MX2014006556A - Lactobacillus brevis productor de reuterina. - Google Patents

Lactobacillus brevis productor de reuterina.

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Abstract

La presente invención se refiere a cepas productores de reuterina de Lactobacillus brevis. Estas cepas son útiles, en particular, para el tratamiento o la prevención de las afecciones provenientes de la infección con Helicobacter pylori.

Description

LA C TOBA CILL US BREVIS PRODUCTOR DE REUTERINA Campo de la invención La presente invención se refiere a cepas productoras de reuterina de Lactobacillus brevis {L. brevis) y a sus usos, en especial para el tratamiento o la prevención de la infección con Helicobacter pylori (H. pylori) y de las afecciones resultantes de eso.
Antecedentes de la invención La reuterina (3-hidroxipropionaldehído, 3-HPA) es un compuesto antimicrobiano al que inicialmente se identificó como producido por muchas cepas de Lactobacillus reuteri (L. reuteri), cuando se las cultivaba en condiciones anaerobias en presencia de glicerol (TALARICO y DOBROGOSZ, Antimicrob Agents Chemother, 33, 674-9, 1989). A la conversión de glicerol a reuterina la cataliza una deshidratasa de glicerol dependiente de la cobalamina (Gld; EC 4.2.1.30), que está compuesta por tres subunidades (C, D y E, o a, ß y y respectivamente). La existencia de la secuencia de la deshidratasa de glicerol (GDA) también se informó en otras especies de lactobacilos, además de en Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis, y Lactobacillus hilgardii. Para todas las especies, la existencia de esta secuencia parece variar de una cepa a otra, en función de la presencia de un gen que codifica la deshidratasa de glicerol o diol deshidratasa (CADIEUX y col., Appl Environ Microbio., 74, 4645-9, 2008; SAUVAGEOT y col., FEMS Microbiology Letters, 209, 69-74, 2002; CLAISSE y LONVAUD-FUNEL, Journal of Food Protection, 64, 833-837, 2001). En la mayoría de las bacterias que metabolizan la secuencia de la GDA, por lo normal la reuterina es un intermediario metabólico al que posteriormente se reduce dentro de la célula a 1 ,3-propanodiol, (1,3-PD), que se excreta en el medio extracelular. Solamente algunas de las cepas que poseen una deshidratasa de glicerol o de diol tienen la capacidad de acumular reuterina en el medio de cultivo. La mayor parte de estas cepas que acumulan reuterina pertenece a la especie L. reuteri. Sin embargo, se ha informado sobre algunas cepas con la capacidad de acumular reuterina en forma extracelular, generalmente en menor grado que L. reuteri: Lactobacillus coryniformis (MARTIN y col., Int J Food Microbio!, 104, 267-77, 2005), Lactobacillus collinoides (GARAI-I BABE y col., International Journal of Food Microbiology 121, 253-261, 2008; SAUVAGEOT y col., International Journal of Food Microbiology, 55, 167-170. 2000), y Lactobacillus hilgardii (PASTERIS y STRASSER DE SAAD, J. Agrie. Food Chem., 57 (9), 3853-3858, 2009). Más recientemente se describió (BAUER y col., International Journal of Food Microbiology, 137, 28-31, 2010) una cepa de Lactobacillus brevis y una cepa de Lactobacillus pentosus con la capacidad de acumular reuterina extracelularmente (en concentraciones diez veces inferiores, empero, que las de L. reuteri).
La reuterina tiene un amplio espectro de actividad antimicrobiana sobre microorganismos potencialmente dañinos. La reuterina puede inhibir el crecimiento de levaduras, hongos, protozoos y diversas bacterias, en concentraciones de cuatro a cinco veces menores que las necesarias para inhibir el crecimiento de bacterias del ácido láctico. Debido a esta actividad antimcrobiana selectiva de la reuterina, que le permite destruir variedad de microorganismos patógenos al mismo tiempo que no daña las bacterias de ácido láctico beneficiosas de la flora intestinal, se propuso su utilización para el tratamiento de diversos trastornos digestivos.
