CN103648511B - 喷雾干燥的乳杆菌属菌株/细胞及其对抗幽门螺杆菌的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及喷雾干燥的乳杆菌属菌株和/或乳杆菌细胞（乳酸菌）及其用途，特别是用于治疗和预防人和动物中的幽门螺杆菌感染的药物和/或饮食组合物。

Description

喷雾干燥的乳杆菌属菌株/细胞及其对抗幽门螺杆菌的用途
本发明涉及喷雾干燥的乳杆菌属菌株和/或乳杆菌细胞（乳酸菌）及其用途，特别是用于治疗和预防人和动物中的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染的药物和/或饮食组合物，包括药物或饮食补充剂。
益生菌微生物（probiotic microorganisms）包括在人和动物体内表现出有利功效的细胞。益生菌组合物包含此类微生物。有利功效可以特别是在于消化道菌群的改善。特别是可以，通过益生菌微生物和不期望的微生物之间的直接相互作用，通过益生菌微生物的表达产物对不期望的微生物的代谢的抑制所引起的间接相互作用，或通过强化天然免疫系统，抑制菌群中的不期望的其他微生物。通常认为一种主要机制胃肠道的竞争性移生是基本作用要素，由此不期望的微生物可不再以干扰的程度移生于粘膜（粘膜层）中或被排斥。
例如，一组益生菌微生物由乳杆菌属菌株形成。在此典型地是革兰氏阳性的、微需氧的或厌氧的细菌，其发酵糖，形成酸，特别是乳酸。
由US5,716,615已知尤其包含乳杆菌的药物组合物。这种组合物尤其可用于治疗胃肠道病症。
由WO2004/087891已知乳杆菌属菌株，其适合于制备用于治疗胃肠道的幽门螺杆菌感染的药物或饮食组合物。
乳杆菌与幽门螺杆菌的相互作用尤其描述于Wang等人，Am.J.Clin.Nutr.80:737-41(2004),Felley等人，Best Practice&Research Clinical Gastroenterology17(5):785-791(2003),Cazzato等人，Scandinavian Journal of Nutrition48(1):26-31(2004)和Sgouras等人，Applied and Environmental Microbiology70(1):518-526(2004)中。
幽门螺杆菌是移生于胃的螺旋形细菌，其中尿素酶的产生提高胃中的pH值，并以这种方式针对胃酸保护该细菌。该细菌穿透粘膜并沉积在上皮细胞上。这种感染激活机体的自身免疫系统，然而免疫应答不足以有效消除该感染，结果是导致免疫应答的增强，导致慢性炎症和疾病，诸如胃炎或胃溃疡，和最终的癌症。
当细胞彼此粘结并形成聚集体时，此过程被称为聚集。当仅一种细胞类型参与此聚集体形成时，这被称为自身聚集或自我聚集。如果至少两种不同的细胞类型参与此聚集体形成时，此过程被称为共聚集。申请人的WO2007/073709描述了乳杆菌与幽门螺杆菌的共聚集体，其可以被利用用于幽门螺杆菌感染的预防、治疗和/或根除疗法；特别是至少实现幽门螺杆菌的减少。此外，适于此目的的乳杆菌属菌株描述在WO2007/073709中，它们已经提交在德国的德意志微生物和细胞培养保藏中心（Deutschen Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)），Mascheroder Weg1b，D-38124Braunschweig，并具体为：DSM17646、DSM17647、DSM17648、DSM17649、DSM17650、DSM17651、DSM17652和DSM17653。
合适的乳杆菌细胞在与幽门螺杆菌细胞接触时形成共聚集体。共聚集体的形成防止幽门螺杆菌钻入胃粘膜中。幽门螺杆菌细胞，特别是其细胞表面，被乳杆菌细胞掩蔽，使得幽门螺杆菌细胞不再能够结合胃上皮细胞。通过防止幽门螺杆菌与胃上皮细胞的结合避免了炎性反应。被掩蔽的，并且因此失活的幽门螺杆菌细胞以共聚集体的形式通过胃肠道并被排出。因此通过施用合适的乳杆菌细胞有可能减少或根除胃中的幽门螺杆菌细胞。可以预防性地或治疗性地使用乳杆菌细胞。然而，此治疗方式有待改进。
因此，本发明的目的是提供一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的改进方法。特别是这样的方法以允许改善的共聚集体形成，其中通过形成的共聚集体明显更好地抑制/减少幽门螺杆菌的胃粘膜移生。
