir, adicionalmente, outros componentes que adicionam funcionalidade à ração animal além do componente descrito acima. Alternativamente, açúcares, sais, temperos, condimento, realçador de sabor e semelhantes podem ser incorporados.
[038] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, é fornecido um método para preparar células bacterianas inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativado, que compreende:
[039] cultivar Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) para preparar uma solução de cultura,
[040] aquecer a solução de cultura a uma temperatura de 70 a 160 °C,
[041] resfriar a solução de cultura aquecida a uma temperatura que está na faixa de 10 a 60 °C, e
[042] isolar células bacterianas inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) inativado da solução de cultura resfriada.
[043] Especificamente, na etapa de cultivar o Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) para preparar uma solução de cultura, meio de ágar, especificamente, um meio MRS pode ser usado. O cultivo pode ser realizado a 25 °C a 40 °C durante 5 a 48 horas, mais especificamente de 30 a 40 °C durante 12 a 36 horas, mais especificamente de 35 a 40 °C durante 20 a 30 horas, desse modo, se prepara a solução de cultura.
[044] Então, a solução de cultura é aquecida a uma temperatura de 70 °C a 160 °C. O aquecimento pode ser realizado através de meios de aquecimento direto ou meios de aquecimento indireto, porém, pode ser realizado através de meios de aquecimento indireto, tal como um trocador de calor. O aquecimento pode ser realizado em uma faixa de temperatura de 80 °C a 150 °C, mais especificamente, de 90 °C a 120 °C. O Lactobacillus salivarius CJLS1511 pode ser inativado ou eliminado através do aquecimento.
[045] A solução de cultura aquecida pode ser rapidamente resfriada para uma temperatura de 10 °C a 60 °C, especificamente de 20 °C a 50 °C, ou em um exemplo, pode ser rapidamente resfriada até 4°C. O resfriamento pode ser realizado em uma taxa de 10 °C/min a 60 °C/min, especificamente de 20 °C/min a 50 °C/min, mais especificamente de 30 °C/min a 40 °C/min. Então, as células bacterianas inativadas podem ser separadas da solução de cultura resfriada para obter células bacterianas inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P).
[046] O método para preparar células bacterianas inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) pode compreender, adicionalmente, misturar as células bacterianas inativadas separadas com um agente protetor. Adicionalmente, após isso, o método pode compreender, adicionalmente, pulverizar a mistura obtida das células bacterianas inativadas e do agente protetor. Misturando-se o agente protetor, conforme descrito acima, e pulverizando-se a mistura, é possível evitar que as células bacterianas inativadas se contaminem a partir do ambiente externo e facilitar a distribuição das células bacterianas inativadas.
[047] O agente protetor não é particularmente limitado, porém, por exemplo, pode ser pelo menos um dentre levedura, extrato de levedura, monossacarídeos, polissacarídeos, amidos e açúcares, tais como açúcar bruto e açúcar refinado. Especificamente, o agente protetor pode incluir pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em extrato de levedura, dextrose e açúcar bruto.
[048] A pulverização pode ser realizada através de liofilização, secagem por pulverização ou floculação por pulverização. Mais especificamente, secagem por pulverização pode ser usada. A secagem por pulverização também é denominada secagem por atomizador, e é um método no qual um líquido é pulverizado em um momento em uma corrente quente para obter instantaneamente um produto seco em uma fase líquida. Como um método para pulverizar líquido, há um método de pulverização centrífuga que usa um disco giratório e um método de pulverização pressurizada que usa um bocal de pressão. De modo a realizar a secagem por pulverização em leite desnatado, etc., um aparelho de secagem por pulverização conhecido que emprega esses métodos de pulverização pode ser usado.
[049] Em consideração de simplicidade de operação, é preferencial que as células bacterianas inativadas e o agente protetor sejam misturados para preparar uma mistura, então, a mistura é suspensa em água, a suspensão obtida é submetida a secagem por pulverização, em que, especificamente, uma temperatura de uma entrada de ar quente é de 120 a 200 °C, preferencialmente de 130 a 170 °C, e uma temperatura de uma saída é de 30 a 150 °C, preferencialmente de 50 a 100 °C. Uma quantidade do agente protetor a ser adicionado pode ser de 0,1 a 300 partes em peso, especificamente de 0,1 a 200 partes em peso, com base em 100 partes em peso das células bacterianas inativadas.