A varias cepas de L. reuteri se las consideró como probióticos candidatos debido, en particular, a los efectos protectores que estas cepas tienen contra agentes patógenos tales como Salmonella entérica, Escherichia coli, Clostridium difficile, y Helicobacter pylori (CLEUSIX y col., BMC Microbiol, 7, 101, 2007; SPINLER y col., Anaerobe, 14, 166-71, 2008; FRANCAVI LLA y col., Helicobacter, 13, 127-34, 2008; PCT WO 2004/031368). A estos efectos se los relacionó, en parte cuando menos, a la producción de reuterina.
Entre los microorganismos patógenos del tracto digestivo, Helicobacter pylori ha sido centro de interés cada vez mayor en los últimos años. Es una bacteria gram negativa de forma espiralada que coloniza la capa mucosa gástrica de los seres humanos en más del 50% de la población mundial. Si bien la mayor parte de las personas infectadas con H. pylori es asintomática aunque su epitelio gástrico exhiba signos de inflamación, del 15% al 20% de los pacientes infectados con H. pylori desarrollará enfermedades. H. pylori es el principal agente causante de enfermedades de úlcera péptica, gastritis activa crónica, atrofia, metaplasia, displasia, cáncer gástrico y linfoma del tejido linfoide asociado con la mucosa gástrica (MALT) (véase, como reseña (FOX y WANG, J Clin Invest, 117, 60-9, 2007; POLK y PEEK, Nat Rev Cáncer, 10. 403-14)).
El tratamiento clásico de los pacientes infectados con H. pylori es dos antibióticos más un tratamiento con PPI (inhibidores de la bomba de protones), la así llamada terapia triple. Sin embargo, la tasa de erradicación de H. pylori a continuación de una terapia triple está decayendo, debido a la resistencia a los antibióticos o a una falta de cumplimiento estricto del tratamiento. Además, a pesar de varios ensayos, todavía no se dispone en plaza de una vacuna efectiva.
El empleo de probióticos se propuso como alternativas o complementos de la terapia triple, para tratar o prevenir H. pylori. Tal como se indicara arriba, entre estos probióticos figura, en particular, L. reuteri, debido a sus propiedades antimicrobianas. También se propuso algunas cepas de otras especies de lactobacilos como potencialmente útiles para la atención de la infección con H. pylori. Por ejemplo, SIMOVA y cols.(J Appl Microbio!, 106, 692-701, 2009), dan a conocer una cepa de Lactobacillus delbrueckii (BB18) que produce un péptido inhibidor (bacteriocina) e inhibe intensamente a H. pylori. LINSALATA y cols.(Helicobacter, 9, 165-72, 2004), estudiaron los efectos de una cepa particular de L. brevis (CD2) con elevada actividad de arginina deiminasa sobre la supervivencia de H. pylori en la mucosa gástrica humana. Descubrieron una reducción de la carga intragástrica de H. pylori y sugirieron que se podría deber a la elevada actividad de la arginina deiminasa, que la privaría a H. pylori de arginina y le inhibiría el crecimiento y la proliferación.
Los inventores de la presente invención ahora aislaron una cepa de Lactobacillus brevis que tiene la capacidad de producir reuterina y de acumularla en cantidad suficiente como para que tenga actividad antimicrobiana sobre una amplia gama de cepas de H. pylori.
A una cepa con la capacidad de acumular reuterina o cepa acumuladora de reuterina se la define, en esta memoria, como la cepa que tiene la capacidad de producir reuterina y de excretarla extracelularmente.
Breve descripción de la invención Por consiguiente, un objeto de la presente invención es esta cepa de L. brevis que se depositó, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos de Francia], 25 rué du Docteur Roux, París) el 3 de febrero de 2011, con el número de recepción CNCM 1-4431.
Además de su capacidad para producir y acumular reuterina, esta cepa tiene las características siguientes: - Morfología: bacterias en forma de bastón con coloración homogénea, agrupadas en cadenas pequeñas - Metabolismo: heterofermentativo.
- Fermentación de las azúcares siguientes (resultados obtenidos sobre una tira Api 50 CH-medio API MRS a 37°C durante 48 h): L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa, D-glucosa, D-fructosa, D-maltosa, d-melibiosa, gluconato de potasio, 5-cetogluconato de potasio.