喷雾干燥的乳杆菌的用途和制备在现有技术中是已知的，例如Gardiner等人，Comparative Survival Rates of Human-Derived Probiotic Lactobacillus paracaseiand L.salivarius Strains during Heat Treatment and Spray Drying,Applied andEnviromental Microbiology66(6):2605-2612(2000)和Teixeira等人，Survival ofLactobacillus delbruechii ssp.Bulgaricus Following Spray-Drying,J.DairySci78:1025-1031(1995)和Tos等人,Spray Drying,Freeze Drying,or Freezing ofthree different lactic acid bacteria species,Journal of Food Sci.,Wiley-Blackwell Publ.,Inc.(US)。
然而，没有记载喷雾干燥的乳杆菌用于与幽门螺杆菌形成共聚集体的用途以及其药物或饮食组合物形式的特殊适合性。
令人惊讶的是，当喷雾干燥的乳杆菌细胞用于共聚集时可以实现对幽门螺杆菌感染的改善的干预和预防。
特别有利的是喷雾干燥的乳杆菌细胞可以与幽门螺杆菌形成大的共聚集体，并且以此方式，起到有效减小幽门螺杆菌的细菌负荷。乳杆菌细胞的喷雾干燥特别有利地导致乳杆菌细胞的变小，由此额外导致细胞的分开/分隔。与其他干燥方法或不采用干燥进行的方法相反，没有获得2至10个乳杆菌细胞的链（图2A），但获得了－喷雾干燥表征的－单个细胞（单体）或两个细胞（二聚体）（图2B）。这种喷雾干燥的“生殖细胞”非常适合于在胃介质中施用后原位形成共聚集体，并且获得有利的、高度致密的、紧凑的和有效的由乳杆菌细胞与幽门螺杆菌（细胞）构成的共聚集体，在共聚集体的形成阶段中另外地具有有利的小空间位阻。这种根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞具有与幽门螺杆菌较高的结合亲和力，例如，可以根据WO2007/073709中的技术教导制备的那些细胞。通过较高的结合亲和力更多的幽门螺杆菌细胞可以被更少的乳杆菌细胞掩蔽和结合。较高的结合亲和力进一步导致形成的共聚集体的更高稳定性。
进一步有利的是喷雾干燥的乳杆菌细胞同样包括提高比例的无活力乳杆菌细胞和/或乳杆菌细胞片段，它们同样支持共聚集体的自发形成。无活力乳杆菌细胞和/或乳杆菌细胞片段的比例可以多于80%,多于90%，甚至100%。
根据本发明的共聚集体以自然的途经通过胃肠道并且离开身体。即使已经发生感染，根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌属菌株的这种作用机制也是有帮助的，因为防止了额外的幽门螺杆菌的进一步感染，并且现有的感染可以通过存在的幽门螺杆菌细菌的失活/排出而更容易地对抗。对此，根据本发明的乳杆菌属菌株可能也能够抑制幽门螺杆菌的尿素酶活性，使得共聚集体中的幽门螺杆菌细菌丧失其对胃酸攻击的保护作用。就此而言，还实现了协同功效。
喷雾干燥的乳杆菌属菌株或乳杆菌细胞具有特殊的优势：增加了对幽门螺杆菌的结合亲和力（见前）。由于幽门螺杆菌的表面被乳杆菌细胞掩蔽，阻止了幽门螺杆菌细胞穿透进入粘膜，并因此不能发生幽门螺杆菌感染，包括慢性炎症过程，并且确保防止了继发性疾病诸如胃炎、胃溃疡或癌性溃疡乃至胃癌。
此外，根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞与幽门螺杆菌细胞的共聚集体表现出增加的稳定性，使得首先增加数目的幽门螺杆菌可以被结合至这些共聚集体中，且其次不会由于例如胃的运动发生之前结合的幽门螺杆菌细胞的重新释放。这种优势允许与现有技术中已知的共聚集体相比有利的更低剂量。根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞进一步允许有利的增加的水溶解度，使得可以在胃腔内实现喷雾干燥的乳杆菌细胞以及获得的共聚集体的改善的分布。
本发明人还发现对乳杆菌细胞的喷雾干燥防止乳杆菌本身的不受控制的聚集体形成（自身聚集），或至少其与新鲜未喷雾干燥的乳杆菌相比大幅度减少。乳杆菌彼此的自身聚集占据了用于掩蔽幽门螺杆菌的结合位。减少或防止自身聚集由此同样导致与现有技术相比使用有利的更低剂量的乳杆菌。
根据本发明的喷雾法导致乳杆菌的形态学变化，使得对幽门螺杆菌的结合亲和力增加，并且由此可以导致共聚集体形成的改善。
本发明由此涉及包含喷雾干燥的乳杆菌细胞的药物或饮食组合物，该组合物用于人和动物，特别是哺乳动物中的幽门螺杆菌感染的预防和治疗。
在本发明的进一步实施方案中，喷雾干燥的乳杆菌细胞优选地和基本上以单体和/或二聚体形式存在于所述组合物中（见前，图2B）。
本发明由此进一步涉及根据本发明的这样的组合物，其中a.）乳杆菌细胞被喷雾干燥，和b.）获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中（生理学上相容的载体的示例性实施方案在下面描述）。