[050] Como exemplo, uma quantidade da levedura ou extrato de levedura a ser adicionada é de 0,04 a 50 partes em peso, preferencialmente de 0,1 a 10 partes em peso, uma quantidade dos monossacarídeos a ser adicionada é de 1 a 100 partes em peso, preferencialmente de 10 a 50 partes em peso, e uma quantidade dos açúcares a ser adicionada é de 0,2 a 50 partes em peso, preferencialmente de 0,4 a 10 partes em peso.
[051] Confirmou-se que quando substâncias inorgânicas fisiologicamente aceitáveis, tais como carbonato de cálcio, etc., que são dificilmente solúveis em água, como um aditivo na operação de pulverização, particularmente na operação de secagem por pulverização, a operação foi facilmente realizada. Aqui, uma quantidade da substância inorgânica na composição para adicionar ração animal é de 1 a 99% em peso, especificamente de 1 a 90% em peso, e mais especificamente de 1 a 10% em peso. Como exemplo, a composição para aditivos de ração animal contém de 0,05 a 50% em peso, preferencialmente de 0,5 a 20% em peso, mais preferencialmente de 0,5 a 15% em peso das células bacterianas inativadas em pó, e de 5 a 80% em peso, preferencialmente de 5 a 50%, e mais preferencialmente de 5 a 20% em peso da substância inorgânica.
[052] A composição para os aditivos de ração animal pode incluir o Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) descrito acima ou suas células bacterianas inativadas em uma quantidade de 1,0x108 ufc a 1,0x1010 ufc por 1 g da composição. Especificamente, a quantidade pode ser de 1,0x108 ufc a 3,0x109 ufc, e pode ser de 5x108 ufc em um exemplo.
[053] Doravante, a constituição e o funcionamento da presente invenção serão descritos em mais detalhes através das modalidades preferencialmente exemplificativas da presente invenção. Deve ser notado que os Exemplos a serem descritos abaixo são fornecidos meramente para exemplificar especificamente a presente invenção, e consequentemente, a presente invenção não se limita aos seguintes Exemplos.
[054] As descrições que não estão descritas no relatório descritivo podem ser deduzidas suficientemente e tecnicamente por uma pessoa versada no campo da técnica, e consequentemente, os detalhes da mesma serão omitidos. EXEMPLO EXEMPLOS 1 a 6 Segurança, resistência a ácido, resistência a bile, atividade antimicrobiana, atividade de enzima digestiva e atividade de degradação de triglicerídeo da cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) da presente invenção foram avaliadas como a seguir, com o uso de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 conhecido na técnica como uma cepa de referência.
[055] De modo a avaliar a segurança da cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), um teste de hemólise, um teste de liquefação de gelatina, confirmação de ocorrência de metabólitos prejudiciais (amônia) e um teste de desaminação fenilalanina, foram conduzidos de acordo com um método de teste de avaliação de segurança apresentado pelo padrão da Organização da Indústria de Biotecnologia da Coreia. Resultados dos mesmos foram mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3
[056] Conforme confirmado na Tabela 3, constatou-se que Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) foi negativo em todos dentre o teste de liquefação de gelatina, o teste de desaminação de fenilalanina e a confirmação do teste de amônia, e foi seguro no teste de hemólise.
[057] A cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 que foi anteriormente cultivada em meio MRS e cepa padrão Lactobacillus salivarius KCCM 40210 que foi uma cepa comparativa, foram diluídas 10-6 vezes com solução de MRS ajustada a pH 2, 3 e 7, respectivamente. Cada solução de cepa diluída foi cultivada a 3 7 °C, semeadas em meio de ágar MRS por um período de tempo predeterminado, e anaerobicamente cultivada por 48 horas. Então, o número de colônias foi medido. Resultados do teste de resistência a ácido foram mostrados na Tabela 4 abaixo. TABELA 4
[058] Conforme confirmado a partir da Tabela 4, Lactobacillus salivarius CJLS1511 mostrou menos redução em contagens de células viáveis do que aquela da cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 que foi uma cepa comparativa, em pH 2 a 4 que, desse modo, tem excelente resistência a ácido.