La presente invención también abarca cepas de L. brevis acumuladoras de reuterina, derivadas por mutagénesis o por transformación genética, de la cepa CNCM 1-4431, siempre y cuando retengan las propiedades antimicrobianas y la capacidad de producir reuterina de esta cepa madre. Pueden ser cepas en las que uno de los genes endógenos de la CNCM 1-4431, o más de uno, mutó (mutaron), por ejemplo, de manera de modificar algunas de sus propiedades metabólicas (por ejemplo, la capacidad de esta cepa para metabolizar azúcares, su resistencia al tránsito intestinal, su resistencia a la acidez o su postacidificación). También pueden ser cepas que sean resultado de la transformación genética de la CNCM I -4431 con un gen de interés, o más de uno, que le hace(n) posible, por ejemplo, conferir características fisiológicas adicionales a la mencionada cepa o expresar proteínas de interés terapéutico o como vacuna, que es lo que se desea para administrar por medio de la mencionada cepa.
Estas cepas se pueden obtener a partir de la cepa CNCM -4431 por medio de las técnicas convencionales para la mutagénesis aleatoria o la dirigida a sitios, y la transformación genética de lactobacilos, tales como las descritas, por ejemplo, por GURY y cols.(Arch Microbio/., 182, 337-45, 2004) o por VÉLEZ y cols.(Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), o por medio de la técnica conocida como barajado del genoma (PATNAIK y col Nat Biotechnol, 20. 707-12, 2002; WANG Y. y col., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007).
Un objetivo de la presente invención es, también, un método para obtener una cepa acumuladora de reuterina de Lactobacillus brevis, lo que comprende una etapa de mutagénesis o transformación genética de la cepa CNCM 1-4431.
Las cepas de L. brevis que obedecen la presente invención se pueden utilizar para la producción de reuterina. Por consiguiente, otro objetivo de la presente invención es un método para producir reuterina, método que comprende los pasos de: - cultivar una cepa de L. brevis según la presente invención, tal como se la define arriba; de preferencia, la cepa CNCM 1-4431, en presencia de glicerol y - recuperar la reuterina producida por el cultivo.
Un objetivo de la presente invención es, también, una composición que consiste de una cepa de L. brevis de acuerdo con la presente invención; de preferencia, la cepa CNCM 1-4431.
En la composición que obedece a la presente invención, a la mencionada cepa se la puede utilizar en forma de bacterias enteras; de preferencia, de bacterias vivas.
Las composiciones que obedecen a la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para la administración; en particular, la administración oral: esto comprende, por ejemplo, sólidos, semisólidos, líquidos y polvos. Por lo general se prefieren las composiciones líquidas para una administración más fácil, por ejemplo, como bebidas.
La composición puede consistir de, cuando menos, 105 cfu; de preferencia, cuando menos 106 cfu, por gramo de peso seco, de una cepa de L. brevis según la presente invención.
La composición puede consistir, además, de otras cepas de bacterias, en particular cepas probióticas, tales como cepas de LactobacMus, Bifidobacterium, Streptococcus o Lactococcus.
Típicamente, la composición puede consistir de 105 a 1013 unidades formadoras de colonias (cfu); de preferencia, cuando menos de 106 cfu; de mayor preferencia, cuando menos de 107 cfu; aún de mayor preferencia, cuando menos de 108 cfu y de máxima preferencia, cuando menos de 109 cfu, por gramo de peso seco de la composición de la cepa de L. brevis que responde a la presente invención. En el caso de una composición líquida, esto corresponde, por lo general, a 104 a 1012 unidades formadoras de colonias (cfu); de preferencia, cuando menos a 105 cfu; de mayor preferencia, cuando menos a 106 cfu; aún de mayor preferencia, cuando menos a 107 cfu y de máxima preferencia, cuando menos a 109 cfu/ml.
La composición puede ser una composición nutricional, comprendidos productos alimenticios, suplementos alimenticios y alimentos funcionales. Un suplemento alimenticio designa un producto fabricado a partir de compuestos que es usual que se empleen en alimentos, pero que está en forma de tabletas, polvo, cápsulas, pócimas o cualquier otra forma que no es usual que se asocie con alimentos, y que tiene efectos benéficos para la salud de la gente. Un alimento funcional es un alimento que también tiene efectos benéficos para la salud de la gente. En particular, los suplementos alimenticios y los alimentos funcionales pueden tener efecto fisiológico, protector o curativo contra una enfermedad como, por ejemplo, una enfermedad crónica.
