JP2019524129A - ラクトバチルスサリバリウスｃｊｌｓ１５１１、該菌またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物、及び該死菌体の製造方法 - Google Patents

ラクトバチルスサリバリウスｃｊｌｓ１５１１、該菌またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物、及び該死菌体の製造方法 Download PDF

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Abstract

新規のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１菌株またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物、及び前記死菌体の製造方法に係わる。【選択図】図１

Description

本発明は、新規のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１、前記菌またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物、及び前記死菌体の製造方法に関する。
ラクトバチルス属（Lactobacillus ｓｐ．）微生物は、同型発酵（homo-fermentation）または異型発酵（hetero-fermentation）を行う乳酸桿菌であり、ヒトを含む動物の腸管、及び乳製品や野菜の発酵過程で一般的に見られる。ラクトバチルス属微生物は、動物の腸管で発見される乳酸生成菌であり、その基質として、乳製品または野菜を利用し、同種発酵または異種発酵を行う。該ラクトバチルス属微生物は、腸内ｐＨを酸性に維持させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）やクロストリジウム（Clostridium）のような有害菌の繁殖を抑制し、下痢と便秘とを改善させるだけでなく、ビタミン合成、抗癌作用、血清コレステロール低下などの役割をすると知られている。
ラクトバチルス属微生物の前記特性を利用し、生菌剤及び家畜飼料として開発しようとする研究が活発に進められている。家畜の細菌性下痢病は、増体率低下と斃死とを誘発する。従って、それを予防し、家畜の生産を高めるために、飼料に抗生物質を添加することが一般的に広く行われてきた。しかし、該抗生物質に対する耐性菌の出現や、畜産物内の残留抗生物質のような問題のために、飼料内抗生物質の使用を規制し、有機的な家畜飼育法が強調されている（大韓民国特許出願公開第１９９８−７８３５８号）（McEwen and Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106）。
そのために、本発明の一様態として、家畜の飼料として使用するとき、動物の増体を改善させることができ、動物の免疫力あるいは抗病力を改善させ、動物の腸内有害細菌増殖を抑制することができる新規のラクトバチルス属微生物を提供するものである。
本発明の一様態は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（Lactobacillus salivarius ＣＪＬＳ１５１１）（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体に係わる。
本発明の他の様態は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物に係わる。
本発明のさらに他の様態は、本願に記述された動物飼料添加剤組成物を含む動物飼料に係わる。
本発明のさらに他の様態は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）を培養して培養液を製造し、
前記培養液を７０℃ないし１６０℃の温度で加熱し、
前記加熱された培養液を１０℃ないし６０℃の範囲の温度に冷却し、
前記冷却された培養液で、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体を分離することを含むラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体の製造方法に係わる。
本発明の一様態によるラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１またはその死菌体は、中性脂肪分解能、内毒素吸着能、病原性細菌生長抑制力及び消化酵素活性能にすぐれる。
本発明の一様態によるラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物または動物飼料は、動物の増体を改善し、免疫性ないし抗病力を向上させることができる。
ラクトバチルスサリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＣＪＬＳ１５１１菌株またはその死菌体の電子顕微鏡写真を示したイメージである。 ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の系統樹（phylogenetic tree）を示す図面である。
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。本明細書に記載されていない内容は、本発明の技術分野または類似分野において、当業者であるならば、十分に認識して類推することができるものであるので、その説明を省略する。