[059] A cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 que foi anteriormente cultivada em meio MRS e a cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 que era uma cepa comparativa, foram ajustadas para pH 4, respectivamente, e uma concentração de uma solução de ácido biliar (Oxgall) foi ajustada para 0%, 0,3% e 1%, respectivamente, e diluídas 10-6 vezes com solução de MRS. Cada solução de cepa diluída foi cultivada a 37 °C, semeadas em meio de ágar MRS por um período de tempo predeterminado, e anaerobicamente cultivada por 48 horas. Então, o número de colônias foi medido. Resultados de medição da contagem de células viáveis são resumidos na Tabela 5 abaixo: TABELA 5
[060] Conforme observado a partir da Tabela 5, a contagem de células viáveis de Lactobacillus salivarius CJLS1511 foi diminuída em ambas as soluções de 0,3% e 1% de ácidos biliares (Oxgall) em pH 4. No entanto, a redução da contagem de células viáveis foi muito inferior àquela da cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 e, assim, constatou-se que a cepa administrada poderia ser cultivada mesmo que o ácido biliar estivesse endogenamente presente no corpo do animal.
[061] Três patógenos (E. coli K88, E. coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709) que foram cultivadas em líquido em um meio de TSB (caldo de soja trípico) (BD, E.U.A.) durante 24 horas foram uniformemente semeados a 105~6 ufc/ml com o suo de um cotonete estéril.
[062] Após estriamento, cepas padrão de Lactobacillus salivarius CJLS1511 e Lactobacillus salivarius KCCM 40210 foram diluídas em tampão de PBS a 109 ufc/ml, respectivamente, em um disco de papel com um diâmetro de 4 mm e, então, distribuídas em 50 μl. Permitiu-se que a solução diluída permanecesse em temperatura ambiente até que fosse suficientemente penetrada no disco de papel e, então, aerobicamente cultivada a 37 °C durante 18 horas. Aqui, a solução diluída incluiu apenas cepas que foram centrifugadas (3.000 x g, 10 minutos) para o sobrenadante após cultivo e lavadas com tampão de PBS 3 vezes. Um tamanho do anel de inibição foi medido por uma diferença entre um diâmetro do anel transparente inteiro e um diâmetro da ranhura de ágar. Resultados dos mesmos foram mostrados na Tabela 6 abaixo. TABELA 6
[063] Conforme confirmado na Tabela 6, tanto Lactobacillus salivarius CJLS1511 quanto a cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 mostraram ação inibidora de proliferação contra micro-organismos patogênicos. No entanto, se confirmou que a cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 teve atividade antimicrobiana maior que aquela da cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210.
[064] Esses resultados foram obtidos devido à própria cepa em vez de um efeito pelos metabólitos produzidos por Lactobacillus salivarius CJLS1511, que demonstrou que o crescimento de micro-organismos prejudiciais poderia ser inibido quando aplicado ao gado.
[065] Um experimento para avaliar atividade de degradação de enzima digestiva foi realizado para determinar se a cepa era um lactobacilo que tem uma enzima que tem capacidade para degradar carboidrato, proteína e fósforo.
[066] Para determinar se a atividade de protease estava presente, 0,5% (em p/v) de leite desnatado foi adicionado a um meio de ágar MRS. Para determinar se atividade de celulase estava presente, o meio de ágar MRS foi complementado com 0,2% (em p/v) de metilcelulose. Para determinar se atividade de α-amilase estava presente, 0,2% (em p/v) de amido de milho foi adicionado ao meio de ágar MRS. Para determinar se atividade de fitase estava presente, 0,5% (em p/v) de sal de cálcio de fitato foi adicionado ao meio. As cepas isoladas em cada um dos meios preparados acima foram semeadas, cultivadas por 24 horas, e observadas.
[067] A presença ou ausência de atividade de α- amilase e atividade de celulase foi determinada lavando-se os meios de cultura de 24 horas que foram tratados com um reagente de 2% de vermelho congo (Sigma, E.U.A), seguido por lavagem com 1 M de cloreto de sódio (NaCl), e confirmando-se a presença ou ausência de cor. Adicionalmente, a determinação da presença ou ausência da atividade de protease e a atividade fitase foi confirmada pela presença do anel transparente, e os resultados do mesmo foram mostrados na Tabela 7 abaixo. TABELA 7
[068] Conforme confirmado a partir da Tabela 7, constatou-se que Lactobacillus salivarius CJLS1511 teve atividade de enzimas digestivas, tal como atividade de protease, atividade de fitase, atividade de degradação de celulose e atividade de amilase maior que aquelas da cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210.