La composición nutricional que obedece a la presente invención también comprende un alimento para bebés, una fórmula de leche maternizada o una fórmula para niños de 6 a 12 meses de edad. De preferencia, la presente composición es un producto nutracéutico o farmacéutico, un suplemento nutricional o un alimento médico.
La composición puede ser un producto lácteo, de preferencia un producto lácteo fermentado. El producto fermentado puede estar presente en forma de líquido o presente en forma de polvo seco que se obtiene por secado del líquido fermentado. Entre los ejemplos de productos lácteos figuran la leche fermentada o el suero lácteo fermentado, o ambas cosas a la vez, en forma cuajada, batida o bebible, queso y yogurt.
El producto fermentado también puede ser una verdura, tal como soja, cereales o frutas, o todos ellos a la vez, fermentados en forma cuajada, batida o bebible.
En una modalidad preferente, el producto fermentado es un producto fresco. Un producto fresco que no sufrió etapas rigurosas de tratamiento por calor, tiene la ventaja de que las cepas bacterianas presentes están vivas.
Un objetivo de la presente invención también es una cepa de L. brevis que va acorde con la presente invención; de preferencia, la cepa CNCM 1-4431 o una composición que obedezca a la presente invención para utilizar como medicamento. Las cepas y composiciones de L. brevis que van acorde con la presente invención son de especial utilidad para el tratamiento o la prevención de la infección con H. pylori.
Un objetivo de la presente invención también es la utilización de una cepa de L. brevis que va acorde con la presente invención; de preferencia, la cepa CNCM 1-4431 o una composición que obedezca a la presente invención en carácter de medicamento o para la fabricación de un medicamento, de preferencia un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección con H. pylori.
Un objetivo de la presente invención también es un método para el tratamiento o la prevención de la infección con H. pylori en un paciente que tiene necesidad de ese tratamiento. El método consiste en administrarle a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa de L. brevis que vaya acorde con la presente invención; de preferencia, la cepa CNCM I-4431, o de una composición que obedezca a la presente invención.
La presente invención también comprende un método para la fabricación de un medicamento, de preferencia un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección con H. pylori, el mencionado método consistente en incorporar una cepa de L. brevis tal como se la definiera arriba, de preferencia la cepa CNCM 1-4431, a, cuando menos un, diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los métodos para diagnosticar una infección por H. pylori son conocidos en esta tecnología. A modo de ejemplo, el diagnóstico de infección con H. pylori se puede hacer controlando un examen de anticuerpos en sangre, un examen de antígenos en las heces o el examen de urea con isótopo de carbono en el aliento. También se puede hacer mediante una biopsia bajo endoscopia, seguida por un examen de ureasa, un examen histológico o un cultivo microbiano.
Los síntomas o las enfermedades relacionados con la infección por H. pylori son, en particular, dolor continuo de estómago, ardor de estómago, reflujo ácido, dolor abdominal agudo, regurgitación, vómitos, eructos, flatulencia, náuseas, esofagitis, gastritis tal como gastritis activa crónica, enfermedades de úlcera péptica, atrofia, metaplasia, displasia, cáncer gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado con la mucosa gástrica (MALT).
Breve descripción de la invención La presente invención se comprenderá con mayor claridad a partir de la descripción adicional que viene a continuación, la que se refiere a ejemplos que ilustran las propiedades inmunomoduladoras antimicrobianas y anti-infecciosas de la cepa CNCM 1-4431, así como a partir de las figuras anexas.
La figura 1 muestra los resultados de la reacción PCR de las cepas de Lactobacillus brevis para obtener la secuencia gldC: la banda superior en 728 bp representa el producto que se espera al utilizarse los iniciadores específicos del gen gldC. La banda inferior en 201 bp representa el producto que se espera al utilizarse los iniciadores específicos del gen 16S rRNA (control PCR positivo); Smart: Escalera SMART de ADN (Eurogentec); C + : resultado de PCR obtenido del control de ADN a partir de la cepa positiva para gldC Lactobacillus reuteri ATCC 55730; 1-4431: resultado de PCR obtenido a partir de ADN de la cepa CNCM I-4431 de L. brevis; L. brevis 80: resultado de PCR obtenido a partir de ADN de la L. brevis 80 C-: resultado de PCR obtenido a partir del testigo de ADN proveniente de una cepa negativa para gldC, de Streptococcus thermophilus; H20: resultado de PCR obtenido a partir de agua estéril.