本发明进一步涉及这样的组合物，其中，在人或动物中施用后，与幽门螺杆菌的共聚集体在胃介质中原位形成，其优选大于，并且不小于50μm，特别是大于和不小于100μm、150μm，特别是大于500μm，特别优选地大于1,000μm或1,100μm。
在本发明的含义内，术语“乳杆菌细胞”（在广义上，乳酸菌，也称为乳杆菌）包括需要碳水化合物，特别是葡萄糖和乳糖，用于乳酸发酵，并且主要采用恩布登-迈耶霍夫（Embden-Meyerhof）生物合成途径的那些微生物。就分类学而言，乳杆菌细胞属于乳杆菌科。它们是革兰氏阳性的、不形成孢子的和通常是不能游动的。乳杆菌细胞厌氧地生存，但却是耐氧的，尽管它们不含有任何氯化血红素（细胞色素，过氧化氢酶）（Schleifer等人，System.Appl.Microb.:18,461-467（1995）或Ludwiq等人，System.Appl.Microb.15:487-501（1992））。乳杆菌细胞或物种可以基于碳水化合物利用模式，特别是借助API测试（biomerieux公司）来确定。根据本发明特别是包括适合于同型发酵的乳酸发酵或异型发酵的乳酸发酵的那些物种。进一步优选的是选自下列的那些乳杆菌细胞：乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（所有均是同型发酵的）、进一步短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳杆菌（Lactobacillusbuchneri）、食果糖乳杆菌（Lactobacillus fructivorans）、希氏乳杆菌（Lactobacillushilgardii）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）、绿色乳杆菌（Lactobacillus viridescens）和两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）（所有都是异型发酵的）。来自本申请人的示例性的合适的乳杆菌细胞是被保藏的：DSM17646、DSM17647、'DSM17648、DSM17649、DSM17650、DSM17651、DSM17652和DSM17653（见前）。根据本发明优选发酵乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、布氏乳杆菌和戊糖乳杆菌。
根据本发明所涵盖的，同样有这样的“乳杆菌细胞”包括其“衍生物”或“类似物”或“突变体”，它们是失活的、有活力的或无活力的，或表示乳杆菌细胞的部分和片段，例如，酶促或机械分解产物（例如弗氏细胞压碎器（French Press）等），其程度为这些适合于共聚集。
所述术语和“衍生物”、“类似物”、“突变体”或“失活的”还包括有细胞或发酵上清液、溶胞产物、“乳杆菌细胞”的级分或提取物，其中这些细胞或发酵上清液、溶胞产物、级分或提取物优选地具有根据本发明的乳杆菌细胞/菌株/微生物的性质。在此，“溶胞产物”－以及术语“提取物”－特别地是指本发明的微生物细胞的处于水性介质中的溶液或悬浮液，并且包括例如大分子诸如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物及其类似物，以及特别是还包括细胞碎片。溶胞产物优选地还包括细胞壁或细胞壁成分。制备溶胞产物的方法对于本领域技术人员是充分公知的，并且包括，例如，使用“弗氏细胞压碎器”或酶促裂解，具有玻璃珠或铁球的球磨机。细胞可以通过酶促、物理或还有化学方式破坏。酶促法细胞裂解的实例可以是单一酶以及酶混合物，诸如蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶、葡萄糖苷酶；化学裂解可以通过离子载体、去污剂诸如SDS、酸或碱起作用；物理方法可以通过高压诸如弗氏细胞压碎器、渗透性、温度、或热冷交替起作用。此外，当然可以组合化学、物理和酶促方法。
根据本发明的乳杆菌细胞/菌株/微生物的“衍生物”或“类似物”或“突变体”或“失活”优选地具有与所述及的菌株的相同性质。在此，在“灭活（形式）”或“衍生物”或“类似物”的情形下，优选不再具有代谢活性。
根据本发明的乳杆菌细胞/菌株/微生物的“类似物”表示溶胞产物或片段的形式。根据本发明的乳杆菌细胞/菌株/微生物的“片段”表示细胞的一部分，例如，细胞膜，大分子诸如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物及其类似物，以及细胞碎片。本领域技术人员能够将适宜的意义理解术语“类似物”、“片段”、“衍生物”或“突变体”并且在本发明的含义内解释这些术语。为了提供优选的乳杆菌细胞/菌株/微生物的突变体、衍生物、片段或类似物，本领域技术人员可以采用可获得的并且公开了可以用于制备突变体、衍生物、片段或类似物的技术的标准文献。