[069] Esses resultados demonstraram que quando Lactobacillus salivarius CJLS1511 foi aplicado ao gado, a eficiência de alimentação poderia ser melhorada. Exemplo Experimental 6: Avaliação de atividade de degradação de lipídeo neutro de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
[070] Como resultado da pesquisa por uma atividade de hidrolase de sal biliar (BSH) de Lactobacillus salivarius CJLS1511, confirmou-se que precipitado branco se formou em meio de MRS sólido complementado com 2 mM de hidrato de taurodeoxicolato (TDCA, Sigma, E.U.A) e, assim, a atividade enzimática estava presente. Adicionalmente, o padrão de sedimentação da mesma foi similar àquele da cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210, que foi uma cepa de controle positivo de TDCA. No entanto, no meio complementado com 2 mM de glicodeoxicolato de sódio (GDCA, Sigma, E.U.A), a cepa de Lactobacillus salivarius CJLS1511 cresceu bastante, porém, a cepa padrão de Lactobacillus salivarius KCCM 40210 não mostrou precipitação e não cresceu bastante. Resultados dos mesmos foram mostrados na Tabela 8 abaixo. TABELA 8
O: Precipitação foi formada, X: Precipitação não foi formada, +: Crescido, -: Não crescido
[071] Conforme observado a partir da Tabela 8, Lactobacillus salivarius CJLS1511 teve alta resistência a bile e foi convertido em uma forma que tem capacidade para degradar lipídeo neutro através da produção de BSH, o que constatou que Lactobacillus salivarius CJLS1511 foi uma cepa funcional que poderia afetar o peso corporal quando aplicada em animais.
[072] As cepas padrão de Lactobacillus salivarius CJLS1511 e Lactobacillus salivarius KCCM 40210 foram semeadas em meios de ágar MRS com um laço, respectivamente, e cultivadas a 37 °C por 48 horas para preparar soluções de cultura.
[073] Então, cada solução de cultura foi indiretamente aquecida a uma temperatura de 100 °C com o uso de um trocador de calor e rapidamente resfriada até 10 °C a uma taxa de 30 a 100 l/min. As células bacterianas inativadas foram separadas da solução de cultura rapidamente resfriada através de uma centrífuga (3.000 x g, 10 minutos) para preparar célula bacteriana inativada de Lactobacillus salivarius CJLS1511 e Lactobacillus salivarius KCCM 40210, respectivamente.
[074] As cepas padrão de Lactobacillus salivarius CJLS1511 e Lactobacillus salivarius KCCM 40210 foram semeadas em meios de ágar MRS com um laço, respectivamente, e cultivadas a 37 °C por 48 horas para preparar soluções de cultura.
[075] Então, cada solução de cultura foi indiretamente aquecida a uma temperatura de 100 °C com o uso de um trocador de calor e rapidamente resfriada até 10 °C a uma taxa de 30 a 100 l/min. As células bacterianas inativadas foram separadas da solução de cultura rapidamente resfriada através de uma centrífuga (3.000 x g, 10 minutos) para preparar Lactobacillus salivarius CJLS1511 e Lactobacillus salivarius KCCM 40210 inativados, respectivamente. Então, extrato de levedura, dextrose e açúcar bruto foram misturados com os mesmos, respectivamente. Cada mistura foi suspensa em água, e a suspensão obtida foi submetida a secagem por pulverização para obter pó. Aqui, especificamente, a secagem por pulverização foi realizada sob condições nas quais uma temperatura de uma entrada de ar quente foi de 150 °C e uma temperatura de uma saída foi de 100 °C. Como o agente protetor, o extrato de levedura foi adicionado em 20 partes em peso, a dextrose foi adicionada em 30 partes em peso e o açúcar bruto foi adicionado em 5 partes em peso, com base em 100 partes em peso das células bacterianas inativadas.
[076] Hidrofobicidade e floculabilidade das células bacterianas inativadas preparadas no Exemplo de Preparação 1 foram testadas pelo método descrito abaixo. O ganho de peso corporal e a razão de conversão de alimentação de uma dieta basal complementada com o Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado e uma dieta basal sem incluir as células foram comparadas entre si.
[077] Para confirmar a diferença em hidrofobicidade e floculabilidade entre células vivas e células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511, uma reação de autofloculação e um teste de coagregação foram avaliados.
[078] O teste de coagregação foi realizado adicionando-se 1 ml de tolueno em 3 ml de lactobacilo diluído de modo que OD600 foi 0,5 em relação às células vivas e as células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511, seguido por mistura em vórtice por 90 segundos. Então, permitiu-se que cada mistura permanecesse em um banho de água a 37 °C por 1 hora, tolueno foi removido e o OD600 da camada de solução aquosa foi medido.