本発明の一様態は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（Lactobacillus salivarius ＣＪＬＳ１５１１）（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体に係わるものである。
本願において、「ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の死菌体」は、例えば、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の非活性菌体、具体的には、熱によって非活性化された菌体でもある。
本発明者らは、肉鶏の小腸末端を採取し、滅菌蒸溜水で洗浄した後、０．００１％のブロームペニーコールパープル（ＢＣＰ：bromphenicol purple）が添加されたＭＲＳ培地に塗抹（streaking）し、３７℃で嫌気培養した。ここで、乳酸菌生成菌株５０種余りを選別し、継代培養した後、該菌株を利用し、形態学的分離方法により、桿菌形態の２４種を二次分離した。２４種に対する抗菌活性能及び消化酵素活性能を比較し、１０種を三次分離し、この乳酸菌生成菌株の耐胆汁性、耐酸性及び動物腸壁細胞吸着性を測定し、糖質発酵、病原性細菌生長抑制力、消化酵素活性能、中性脂肪分解能が最も優秀な菌株１種を分離した。
前記分離された乳酸菌生成菌株を、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１と命名し、韓国微生物保存センターに２０１６年４月１２日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）。
前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の形態学的及び生理学的な特性は、下記表１の通りである。
また、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１は、図１に図示されているように、棒（rod）形態を有し、胞子を形成しない。前記菌株を死菌化させたとき、細胞壁表面の糖蛋白質活性により、生菌と死菌との差が確認される。
前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の生化学的分析のために、ＡＰＩキットに分析した結果、下記表２のように、ラクトバチルスサリバリウスＡＴＣＣ１１７４１あるいはＫＣＣＭ４０２１０標準菌株と類似した糖質利用性を有するように同定され、１６ｓ ｒＲＮＡ分析をマクロジェンに依頼し、ラクトバチルスサリバリウスＡＴＣＣ１１７４１あるいはＫＣＣＭ４０２１０標準菌株と９９％類似した分子生物学的特性を有するものとして、図２のように同定された。
前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）は、耐酸性、耐胆汁性、抗菌活性、消化酵素活性能及び中性脂肪分解能にすぐれつつ、それを動物飼料または飼料組成物に使用するとき、飼料効率、及び動物の増体を効果的に改善させることができるという利点がある。
前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の死菌体は、腸内有害細菌と競争的付着阻害能を発揮し、腸内細菌叢形成に寄与し、小腸内において、死菌体の細胞壁が破壊されながら溶出された細胞壁構成成分であるリポタイコ酸（lipoteichoic acid）が、腸内有害細菌の腸粘膜定着を妨害することができる。また、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の死菌体は、生菌に比べ、疎水性及び凝集性が高く、病原性微生物及び内毒素に付着し、抗病力を向上させることができるという利点がある。さらに、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の死菌体を飼料に投与し、動物に給餌するならば、増体量及び飼料要求率のいずれをも向上させることができる。
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体は、保護剤を追加して含んでもよい。前記保護剤の例としては、酵母、酵母抽出物、単糖類、多糖類、澱粉類、原糖及び精製糖のような砂糖類のうち１種以上でもある。具体的には、酵母抽出物、デキストロース及び原糖によって構成された群から選択される１種以上の物質を有することができる。該保護剤を利用すれば、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体を外部環境から保護し、汚染を防止することができ、その流通期限を延長させる効果がある。
本発明の他の実施例は、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物に係わるものである。具体的には、前記動物飼料添加剤組成物は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の死菌体を含んでもよい。
前記動物飼料添加剤組成物は、賦形剤を追加して含んでもよい。前記賦形剤は、特別に制限されるものではなく、当該技術分野において、一般的に使用する賦形剤を使用することができる。該賦形剤としては、例えば、糖類（例：ラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、スクロースなど）、ガム類（例：キサンタンガム、グアガム、アラビア産ガムなど）、澱粉類（例：とうもろこし澱粉、じゃがいも澱粉など）、無機塩類（例：リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、沈降炭酸カルシウムなど）などがある。