突变体或基因转变的变体或衍生物被基因转变，例如通过重组DNA技术（重组核酸的克隆、测序、转化），以及通过物理诱变，例如通过紫外线辐射，也可以通过化学试剂，诸如甲磺酸乙酯（EMS）。在此，可以选择阳性性质的转变－或者靶向或者通过多个突变体的评价。基因转变的突变体包括根据本发明的微生物细胞并且在其细菌染色体和/或其质粒中容纳重组核酸。借助于点突变的转变可以另外地导致对表达/转录/翻译的作用，如在不进行直接基因操作的条件下自发突变那样（例如，参见J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,Cold Molecular cloning:a laboratory manual/Spring HarborLaboratory Press,3rd edition（2001））。
所有这些微生物在上文和下文均称为“乳杆菌细胞”。
人胃管道的基本培养条件包括1.8-4.5范围内的pH值，以及胃蛋白酶和NaCl的存在。以这样的培养条件为特征的参考培养基包括下列的组分：水、5g/l NaCl和3g/l胃蛋白酶，其中用盐酸将pH值调整为2.0或4.0以便模拟空腹或饱胃。
在本发明的含义内术语“共聚集”是指在悬浮液中（例如，根据下面的实施例，特别是在如上所述的参考培养基中）形成含有根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞与幽门螺杆菌细胞的大小为至少50μm或100μm以及以上的细胞聚集体。
在本发明的含义内术语“喷雾干燥的乳杆菌细胞”是指使用喷雾干燥法或雾化法（同义）干燥乳杆菌细胞，其中例如将乳杆菌细胞的悬浮液分散成细雾状的小滴，并且可以获得粉末。
在根据本发明的喷雾干燥过程中，含有乳杆菌细胞的溶液或悬浮液被喷雾到热干燥介质中，从而将其干燥。待喷雾的混合物可以以溶液、乳液、悬浮液或分散液的形式存在。借助于喷嘴或喷雾轮（Sprührad）其被雾化成数百万个单个小滴，大幅度地增加了表面。溶剂诸如水通过热空气被立即蒸发和排出。进一步，乳杆菌细胞被单独喷雾干燥。
喷雾干燥或雾化法可以与其他干燥方法相区分，因为需要使用喷嘴或类似作用的装置，诸如单物质喷嘴、空心锥喷嘴、压力喷嘴、双物质喷嘴外部混合、气动雾化喷嘴、双物质喷嘴内部混合、雾化盘或超声雾化器。
喷雾干燥法描述于现有技术中并为本领域技术人员所熟悉（参见Gardiner等人，Teixeira等人（见前）或EP74050和EP285682）。装置是相应已知的且被描述的，诸如公司Büchi Labortechnik AG（德国）的微型喷雾干燥机B-191或B-290或公司GEA Niro（丹麦）的SD-6.3-R。还已知可以使用任意的佐剂和添加剂。
本发明进一步涉及包含生理学有效剂量的根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞以及生理学上相容的载体的药物和/或饮食组合物。药物组合物涉及仅用作治疗性或预防性目的的组合物，其中，除了乳杆菌细胞以外，仅存在盖伦制剂中普遍的佐剂和/或赋形剂。在本发明含义内的饮食组合物涉及除了根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞以外，包含食物或食品（参见，例如非穷举的EU-Richtlinie2002/46/EG，2002年6月10日）和/或宠物和/或家畜的饲料和/或饮食补充剂的组合物，任选地包含佐剂和添加剂。
本发明还涉及根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞用于制备药物或饮食组合物的用途或应用，或者药物或饮食补充剂所包含的喷雾干燥的乳杆菌细胞或者药物或饮食组合物，特别是用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌感染引起的疾病，例如胃肠病症。对此特别是包括胃炎、胃溃疡、癌性溃疡和胃癌。还涵盖那些疾病和症状诸如腹部不适，特别是上腹部不适、胃胀、胃痉挛、胃痛、上腹部疼痛或胀痛、上腹部烧灼感、慢性复发性腹部疾病、持久饱胀感、食欲不振、空腹痛、胃气胀、胃烧灼、腹泻、大便不正常、不适（Unwohlsein）、反胃、恶心和呕吐、食物耐受不良、吸收不良（Malabsorption）、胃部不适（Reizmagen）（功能性消化不良）、胃粘膜炎、粘膜损伤、或胃十二指肠溃疡。
本发明进一步涉及根据本发明的喷雾干燥的乳杆菌细胞的用途或应用，或者药物或饮食补充剂所包含的喷雾干燥的乳杆菌细胞或者药物或饮食组合物，任选地联合另外合适的活性成分诸如抗生素，用于根除幽门螺杆菌或幽门螺杆菌的根除疗法。