[079] A reação de coagregação foi realizada misturando-se as células vivas e as células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 com micro-organismos patogênicos (E. coli K88, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709) na mesma quantidade (microorganismos patogênicos: células vivas ou células mortas = 1:1 (cada 1,5 ml)) para preparar uma mistura, e adicionando-se 1 ml de tolueno em 3 ml da mistura, respectivamente, seguido por mistura em vórtice por 90 segundos. Então, permitiu-se que cada mistura permanecesse em um banho de água a 37 °C por 1 hora, tolueno foi removido e o OD600 da camada de solução aquosa foi medido.
[080] A hidrofobicidade (%) foi calculada em 100 x (OD600 inicial - OD600 após 1 hora)/OD600 inicial.
[081] Resultados da reação de autoagregação e a reação de coagregação entre células vivas e células inativadas foram mostradas na Tabela 9 abaixo. TABELA 9
[082] Conforme observado a partir da Tabela 9, tanto a reação de autofloculação quanto a reação de coagregação de Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado se mostraram 1,5 vezes maiores do que aquelas das células vivas. Acredita- se que hidrofobicidade e agregação extracelulares dos microorganismos são afetadas pelas características e estrutura de superfície das proteínas de superfície celular, e o Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado tem hidrofobicidade e agregação aumentadas devido a uma estrutura de proteína diferente em superfície celular daquela das células vivas, conforme mostrado na Figura 1. Como resultado, espera- se que seja usada como uma cepa funcional que afeta a habilidade antidoença aderindo-se à endotoxina.
[083] Frangos foram alimentados com dieta basal com 0,2%(p/p) complementado do Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado e dieta basal sem incluir o mesmo (grupo de controle) por 29 dias tanto quanto um período de alimentação normal, e peso corporal médio inicial (g), peso corporal médio final (g), ganho diário médio (g/d), admissão de ração diária média (g/d) e a razão de conversão de ração foram medidos, respectivamente. Resultados dos mesmos foram mostrados na Tabela 10 abaixo. TABELA 10
a,b Meios com diferentes caracteres se diferem significativamente (P < 0,05).
[084] Conforme mostrado na Tabela 10, o grupo tratado com o Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado da presente invenção mostrou efeitos superiores tanto no ganho de peso corporal quanto na razão de conversão de ração em comparação com aqueles do grupo de controle que não foram tratados com o Lactobacillus salivarius CJLS1511 inativado.
[085] Nome da autoridade de depósito: Centro de Cultura de Micro-organismos da Coreia (KCCM) (internacional)
[086] Número de acesso: KCCM11829P
[087] Data de acesso: 20160412
Claims (10)
1. COMPOSIÇÃO PARA ADITIVOS DE RAÇÃO ANIMAL, caracterizada por compreender células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) e um agente protetor das células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), em que as células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) estão presentes em uma quantidade de 0,1% em peso a 10% em peso com base no peso total da composição para aditivos de ração animal, e em que o agente protetor é, pelo menos, um selecionado dentre o grupo que consiste em levedura, extrato de levedura, monossacarídeos, polissacarídeos, amidos e açúcares.
2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) estarem presentes em uma quantidade de 1,0x108 cfu a 1,0x1010 cfu por 1,0 g da composição para aditivos de ração animal.
3. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo animal ser frango.
4. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelas células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) estarem presentes em uma quantidade de 0,1% em peso a 1% em peso com base no peso total da composição para aditivos de ração animal.
5. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO PARA ADITIVOS DE RAÇÃO ANIMAL, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por compreender: cultivar células de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) para preparar uma solução de cultura, aquecer a solução de cultura a uma temperatura de 70 a 160C, resfriar a solução de cultura aquecida a uma temperatura na faixa de 10 a 60°C, e isolar células inativadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) da solução de cultura resfriada, e misturar as células inativadas e isoladas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) com excipientes, em que a solução de cultura não está contida na composição para aditivos de ração animal, conforme definida na reivindicação 1.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo aquecimento ser realizado por aquecimento indireto através de um trocador de calor.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo resfriamento ser realizado a uma taxa de 10°C/min a 60°C/min.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por compreender adicionalmente misturar as células inativadas e isoladas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) com um agente protetor.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender adicionalmente a pulverização das células inativadas e misturadas de Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) .
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo agente protetor ser pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em levedura, extrato de levedura, monossacarídeos, polissacarídeos, amidos e açúcares.
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