前記動物飼料添加剤組成物は、組成物１ｇ当たり前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体が、１．０ｘ１０８ｃｆｕないし１．０ｘ１０１０ｃｆｕで含むものでもある。具体的には、１．０ｘ１０８ｃｆｕないし３．０ｘ１０９ｃｆｕで含むものでもあり、一例においては、５ｘ１０８ｃｆｕで含んでもよい。
該動物飼料添加剤組成物は、粉末、ペレットまたは粒状のような形態でもある。該動物飼料添加剤組成物において、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体の含量は、０．１重量％ないし１０重量％の範囲、具体的には、０．１重量％ないし７重量％の範囲でもある。前記範囲で組成物に、前記菌株またはその死菌体を含む場合、該動物飼料添加剤組成物の中性脂肪分解能、内毒素吸着能、病原性細菌生長抑制能及び消化酵素活性能が極大化されるという利点がある。
他の様態において、前記動物飼料添加剤組成物を使用して製造された動物飼料が提供される。前記動物飼料は、本発明の一様態による動物飼料添加剤組成物を、一般的な動物飼料と混合して製造されたものでもある。該動物飼料において、本願の動物飼料添加剤組成物の量は、動物飼料重量を基準に、０．１重量％ないし１重量％でもある。
該動物飼料は、特別に制限されるものではなく、飼育動物用飼料でもある。「飼育動物」とは、乳、肉、卵、毛、皮革、羽毛のように、人間に有用な畜産物及び水産物を生産するための動物及びペットを含む意味である。具体的な例として、犬、牛、ニワトリ、豚、馬のような飼育動物に給餌するためのものでもある。さらに具体的には、ニワトリのような家禽類、さらに具体的には、肉鶏に給餌するためのものでもある。
該動物飼料は、動物の成長に必須な炭水化物、タンパク質、脂肪、ビタミン、無機質などの成分を含んでもよい。タンパク質としては、動物性タンパク質または植物性タンパク質でもあり、例えば、肉粉、家禽類粉、魚粉、大豆タンパク質、牛乳タンパク質またはグルテンなどでもある。前記炭水化物としては、穀類または豆類、例えば、とうもろこし、米、小麦、麦、オート、大豆、またはそららの混合物を挙げることができる。前記脂質としては、動物性脂質、植物性脂質または肉類などでもある。または、前記成分以外に、動物飼料に機能性を付加する他の成分を追加して含んでもよい。または、糖、塩、香辛料、調味料、香味剤などが混入されもする。
本発明のさらに他の実施例は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）を培養して培養液を製造し、前記培養液を７０℃ないし１６０℃の温度で加熱し、前記加熱された培養液を１０℃ないし６０℃の範囲の温度に冷却し、前記冷却された培養液において、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体を分離することを含むラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体の製造方法に係わるものである。
具体的には、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）を培養し、培養液を製造する段階は、寒天培地、具体的には、ＭＲＳ培地でもある。前記培養は、２５℃ないし４０℃において、５時間ないし４８時間培養、具体的には、３０℃ないし４０℃において、１２時間ないし３６時間培養、さらに具体的には、３５℃ないし４０℃において、２０時間ないし３０時間培養し、培養液を製造することができる。
その後、前記培養液を７０℃ないし１６０℃の温度で加熱する。前記加熱は、直接加熱手段あるいは間接加熱手段を利用することができるが、熱交換機のような間接加熱手段を介しても行われる。前記加熱は、具体的には、８０℃ないし１５０℃、さらに具体的には、９０℃ないし１２０℃の温度範囲でも行われる。前記加熱を介して、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１を不活性化あるいは死菌化することができる。
前記加熱された培養液を、その後１０ないし６０℃、具体的には、２０ないし５０℃の温度に冷却するか、あるいは一例としては、４℃まで急速冷却することができる。前記冷却は、１０℃／ｍｉｎないし６０℃／ｍｉｎ、具体的には、２０℃／ｍｉｎないし５０℃／ｍｉｎ、さらに具体的には、３０℃／ｍｉｎないし４０℃／ｍｉｎの速度で冷却することができる。その後、前記冷却された培養液において、死菌体を分離することにより、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体を得ることができる。
前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）死菌体の製造方法は、前記分離された死菌体に保護剤を混合することを追加して含んでもよい。また、その後、前記死菌体と保護剤との混合物を粉末化することを追加して含んでもよい。前述のところのように保護剤を混合し、該混合物を粉末化することにより、死菌体が外部環境から汚染されることを防止し、死菌体の流通をさらに容易にすることができるという利点がある。