根据本发明的药物或饮食组合物，特别是饮食补充剂或药物（药品）可以表征为包含102至1015，优选104或108至1012，尤其108至1010个喷雾干燥的乳杆菌细胞。在此基准量是给药单位，例如片剂。所述组合物优选制备用于口服给药。
根据本发明的药物或饮食组合物，特别是饮食补充剂或药物（药品）的盖伦制剂制备可以以本领域常规方式进行。合适的固体或液体盖伦制剂形式可使用的是例如颗粒剂、粉剂、糖锭剂、片剂、（微）胶囊、硬胶囊、栓剂、糖浆剂、汁液、混悬剂或乳剂，在其制备中采用常规佐剂诸如赋形剂、崩解剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂、GleitTM或润滑剂、遮味剂、甜味剂和增溶剂。应当提及的佐剂是硬脂酸镁、氯化钠、碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖类、滑石、乳蛋白质、明胶、淀粉、纤维素及其衍生物，动物和植物油诸如鱼肝油、向日葵油、花生油或芝麻油，聚乙二醇和溶剂，诸如无菌水，以及一元醇或多元醇，诸如甘油。根据本发明的药物组合物可以通过将规定剂量的根据本发明使用的至少一种乳杆菌属菌株的细胞与药学上合适的和生理学上相容的载体，并任选地与具有规定剂量的另外合适的活性成分、添加剂或佐剂混合，并制备所需的给药形式来制备。考虑作为载体的特别是选自下列的物质：麦芽糊精、微晶纤维素、淀粉，特别是玉米淀粉、左旋糖、乳糖、右旋糖和这些物质的混合物。基于细胞和载体的总量，所述组合物可以包含0.1-95重量%的载体和5-99.9重量%的喷雾干燥的乳杆菌细胞或由0.1-95重量%的载体和5-99.9重量%的喷雾干燥的乳杆菌细胞组成。
在饮食组合物和/或饮食补充剂的情况下，可以提供这样的组合物，其包含102至1015、优选104至1012和更优选地108至1010个乳杆菌细胞。基准量是给药单位，例如，用于销售给最终消费者的食品包装单元。生理学上相容的载体通常将是食品，其特别是选自乳制品、发酵乳制品、奶、酸奶、奶酪、谷类食品、麦棒、烘烤食品、饮料和婴儿食品制剂。根据本发明的合适的食物或食品，其包括水，非穷举地例如在2002年1月28日的第178/2002号规章（EG）中所限定的那些。
本发明进一步涉及制备根据本发明的药物和/或饮食组合物，特别是饮食补充剂或药物（药品）的方法，其中将喷雾干燥的乳杆菌细胞与生理学上相容的载体混合，并且优选地制备用于口服给药。
此外本发明涉及制备根据本发明的组合物的方法，其中乳杆菌细胞是（i）任选地被接种和富集，（ii）发酵，和（iii）喷雾干燥，并且随后与生理学上相容的载体混合，和优选地制备用于口服给药。
最后，本发明涉及用于预防或治疗患有或处于患有由幽门螺杆菌感染引起的病症，特别是胃炎或胃溃疡的风险中的人或动物，特别是患者或测试受试者的方法，其中向此人给药生理学有效剂量的根据本发明的药物和/或饮食组合物每天一次至5次。给药可以在有限的时间段内，例如，1至30周内进行，或没有时间限制地进行。特别是后者适于持久预防和用于防止复发。
下面基于实施例更详细地描述本发明，所述实施例仅代表实施方案，不意在将本发明限制于这些实施例。
实施例和附图:
实施例1：使用的菌株的保存
乳杆菌属菌株以冷冻状态保存。在MRS培养基（55g/l,pH6.5;Difco,USA）中培养至静止期（OD600/ml4-8）的1ml培养物与500μl50%（v/v）无菌甘油溶液混合，并将该混合物在-80℃冷冻。
幽门螺杆菌以冷冻状态保存。在补充了10%（v/v）胎牛血清（Biochrom）的布氏肉汤（28g/l,pH7.0;BD,USA）中培养至静止期的1ml培养物与500μl50%（v/v）无菌甘油溶液混合，并将该混合物在-80℃冷冻。
实施例2：制备喷雾干燥的乳杆菌细胞的方法
如下所述制备能够与幽门螺杆菌在人消化道（特别是胃）的培养条件下共聚集的喷雾干燥的乳杆菌：
在15ml反应容器中在10ml MRS培养基中进行预培养1。用新鲜培养的、深冻的、冻干的或喷雾干燥的乳杆菌属菌株细胞接种于培养基。将此预培养物1在37℃在厌氧条件下温育24小时。将整个预培养物1用于接种预培养物2。预培养物2由240ml MRS培养基与10ml预培养物1构成。预培养物2在37℃在厌氧条件下温育19小时。在每一个预培养结束时，测定光密度、pH值和cfu。
5升MRS用于乳杆菌的发酵。发酵罐，包括所有必要的部件，被高压灭菌。所需的温度和搅拌器速度值分别为37℃和150转/分钟。接种浓度为5%。在发酵过程结束时，测定细胞计数、集落形成单位、pH、在600nm的光密度以及葡萄糖和乳酸盐的浓度。之后，将发酵肉汤浓缩10倍至20倍。此后，冷冻浓缩物。
在干燥前，将20倍浓缩物复温并以4300xg离心15分钟。然后将细胞用0.9%NaCl溶液洗涤一次并再次以4300xg离心15分钟。之后，将细胞重悬于500ml10%NaCl溶液。