La figura 2 muestra la cuantificación de H. pylori (cepa NTCTC11637) en C. elegans después de la ingestión de H. pylori sola (barra negra), de H. pylori + la cepa 1-4431 de L. brevis I- 4431 cultivada en MRS (barra gris oscuro), de H. pylori + la cepa 1-4431 de L. brevis 1-4431 cultivada en MRS con glicerol (barra blanca), o de H. pylori + MRS con glicerol.
Descripción detallada de la invención EJEMPLO 1: INHIBICIÓN IN VITRO DEL CRECIMIENTO DE CEPAS DE H. PYLORI POR PARTE DE LA CEPA L. BREVIS CNCM 1-4431 Material v Métodos Cepas de Lactobacillus brevis: - L. brevis CNCM 1-4431 - L. brevis 80: Una cepa convencional de L. brevis Cepas de Helicobacter pylori: Se utilizaron tres cepas de referencia de H. pylori, así como cinco aislados clínicos.
Cepas de referencia: - 26695: descrita en TOMBS y cols.(Nature 388, 539-547, 1997); - HPAG1: descrita en OH y cols.{Proc Nati Acad Sci U S A, 103, 9999-10004, 2006); - TN2GF4: aislada en Japón de un paciente con úlcera gástrica y adaptada al gerbo de Mongolia (cepa descrita en WATANABE, y cols.Gastroenterol 1998; vol. 115, págs. 642-648) Aislados clínicos.
- CR113 y CR114: cepas aisladas de biopsias de lesiones gástricas humanas precancerosas; - Axcan 342 y Axcan 374: cepas respectivamente aisladas de un paciente con gastritis y de otro paciente con esofagitis incluida en un estudio clínico que ponía a prueba una terapia cuádruple para la erradicación de H. pylori (MALFERTHEINER y col., Lancet, 377, 905-913, 2011).
- GC3C : cepa aislada de un paciente con cáncer gástrico. Método: Cepas de L. brevis se cultivaron en caldo MRS (pH 6,2) durante 17 horas. Las suspensiones bacterianas se neutralizaron en el pH 6.8 con una solución de KOH.
Cepas de H. pylori se cultivaron durante 48 horas en caldo de Brucella hasta obtenerse una turbidez equivalente al estándar 4 de Mac Farland. Las suspensiones de bacterias se extendieron sobre la superficies de placas de agar Mueller Hinton que tenían un suplemento de 10 % (v/v) de sangre de oveja, enriquecida con un suplemento Polyvitex al 1% (v/v) (Biomerieux) y en el mismo medio con glicerol, hasta alcanzarse una concentración final de 100 mM para permitir la producción de reuterina.
Sobre la superficie de las placas se aplicó discos de papel estéril. Después, sobre cada disco de papel se aplicó 5 µ? de la suspensión neutralizada de L. brevis. Las placas se incubaron a 37°C bajo atmósfera microaerófila (clasificador de gases Ruskin Microaerophilic, lo que dio por resultado 5% de 02, 10% de C02, y 85% de N2) en un lapso de 72 horas a 96 horas.
Para evaluar el efecto de la suspensión de L. brevis sobre el crecimiento de la cepa de H. pylori, se midió la anchura de los anillos de inhibición de crecimiento alrededor de los discos de papel.
Resultados Los resultados se muestran en la Tabla I de abajo Tabla 1 -a- L. brevis I- 4431 Anillo de inhibición en mm L. brevis I- 4431 Anillo de inhibición en mm (sin glicerol) L. brevis 80 15 40 Anillo de inhibición en mm L. brevis 80 Anillo de inhibición en mm (sin glicerol) Estos resultados muestran que mientras que L. brevis 80 tiene propiedades inhibidoras en nada más que dos de las cepas de H. pylori sometidas a prueba, L. brevis 1-4431 inhibe el crecimiento de 8 de las 8 cepas de H. pylori sometidas a prueba. Estas propiedades inhibidoras parecen estar conectadas con la acumulación de reuterina, ya que sólo se las observa con los cultivos de L. brevis incubados en presencia de glicerol.