前記保護剤は、特別に制限されるものではないが、例えば、酵母、酵母抽出物、単糖類、多糖類、澱粉類、原糖及び精製糖のような砂糖類のうち１種以上でもある。具体的には、酵母抽出物、デキストロース及び原糖によって構成された群から選択される１種以上の物質を使用することができる。
前記粉末化は、凍結乾燥、噴霧乾燥あるいは噴霧凝集を利用することができ、さらに具体的には、噴霧乾燥を利用することができる。該噴霧乾燥は、スプレードライとも呼ばれ、熱気流中に一度に液体を噴霧し、瞬間的に液状の乾燥物を得る方法であり、液体を噴霧形状にする方法としては、回転円盤による遠心噴霧と、圧力ノズルによる加圧噴霧とがある。脱脂乳などに噴霧乾燥を施すためには、それら噴霧方法を採用した公知の噴霧乾燥装置を利用することができる。
操作の簡便性を考慮すれば、死菌体と保護剤とを混合して混合物を作った後、この混合物を水中に懸濁させた後、得られた懸濁液を噴霧乾燥処理するが、すなわち、熱風の流入口温度を１２０〜２００℃、望ましくは１３０〜１７０℃にし、出口温度を３０〜１５０℃、望ましくは５０〜１００℃にし、噴霧乾燥することが望ましい。保護剤の添加量は、死菌体の重量１００重量部を基準に、０．１重量部ないし３００重量部、具体的には、０．１重量部ないし２００重量部でもある。
一例において、酵母または酵母抽出物の添加量は、０．０４〜５０重量部、望ましくは０．１〜１０重量部にする一方、単糖類の添加量を、１〜１００重量部、望ましくは１０〜５０重量部にし、砂糖類の添加量を、０．２〜５０重量部、望ましくは０．４〜１０重量部にする。
粉末化操作、特に、噴霧乾燥操作において、水に難溶性である炭酸カルシウムのような、生理学的に許容される無機物質を添加剤として使用すれば、操作が容易になることを確認した。その場合、添加剤組成物のうち無機物質の量は、１〜９９重量％、具体的には、１〜９０重量％、さらに具体的には、１〜１０重量％である。一例において、該添加剤組成物は、死菌体粉末０．０５〜５０重量％、望ましくは０．５〜２０重量％、さらに望ましくは０．５〜１５重量％を含み、無機物質５〜８０重量％、望ましくは５〜５０％、さらに望ましくは５〜２０％を含む。
添加剤組成物中の死菌体は、当該組成物１ｇ当たり、前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）またはその死菌体が、１．０ｘ１０８ｃｆｕないし１．０ｘ１０１０ｃｆｕで含まれるものでもある。具体的には、１．０ｘ１０８ｃｆｕないし３．０ｘ１０９ｃｆｕで含まれるものでもあり、一例において、５ｘ１０８ｃｆｕでも含まれる。
以下、本発明の望ましい実施例を介して、本発明の構成及び作用について、さらに詳細に説明する。ただし、それらは、本発明の望ましい例示に提示されたものであり、いかなる意味においても、それらにより、本発明が制限されると解釈されるものではない。
ここに記載されていない内容は、当該技術分野において当業者であるならば、十分に技術的に類推することができるものであるので、その説明を省略する。
実験例１ないし６
公知の菌株であるラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ４０２１０を比較菌株にし、本発明のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）菌株の安全性、耐酸性、耐胆汁性、抗菌活性、消化酵素活性及び中性脂肪分解活性を下記のように評価した。
実験例１：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の安全性評価
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）菌株の安全性を評価するために、韓国バイオベンチャー協会団体標準で提示した安全性評価試験法により、溶血現象検査、ゼラチン液化反応検査、有害代謝産物（アンモニア）生成確認及びフェニルアラニン脱アミン検査を行った。その結果を下記表３に示した。
前記表３から確認することができるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）は、ゼラチン液化反応検査、フェニルアラニン脱アミン検査及びアンモニア生成確認検査において、いずれも陰性を示し、溶血検査でも安全であるということが分かった。
実験例２：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の耐酸性評価
ＭＲＳ培地で事前培養したラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１菌株と、比較菌株であるラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ４０２１０標準菌株とに対して、ｐＨ２，３，７にそれぞれ調整したＭＲＳ溶液で、１０−６倍希釈した。希釈した菌液を３７℃で培養しながら、一定時間帯別に、ＭＲＳ agar培地に塗抹し、４８時間嫌気的に培養した後、コロニー数を測定した。該耐酸性実験の結果は、表４に示した。
前記表４から確認することができるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１は、ｐＨ２ないし４において、比較菌株であるラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ４０２１０標準菌株より生存菌数の減少が少なく、耐酸性にすぐれるということが分かった。
実験例３：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の耐胆汁性評価