在Büchi微型喷雾干燥机B-191中进行喷雾干燥过程。入口温度为140℃。出口温度为86℃。热空气流动为550L/h。吸气器功率为75%，抽气速率为5%。使用上述参数干燥细胞悬浮液，并且之后移除喷雾干燥的乳杆菌粉末。
测定每克喷雾干燥粉末的乳杆菌属菌株的总细胞计数以及有活力细胞计数。喷雾干燥粉末的显微镜检查（图2B）显示乳杆菌细胞小于未喷雾干燥的乳杆菌细胞（图2A），并且喷雾干燥的乳杆菌细胞以单体和二聚体形式存在，而未喷雾干燥的乳杆菌细胞具有较长的链。喷雾干燥的乳杆菌细胞在4℃保存直至进一步使用。
实施例3：比较在胃条件下未喷雾干燥的和喷雾干燥的乳杆菌属菌株或乳杆菌细胞与幽门螺杆菌的共聚集
乳杆菌细胞在密闭的15ml试管中在MRS培养基中在37℃培养24小时。用于检测喷雾干燥的乳杆菌将喷雾干燥的粉末以10mg/ml的浓度重新悬浮于PBS中。幽门螺杆菌在锥形烧瓶中在微需氧条件下在含有10%胎牛血清（Biochrom）的布氏肉汤（28g/l,pH7.0;BD,USA）中在37℃培养大约2天。培养后，幽门螺杆菌的细胞形态学通过显微镜检查分析。使用具有S形形态学的细胞或使用具有球形形态学的细胞进行测定。也检测具有混合形态学的培养物。
各个细胞通过在3200g离心10分钟收获，并弃去上清液。乳杆菌细胞在5ml缓冲液中洗涤一次并重悬于5ml PBS缓冲液（含有1.5g/l Na2HPO4*2H2O、0.2g/l KH2PO4和8.8g/lNaCl的PBS缓冲液）中。幽门螺杆菌细胞在5ml PBS缓冲液中洗涤一次并重悬于5ml人工胃液（含有5g/l NaCl和3g/l胃蛋白酶（Sigma））。对各种细胞测量OD600值，并分别添加人工胃液和PBS缓冲液将幽门螺杆菌的值调整至2，并将乳杆菌的值调整至4。
将2.5ml由此获得的每种细胞悬浮液（幽门螺杆菌/乳杆菌）混合，并将混合物振摇10秒至10分钟。由于含有幽门螺杆菌和乳杆菌的样品中明显的絮凝使得结果是光学可见的，并且也通过显微镜镜检分析。
图1A示出包含幽门螺杆菌和未喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞的共聚集体的显微镜图像。图1B示出包含幽门螺杆菌和喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞的共聚集体的显微镜图像。这些共聚集体比包含未喷雾干燥的乳杆菌细胞的共聚集体明显较大。通过分开地分析单独包含乳杆菌和幽门螺杆菌的各个培养物进行关于自我聚集的对照试验。在图1C、1D和1E中共聚集和自身聚集均不明显。图1C示出新鲜培养的乳杆菌属DSM17648细胞在人工胃条件下的显微镜图像。图1D示出喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞在人工胃条件下的显微镜图像。图1E示出新鲜培养的幽门螺杆菌细胞在人工胃条件下的显微镜图像。
实施例4：测试喷雾干燥的乳杆菌细胞和幽门螺杆菌细胞之间的共聚集体的稳定性
进行如实施例3中的实验以测试共聚集体在体内条件下的稳定性。将在振摇5分钟后形成的乳杆菌细胞和幽门螺杆菌细胞之间的共聚集体通过吹吸悬浮液1分钟或通过高速振摇2分钟暴露于强剪切力。之后，通过显微镜镜检和肉眼分析共聚集体尺寸。喷雾干燥的乳杆菌细胞与幽门螺杆菌的共聚集体的尺寸未减小，然而，未喷雾干燥的乳杆菌细胞与幽门螺杆菌的共聚集体的尺寸减小。
实施例5：根据本发明的包含乳杆菌属菌株的药物组合物的制备
本发明的乳杆菌属菌株或多个乳杆菌属菌株的细胞根据实施例1和2进行制备并喷雾干燥。然后将喷雾干燥的粉末研磨成最大约1mm直径的粒度。获得的颗粒与赋形剂和/或佐剂使用下面的比例（重量%）混合：20%颗粒、2%二氧化硅（Syloid AL-IFP,GRACEDavidson）、1%硬脂酸镁（MF-2-V,Ackros）、77%微晶纤维素（Avicel PH112,FMC）。
在Quintech微型混合机中在位置70水平II处进行混合。同时添加所有组分。进行混合大约120秒。此后，使用市售的压片机在常规条件下压制获得的混合物，然而尽可能使用低压紧力（<10kN）以形成重量为大约500mg的片剂。每个片剂含有大约108至1010个喷雾干燥的乳杆菌细胞。
实施例6：使用不同的乳杆菌细胞计数比较未喷雾干燥的和喷雾干燥的乳杆菌属菌株或乳杆菌细胞与幽门螺杆菌的共聚集
将乳杆菌细胞在密闭的15ml试管中在MRS培养基中在37℃培养24小时。用于检测喷雾干燥的乳杆菌细胞将喷雾干燥的粉末以10mg/ml的浓度重新悬浮于PBS中。幽门螺杆菌在锥形烧瓶中在微需氧条件下在含有10%胎牛血清（Biochrom）的布氏肉汤（28g/l,pH7.0;BD,USA）中在37℃培养大约2天。培养后，幽门螺杆菌的细胞形态学通过显微镜检查分析。使用具有S形形态学的细胞或使用具有球形形态学的细胞进行测定。也检测具有混合形态学的培养物。