EJEMPLO 2: INVESTIGACIÓN POR PCR DE LA PRESENCIA DEL GEN GLDC Material y Métodos Se investigó la presencia, en L. brevis CNCM 1-4431, del gen que codifica la subunidad grande de deshidratasa de glicerol (GldC) - la enzima responsable de la producción de reuterina -, siguiéndose el método descrito por CADIEUX y cois. (2008, citado arriba).
En pocas palabras: se aisló ADN de cada una de las cepas bacterianas puestas a prueba.
En carácter de testigo positivo (C + ) se utilizó la cepa productora de reuterina L. reuterü ATCC 55730. Como testigo negativo (C-) se utilizó la cepa de una especie que no produce reuterina (Streptococcus thermophilus) .
La amplificación de un fragmento del gen que codifica la subunidad grande de Gld {gldC) se llevó a cabo con los iniciadores degenerados: GDCRev: GCRGCYTTSATATCTKSAACCAT (SEQ ID NO: 1) y GDCFor: GCMTAYGCWGAAACCATTTCAGTTTA (SEQ ID NO: 2), ambos descritos en CADIEUX y col.. El tamaño esperado del fragmento amplificado de gldC es 728 bp.
Como testigo positivo de la reacción de PCR, también se amplificó un fragmento del gen 16S rRNA proveniente de todas las muestras, mediante el empleo de los iniciadores eubacterianos: 16SFor: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG (SEQ ID NO: 3) y 16SRev: GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 4), ambos también descritos en CADIEUX y col..
El tamaño esperado del fragmento amplificado del 16S rRNA es 201 bp.
Resultados Los resultados de la reacción de PCR se muestran en la figura 1. La cepa L. brevis CNCM 1-4431, L. brevis 80 así como la cepa productora de reuterina (C + ) L. reuterii ATCC 55730 fueron positivas para el producto esperado de 728 bp. En consecuencia, la cepa L. brevis CNCM 1-4431 contiene el gen gldC, lo que le permite producir reuterina.
EJEMPLO 3 : EFECTO DE L. BREVIS CNCM 1-4431 SOBRE LA INFECCIÓN POR H. PYLORI EN UN MODELO CON C. ELEGANS Cultivos de L. brevis y H. pylori Se cultivó la cepa L. brevis CNCM 1-4431 en caldo MRS, tal como se dio a conocer en el Ejemplo 1.
Se cultivó la cepa NCTC11637 (ATCC 43504T) de H. pylori en medio BHI (Oxoid) que contenía 5% (v/v) de sangre de caballo (Oxoid).
De las células se separaron los sobrenadantes por centrifugación y se los neutralizó con NaOH (1M). Después a los sobrenadantes se los filtró (0.22 pm) y añadió al pellet celular.
En el caso de los cultivos de H. pylori, se quitó por centrifugación el medio BHI que contenía sangre de caballo (Oxoid) y a las células se las lavó con solución salina.
Las placas de agar NG que se utilizaron para los ensayos de infección en C. elegans se prepararon mediante adición de 100 L de una mezcla que contenía cada cultivo LAB en O.D.= 2.22 (incluidos las células y el sobrenadante) con las correspondientes células de la cepa de H. pylori (O.D.= 0.022). En las condiciones de referencia, en las que los nemátodos no se alimentaban con LAB, a las células de H. pylori se las volvió a poner en suspensión en solución salina y se las agregó a las placas.
Ensayos de infección de C. elegans.
Los ensayos de infección se llevaron a cabo con la cepa de tipo silvestre de C. elegans (N2). Se empleó la cepa NCTC11637 de H. pylori para la infección de los nemátodos. Los experimentos dieron comienzo con adultos jóvenes sincronizados (nemátodos de tres días) que se transfirieron a las diferentes condiciones de cultivo: - medio NG + E. coli OP50 (testigo) - medio NG + E. coli OP50 + 100 µ? de medios de cultivo LAB (testigo de los medios de cultivo) - medio NG + E. coli OP50 + 100 [iL (H. pylori NCTC 11637T + LAB).