ＭＲＳ培地で事前培養したラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１菌株と、比較菌株であるラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ４０２１０標準菌株とを、ｐＨ４にそれぞれ調整後、胆汁酸液（Oxgall）を、それぞれ０％、０．３％、１％になるように濃度を合わせた後、ＭＲＳ溶液で１０−６倍希釈した。希釈した菌液を３７℃で培養しながら、一定時間帯別に、ＭＲＳ agar培地に塗抹し、４８時間嫌気的に培養した後、コロニー数を測定した。菌数を測定した結果は、表５に要約した。
前記表５から分かるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１は、ｐＨ４、胆汁酸（Oxgall）の０．３％溶液及び１％溶液のいずれにおいても、生存菌数の数が減少したが、ラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ４０２１０標準菌株に比べ、菌数の減少程度がさらに少なく、動物体内で胆汁酸が分泌されても、投与された菌株が生育することができるということを確認した。
実験例４：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ１１８２９Ｐ）の抗菌活性評価
ＴＳＢ（Tryptic soy broth）培地（ＢＤ、米国）に、２４時間液体培養された３種の病源菌（Ｅ．coli Ｋ８８、Ｅ．coli ＡＴＣＣ ２５９２２、Salmonella typhimurium ＫＣＣＭ ２５９２２、Salmonella cholerasuis ＫＣＣＭ １０７０９）を、滅菌された綿棒で均一に１０５〜６ｃｆｕ／ｍｌで塗抹した。
塗抹後、直径４ｍｍのpaper discにラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１とラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株とを、それぞれＰＢＳバッファに、１０９ｃｆｕ／ｍＬで希釈した後、５０μｌずつ分注した。希釈液が、paper disc中に十分に染みこむまで室温に放置した後、３７℃で１８時間好気培養した。ここで、前記希釈液は、培養後、上澄み液を遠心分離（３，０００ｘｇ、１０分）した後、ＰＢＳバッファを利用しての３回洗浄後、使用した菌体のみを使用したものである。阻害環の大きさは、全体透明環の直径とagar溝との径差でもって測定した。その結果は、表６に示した。
前記表６から確認することができるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１とラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株とのいずれも、病原性微生物に対する増殖抑制作用を示したが、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１菌株が、ラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株に比べ、抗菌活性が高いと確認された。
そのような結果は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１が生成する代謝産物による効果ではない菌体自体による効果であるために、それを家畜に適用するとき、有害微生物増殖を抑制することができるということを証明する。
実験例５：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）の消化酵素活性評価
消化酵素活性実験は、炭水化物、タンパク質、リンを分解することができる酵素を有している乳酸菌であるか否かということを確認するために行われた。
プロテアーゼ（protease）活性があるか否かということを知るために、ＭＲＳ寒天培地に、スキームミルク（skim milk）０．５（ｗ／ｖ）％を添加し、セルラーゼ（cellulase）活性があるか否かということを知るために、ＭＲＳ寒天培地に、メチルセルロースを０．２（ｗ／ｖ）％添加し、ａ−アミラーゼ（ａ−amylase）活性があるか否かということを知るために、ＭＲＳ寒天培地に、とうもろこし澱粉（corn starch）０．２％（ｗ／ｖ）を入れ、フィターゼ（phytase）活性を知るために、フィテートカルシウム塩（Ｃａ−phytate）を０．５（ｗ／ｖ）％添加した培地をそれぞれ製造した。前述のところで製造されたそれぞれの培地に、分離された菌株を塗抹した後、２４時間培養した後で観察した。
ａ−アミラーゼ活性とセルラーゼ活性は、２４時間培養した培地に、２％コンゴーレッド（congored、Sigma、米国）試薬を処理した後、１Ｍ塩化ナトリウム（Ｎａｃｌ）を利用して洗浄した後、色いかんにより、分解酵素いかんを確認した。また、プロテアーゼとフィターゼとの活性いかん判定は、透明環いかんによって確認し、その結果を下記表７に記載した。
前記表７から確認することができるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１は、ラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株に比べ、プロテアーゼ活性、フィターゼ活性、セルロース分解活性、アミラーゼ活性などの消化酵素活性が高いと確認された。
そのような結果は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１を家畜に適用するとき、飼料の効率を改善させることができるということを立証する。