各细胞通过在3,200g离心10分钟收获，并弃去上清液。乳杆菌细胞在5ml缓冲液中洗涤一次并重悬于5ml PBS缓冲液（含有1.5g/lNa2HPO4*2H2O、0.2g/l KH2PO4和8.8g/l NaCl的PBS缓冲液）中。幽门螺杆菌细胞在5ml PBS缓冲液中洗涤一次并重悬于5ml人工胃液（含有5g/l NaCl和3g/l胃蛋白酶（Sigma））。对各细胞测量OD600值，并分别添加人工胃液和PBS缓冲液将幽门螺杆菌的值调整至2，并将乳杆菌的值调整至4。
对于乳杆菌悬浮液通过托马计数池进行细胞计数测定，并且制备稀释液以便获得具有不同的规定细胞计数的悬浮液。将2.5ml由此获得的每种细胞悬浮液（幽门螺杆菌/乳杆菌）混合，并将混合物振摇5分钟。2分钟的停留时间后，由于含有幽门螺杆菌和乳杆菌的样品中明显的絮凝使得结果是光学可见的，并且也是显微镜下可见的（照片未显示）。从无共聚集体相（上清液；沉降物共聚集体）中吸取1ml以便定量共聚集并测定OD600。使用公式
测定共聚集度（%）。图3和4示出新鲜培养的和喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞相对于幽门螺杆菌的共聚集度。0%表示在不添加乳杆菌细胞（没有共聚集或没有由于共聚集的沉降）的情况下幽门螺杆菌（上清液中）的OD600。100%共聚集度表示最大的共聚集度，也就是说，OD600为0，或使用的培养基无细胞时的OD600（由于共聚集所有幽门螺杆菌细胞沉降，并且通过OD测量在上清液中检测不到幽门螺杆菌细胞）。
在相同的细胞计数下，喷雾干燥的乳杆菌细胞的与幽门螺杆菌的共聚集度比新鲜培养的细胞大两倍（图3和4）。
附图说明
图1A示出在模拟胃条件下新鲜培养的、未喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞与幽门螺杆菌的共聚集体（共聚集体的尺寸为40μm以上）。
图1B示出在模拟胃条件下喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞与幽门螺杆菌的非常大的共聚集体（共聚集体的尺寸为150μm以上）。
图1C至1E作为实验中的对照。
图1C示出在模拟胃条件下新鲜培养的乳杆菌属DSM17648细胞。检测不到自身聚集。
图1D示出在模拟胃条件下喷雾干燥的乳杆菌属DSM17648细胞。没有检测到自身聚集。
图1E示出在模拟胃条件下新鲜培养的幽门螺杆菌细胞。没有检测到自身聚集。
（图1A-E为1000倍放大）
图2A和2B示出乳杆菌细胞的形态学。
图2A示出未喷雾干燥的乳杆菌细胞。细胞以2-10个细胞的链存在。
图2B示出喷雾干燥的乳杆菌细胞。细胞以单体和二聚体形式（1-2个细胞）存在并且明显小于未喷雾干燥的细胞。
图3：比较乳杆菌属DSM17648的新鲜培养的和喷雾干燥的细胞相对于幽门螺杆菌的共聚集度。在每种情况下，在测试中使用1.4x108个乳杆菌细胞。在相同的细胞计数下，喷雾干燥的乳杆菌细胞的与幽门螺杆菌的共聚集活性程度比新鲜培养的细胞大两倍。0%表示在不添加乳杆菌细胞（没有共聚集或没有由于共聚集的沉降）的条件下幽门螺杆菌（上清液中）的OD600。100%共聚集度表示最大的共聚集度，也就是说，OD600为0，或使用的培养基无细胞时的OD600（由于共聚集所有幽门螺杆菌细胞沉降，并且通过OD测量在上清液中检测不到幽门螺杆菌细胞）。
图4：比较乳杆菌属DSM17648的新鲜培养的和喷雾干燥的细胞相对于幽门螺杆菌的共聚集度。在每种情况下，在测试中使用不同量的乳杆菌细胞。喷雾干燥的乳杆菌细胞的与幽门螺杆菌的共聚集活性程度为新鲜培养的细胞的两倍。0%表示在不添加乳杆菌细胞（没有共聚集或没有由于共聚集的沉降）的条件下幽门螺杆菌（上清液中）的OD600。100%共聚集度表示最大的共聚集度，也就是说，OD600为0，或使用的培养基无细胞时的OD600（由于共聚集所有幽门螺杆菌细胞沉降，并且通过OD测量在上清液中检测不到幽门螺杆菌细胞）。

Claims (20)

1.一种用于治疗和预防人或动物中的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染的组合物，其包含喷雾干燥的乳杆菌细胞，所述乳杆菌细胞选自布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，其中a.)乳杆菌细胞被喷雾干燥和b.)获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含喷雾干燥的乳杆菌细胞，其特征在于，所述喷雾干燥的乳杆菌细胞以单体和/或二聚体形式存在。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中在胃介质中施用后与幽门螺杆菌原位形成共聚集体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述共聚集体不小于50μm。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述共聚集体大于500μm。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳杆菌细胞选自DSM 17646、DSM 17647、DSM17648、DSM 17649、DSM 17650、DSM 17651、DSM 17652、DSM 17653。