A los gusanos se los incubó a 25°C durante 8 días, transfiriéndoselos a placas nuevas cada dos días. Se anotó la supervivencia de la población de nemátodos en cada medio de cultivo. Después del período de incubación se tomó muestras de 15 gusanos por afección, lavándoselos con solución intermedia 9 que contenía 0.1 % de Tritón X-100. A los gusanos se los desbarató mediante el empleo de 0.4 g de perlas de carburo de silicio y agitación con remolino.
El ADN de los gusanos infectados se aisló con un equipo comercial "High Puré PCR Témplate Preparation Kit" (Roche), a lo que siguió una precipitación posterior y un proceso de lavado con etanol absoluto y acetato de potasio 5M. Se utilizaron diluciones de muestras de ADN para cuantificar, por RT-PCR, la presencia de H. pylori en las muestras.
RT-PCR Los iniciadores que se utilizó en este estudio están dirigidos al gen vacA (NAYAK y ROSE, J Appl Microbiol, 103, 1931-41, 2007). Se los llama HpyIF (5' CAA TAG CAA TCA AGT GGC TTT G 3', SEQ ID NO: 5) y HpyIR (5' GCG CGC TTC CAC ATT AGC 3'; SEQ ID NO: 6). La especificidad se comprobó previamente in silico mediante la herramienta en línea BLAST e, in vitro, mediante Q-PCR con cepas de la especie H. pylori, diferentes cepas probióticas y E. coli OP50 que se utilizó para alimentar a C. elegans (véase el informe previo sobre optimización). Se utilizó el "SYBR® Green PCR Master Mix" (Applied Biosystem) y el termociclador StepOne Real-Time (Applied Biosystem). La Tabla 2 de abajo resume las condiciones optimizadas para la reacción Q-PCR sobre H. pylori.
Tabla 2.
Mezcla de reacción Mezcla maestra 2x 1x Iniciador hacia delante (For): 325 nM Iniciador hacia atrás (Rev): 325 nM Ciclado térmico Etapa de mantenimiento 50°C 2 95°C 10 min.
Etapa de ciclado (x40) 95°C 15 seg. 60°C 1 min.
El ADN para la curva estándar se preparó mediante la cuantificacion del ADN de H. pylori por espectrofotometría (A260). El número de los genomas correspondientes se calculó del modo siguiente: - Número de Genoma = ADN (g)xNA/Mm - Tamaño del genoma de H. Pylori =1.6 Mpb - NA= 6.023 X1023 - Número de Genoma = ADN (g) x 6.023 x1023/1.6 x 106 x 2 x 309 La curva estándar se efectuó utilizándose cuatro diluciones decuplicadas de ADN.
Los resultados que se obtuvieron con la cepa 1-4431 cultivada en MRS o cultivadas en MRS + glicerol se muestran en la figura 2. Estos resultados muestran que la cepa CNCM 1-4431 reduce la carga de H. pylori NCTC 11637T en C. elegans. La reducción de la infección es más importante cuando a la cepa I-4431 se la cultiva en MRS + glycerol, lo que demuestra que parte, cuando menos, del efecto anti-infeccioso de esta cepa es resultado de la producción de reuterina.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa acumuladora de reuterina de Lactobacillus brevis, a la que se selecciona de entre: - la cepa CNCM 1-4431 de Lactobacillus brevis; - una cepa de Lactobacillus brevis derivada por mutagénesis o por transformación genética de la cepa CNCM 1-4431.
2. El empleo de la cepa de Lactobacillus brevis según la reivindicación 1, para producir reuterina.
3. Una composición que consiste de una cepa de Lactobacillus sp. según la reivindicación 1.
4. La composición según la reivindicación 3, que se caracteriza porque consiste de, cuando menos, 105 cfu; de preferencia, cuando menos 106 cfu, por gramo en peso seco de la mencionada cepa de Lactobacillus brevis.
5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, que se caracteriza porque es una composición nutricional.
6. La composición según la reivindicación 5, que se caracteriza por ser un producto lácteo.
7. Una cepa de Lactobacillus brevis según la reivindicación 1 o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, para utilizar como medicamento.
8. La cepa de Lactobacillus brevis o la composición para utilizar como medicamento según la reivindicación 7, caracterizada porque el mencionado medicamento es para tratar o prevenir infección por H. pylori.
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