実験例６：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）の中性脂肪分解活性評価
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１のＢＳＨ（Bile salt hydrolase）活性を調査した結果、２ｍＭのＴＤＣＡ（taurodeoxycholate hydrate、Sigma、米国）を添加したＭＲＳ固体培地で白沈澱を生成し、酵素活性があることが確認され、ＴＤＣＡ陽性対照群菌株であるラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株の沈澱と類似した沈澱様相を示した。しかし、２ｍＭのＧＤＣＡ（sodium glycodeoxycholate、Sigma、米国）を添加した培地においては、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１菌株の場合、菌が良好に育ったが、ラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株の場合、沈澱を示さず、菌が良好に育たなかった。該結果を下記表８に記載した。
前記表８から分かるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１は、高い胆汁耐性を有し、ＢＳＨ生産により、中性脂肪を分解することができる形態に転換され、それを動物に適用するとき、増体に影響を与えることができる機能性菌株であるということが確認された。
製造例１
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１とラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株とを、それぞれＭＲＳ寒天培地にループで塗抹し、３７℃で４８時間培養し、培養液を製造した。
その後、前記培養液を、熱交換機を利用し、１００℃温度に間接加熱し、それを３０〜１００Ｌ／ｍｉｎの速度で、１０℃まで急速冷却した。急速冷却された培養液において、死菌体を遠心分離機（３，０００ｘｇ、１０分）を介して分離することにより、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体及びラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０死菌体をそれぞれ製造した。
製造例２
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１とラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０標準菌株とを、それぞれＭＲＳ寒天培地にループに塗抹し、３７℃で４８時間培養して培養液を製造した。
その後、前記培養液を、熱交換機を利用し、１００℃の温度に間接加熱し、それを３０〜１００Ｌ／ｍｉｎの速度で、１０℃まで急速冷却した。急速冷却された培養液において、死菌体を、遠心分離機（３，０００ｘｇ、１０分）を介して分離することにより、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体及びラクトバチルスサリバリウスＫＣＣＭ ４０２１０死菌体をそれぞれ製造し、そこに、酵母抽出物、デキストロース及び原糖をそれぞれ混合した。前記混合物を水中に懸濁させた後、得られた懸濁液を噴霧乾燥して粉末を得た。このとき、すなわち、熱風の流入口温度は、１５０℃、出口温度は、１００℃にし、噴霧乾燥した。保護剤の添加量は、死菌体の重量１００重量部を基準に、酵母抽出物の添加量が、２０重量部、デキストロースの添加量を、３０重量部、原糖の添加量は、５重量部にした。
前記製造例１で製造された死菌体に対して、疎水性及び凝集性を、以下に記述された方法によって実験し、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体を含む基礎飼料と、それを含まない基礎飼料との増体量及び飼料要求率を比較した。
実験例７：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）の生菌と死菌との疎水性及び凝集性の評価
ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の生菌と死菌との疎水性と凝集性との差を確認するために、自家凝集反応と同時凝集反応とを評価した。
該自家凝集反応は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の生菌と死菌とに対し、ＯＤ６００が０．５になるように希釈した乳酸菌３ｍＬに、１ｍＬのトルエンを添加し、９０秒間vortexした。その後、３７℃水槽で１時間放置した後、トルエンを除去し、水溶液層のＯＤ６００を測定した。
該同時凝集反応は、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１の生菌と死菌とに対し、病原性微生物（Ｅ．coli Ｋ８８、Salmonella typhimurium ＫＣＣＭ ２５９２２、Salmonella cholerasuis ＫＣＣＭ １０７０９）と同量に混合（病原性微生物：生菌または死菌＝１：１（各１．５ｍｌ））した３ｍＬに、それぞれ１ｍＬのトルエンを添加し、９０秒間vortexした。その後、３７℃水槽で１時間放置した後、トルエンを除去し、水溶液層のＯＤ６００を測定した。