7.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物呈药物或饮食组合物的形式，任选地包含佐剂和添加剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物呈食物或食品和/或用于宠物和/或家畜的饲料和/或饮食补充剂的形式。
9.一种用于人或动物中的幽门螺杆菌感染的药物，其包含喷雾干燥的乳杆菌细胞或根据权利要求1-8任一项所述的组合物，所述乳杆菌细胞选自布氏乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌，其中a.)乳杆菌细胞被喷雾干燥和b.)获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中。
10.根据权利要求9的药物，其中所述乳杆菌细胞选自DSM 17646、DSM 17647、DSM17648、DSM 17649、DSM 17650、DSM 17651、DSM 17652、DSM 17653。
11.一种用于人或动物中的幽门螺杆菌感染的饮食补充剂，其包含喷雾干燥的乳杆菌细胞或根据权利要求1-8任一项所述的组合物，所述乳杆菌细胞选自布氏乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌，其中a.)乳杆菌细胞被喷雾干燥和b.)获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中。
12.根据权利要求11的饮食补充剂，其中所述乳杆菌细胞选自DSM 17646、DSM 17647、DSM 17648、DSM 17649、DSM 17650、DSM 17651、DSM 17652、DSM 17653。
13.一种制备根据权利要求1所述的组合物或根据权利要求9所述的药物或11所述饮食补充剂的方法，其中所述乳杆菌细胞首先(i)任选地被接种和富集，(ii)发酵，和(iii)喷雾干燥，并且将获得的所述乳杆菌细胞与生理学上相容的载体混合。
14.喷雾干燥的乳杆菌细胞用于制备饮食组合物的用途，所述乳杆菌细胞选自布氏乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌，其中a.)乳杆菌细胞被喷雾干燥和b.)获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中。
15.根据权利要求14的用途，其中所述乳杆菌细胞选自DSM 17646、DSM 17647、DSM17648、DSM 17649、DSM 17650、DSM 17651、DSM 17652、DSM 17653。
16.喷雾干燥的乳杆菌细胞用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌感染所引起的病症，所述乳杆菌细胞选自布氏乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌，其中a.)乳杆菌细胞被喷雾干燥和b.)获得的喷雾干燥的乳杆菌细胞被引入至生理学上相容的载体中。
17.根据权利要求16的用途，其中所述乳杆菌细胞选自DSM 17646、DSM 17647、DSM17648、DSM 17649、DSM 17650、DSM 17651、DSM 17652、DSM 17653。
18.根据权利要求16或17的用途，所述病症是胃肠病症。
19.根据权利要求16或17的用途，所述病症是胃炎、胃溃疡、癌性溃疡和胃癌、胃胀、胃痉挛、胃痛、上腹部疼痛或胀痛、上腹部烧灼感、慢性复发性腹部疾病、持久饱胀感、食欲不振、空腹痛、胃气胀、胃烧灼、腹泻、大便不正常、反胃、恶心和呕吐、食物耐受不良、吸收不良、功能性消化不良、胃粘膜炎、粘膜损伤或胃十二指肠溃疡。
20.根据权利要求16的用途，其中喷雾干燥的乳杆菌细胞任选地与抗生素联合，所述药物组合物用于幽门螺杆菌的根除疗法。
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