疎水性（％）は、１００ｘ（初期ＯＤ６００−１時間ＯＤ６００）／初期ＯＤ６００で計算した。
生菌と死菌との自家凝集反応と同時凝集反応との結果は、下記表９に記載した。
前記表９から分かるように、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体の自家凝集反応と同時凝集反応とのいずれも、生菌より１．５倍ほど高いということが分かった。微生物細胞外の疎水性及び凝集性は、細胞表面タンパク質の特性や表面構造に影響を受け、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体は、図１のように、表面タンパク質構造が生菌と異なり、疎水性と凝集性とが増大すると見られる。それにより、内毒素に付着し、抗病力に影響を与える機能性菌株への利用可能性が期待される。
実験例８：ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体を含む飼料と一般基礎飼料との比較
ＥＵ肉鶏の基礎飼料に、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体０．２％（ｗ／ｗ）を投与した飼料と、それを投与していない基礎飼料（対照群）とに対して、通常の飼料給餌のように、２９日間給餌し、開始平均体重（ｇ）、終了平均体重（ｇ）、１日当たり平均増体量（ｇ／ｄ）、平均１日当たり飼料摂取量（ｇ／ｄ）及び飼料要求率をそれぞれ測定した。その結果を下記表１０に示した。
前記表１０から分かるように、本発明のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１死菌体投与群は、それを投与していない対照群に比べ、増体量及び飼料要求率のいずれもすぐれた効果を示した。

Claims (15)

  1. ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）またはその死菌体。
  2. ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）またはその死菌体を含む動物飼料添加剤組成物。
  3. 前記動物飼料添加剤組成物が前記死菌体を含むことを特徴とする請求項２に記載の動物飼料添加剤組成物。
  4. 前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）またはその死菌体が、動物飼料添加剤組成物１ｇ当たり１．０ｘ１０８ｃｆｕないし１．０ｘ１０１０ｃｆｕで含まれることを特徴とする請求項２に記載の動物飼料添加剤組成物。
  5. ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）またはその死菌体の保護剤を追加して含むことを特徴とする請求項２ないし４のうちいずれか１項に記載の動物飼料添加剤組成物。
  6. 前記保護剤が、酵母、酵母抽出物、単糖類、多糖類、澱粉類、砂糖類のうち１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の動物飼料添加添加剤組成物。
  7. 前記動物が肉鶏であることを特徴とする請求項２ないし４のうちいずれか１項に記載の動物飼料添加剤組成物。
  8. 前記ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）またはその死菌体が、動物飼料の重量基準で、０．１重量％ないし１重量％であることを特徴とする請求項２ないし４のうちいずれか１項に記載の動物飼料添加剤組成物。
  9. 請求項８に記載の動物飼料添加剤組成物を含む動物飼料。
  10. ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）を培養し、培養液を製造し、
    前記培養液を７０℃ないし１６０℃の温度で加熱し、
    前記加熱された培養液を１０℃ないし６０℃の範囲の温度に冷却し、
    前記冷却された培養液において、ラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体を分離することを含むラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
  11. 前記加熱が、熱交換機を介して、間接加熱されることを特徴とする請求項１０に記載のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
  12. 前記冷却が、１０℃／ｍｉｎ〜６０℃／ｍｉｎの速度で冷却されることを特徴とする請求項１０に記載のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
  13. 前記分離された死菌体に保護剤を混合することを追加して含むことを特徴とする請求項１０ないし１２のうちいずれか１項に記載のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
  14. 前記混合された死菌体を粉末化することを、追加して含むことを特徴とする請求項１３に記載のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
  15. 前記保護剤が、酵母、酵母抽出物、単糖類、多糖類、澱粉類、砂糖類のうち１種以上であることを特徴とする請求項１３に記載のラクトバチルスサリバリウスＣＪＬＳ１５１１（ＫＣＣＭ １１８２９Ｐ）死菌体の製造方法。
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