CN114032230B - 一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用，其中细菌甘油脱水酶突变体Gt9的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，编码所述细菌甘油脱水酶突变体Gt9的基因序列如SEQ ID No：2所示。本发明以购买于中国普通微生物保藏管理中心的罗伊氏乳杆菌中甘油脱水酶GtW为野生型出发蛋白，通过定向进化构建突变文库，对酶性质进行改良，以高通量筛选技术获得突变体酶命名为Gt9，其对甘油的耐受能力相比野生型提高了50％，有利于提高抑菌素罗伊氏菌素的产量，增强罗伊氏乳杆菌的抑菌能力和扩宽其抑菌应用领域，也为解决现有酶受底物抑制的影响提供研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)是卫生部于2003年批准的新型益生菌，在秸秆发酵垫料养殖中作为常用的具广谱抑菌能力的益生菌，它不仅具有乳酸菌的优势，还可产化学成分为3-羟基丙醛(3-HPA)的广谱抗菌物质罗伊氏菌素。罗伊氏菌素能有效抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长，常被用于养殖、防腐、疾病治疗等领域中。
L.reuteri在以底物甘油合成抑菌素罗伊氏菌素时，其合成能力反而受其底物甘油的抑制，这严重影响了L.reuteri的抑菌应用。在L.reuteri中，底物甘油经甘油脱水酶(glycerol dehydratase，GDHt，EC4.2.1.30)催化脱去一分子水生成罗伊氏菌素，它是甘油的一步代谢产物。因此GDHt作为罗伊氏菌素合成的关键酶和限速酶，其性质直接影响着L.reuteri的抑菌性能。但是对GDHt催化甘油特性的研究试验显示，底物甘油会导致GDHt发生自杀性失活现象，即高浓度甘油或长时间孵育下会导致GDHt失去活性，这种GDHt的自杀性失活严重限制了L.reuteri对甘油的转化，这已成为L.reuteri抑菌应用的最大瓶颈。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用。本发明以购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心的罗伊氏乳杆菌(菌株保藏编号ACCC 03960)中甘油脱水酶GtW为野生型出发蛋白，通过定向进化构建突变文库，对酶性质进行改良，以高通量筛选技术获得突变体酶命名为Gt9，其对甘油的耐受能力相比野生型提高了50％，有利于提高抑菌素罗伊氏菌素的产量，增强罗伊氏乳杆菌的抑菌能力和扩宽其抑菌应用领域，也为解决现有酶受底物抑制的影响提供研究基础。
本发明细菌甘油脱水酶突变体Gt9，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
编码所述细菌甘油脱水酶突变体Gt9的基因序列，如SEQ ID No：2所示。
本发明细菌甘油脱水酶突变体Gt9表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：突变体Gt9编码基因的获得
以甘油脱水酶GtW的编码基因为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入T260L突变位点。
260F：ATGCGCTTTCTCAGCGGCG
260R：CGCCGCTGAGAAAGCGCAT
Gt9F：CGCCATATGAAACGCCAGAAAC(下划线为Nde I识别序列)
Gt9R：CCGCTCGAGTTAC AGTTCCAGATGT(下划线为XhoI识别序列)
以常规PCR方式扩增并获得突变体Gt9编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI 两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将Gt9目的片段回收。
步骤2：重组质粒的构建
以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的Gt9目的片段和pET28a载体于30-37℃水浴中双酶切3-5h，以凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在 T4连接酶作用下于12-16℃环境中将Gt9编码基因正向插入pET28a的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得重组质粒。
步骤3：突变体Gt9重组表达菌株的构建
将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂板于LB(含100mg/L氨苄青霉素)平板在20-37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有10mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)试管中，于20-37℃、100-220 rpm进行过夜培养后，取菌液放置于-80℃中以保菌。
所述甘油脱水酶GtW的编码基因通过如下方法获得：
将购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心的罗伊氏乳杆菌(菌株保藏编号ACCC03960)于37℃培养24h后，以AxyPrep细菌基因组提取试剂盒提取罗伊氏乳杆菌全基因组，以基因组为模板设计甘油脱水酶GtW扩增引物获取GtW编码基因：
GtWF：CGCCATATGAAACGCCAGAAAC(下划线为Nde I识别序列)
GtWR：CCGCTCGAGTTAC AGTTCCAGATGT(下划线为XhoI识别序列)
以常规PCR方式扩增并获得野生型GtW编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI 两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将GtW目的片段回收，获取野生型GtW编码基因。
以上述构建获得的表达菌株发酵制备甘油脱水酶突变体Gt9，包括如下步骤：
步骤1：发酵培养制备粗酶液
在20-37℃、100-220rpm条件下，将甘油脱水酶Gt9重组表达菌株接种于含100mL液体LB培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD600值至0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM 的IPTG诱导剂，并降温至16-28℃进行诱导表达，以MBTH酶活力测定法检测发酵液中Gt9 活力变化；连续检测甘油脱水酶Gt9活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4-10℃、12000rpm下离心10-20min，弃上清液收集沉淀菌体；以pH＝7.0的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，再以适量Na-K缓冲液重悬细胞并以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4-10℃、12000rpm下离心10-20min，弃沉淀收集上清液获取Gt9粗酶液1L；使用300mL 规格超滤浓缩装置在4-10℃、0.2-0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得甘油脱水酶 Gt9浓缩粗酶液30mL。
步骤2：甘油脱水酶Gt9的纯化
以Ni柱亲和层析纯化甘油脱水酶Gt9，配制纯化溶液：
Wash buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM 2-ME， 20mM imidazole，pH7.0。
Elution buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME， 250mM imidazole，pH7.0。
Saving buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME， pH7.0。
将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：
(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；
(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；
(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液。
(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合(图1)。
(5)将混合液置于透析袋中，在4-10℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换甘油脱水酶保存体系。每隔3-5h更换一次透析缓冲液，连续透析3-4次，获得甘油脱水酶Gt9纯酶液。
本发明以来源于实验室从生猪养殖垫料中筛选分离的罗伊氏乳杆菌的甘油脱水酶GtW 为野生型出发蛋白，通过定向进化构建突变文库，对酶性质进行改良，以高通量筛选技术获得突变体酶命名为Gt9，其对甘油的耐受能力相比野生型提高了50％，有利于提高抑菌素罗伊氏菌素的产量，增强罗伊氏乳杆菌的抑菌能力和扩宽其抑菌应用领域，也为解决现有酶受底物抑制的影响提供研究基础。
附图说明
图1是甘油脱水酶Gt9纯化后电泳检测，M为蛋白Maker，Sonicate为浓缩后超声破碎粗酶液，Gt9为混合后甘油脱水酶纯蛋白，GtW为等量发酵液纯化后甘油脱水酶纯蛋白条带，从图1中可以看出目标甘油脱水酶条带纯度较高，其大小约为51kDa。
图2是甘油脱水酶Gt9和GtW分别在200mM和300mM甘油孵育时稳定性比较。
图3是甘油脱水酶Gt9和GtW对大肠杆菌抑菌对比试验。
具体实施方式
实施例1：甘油脱水酶Gt9的制备
菌株：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)
表达载体：pET28a
培养基：
LB培养基(1L)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，溶于1L水中，高压灭菌，固体培养基添加1.5％琼脂。使用前加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素。
1、突变体Gt9编码基因的获得及重组表达质粒的构建
将购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心的罗伊氏乳杆菌(菌株保藏编号ACCC03960)于37℃培养24h后，以AxyPrep细菌基因组提取试剂盒提取罗伊氏乳杆菌全基因组，以基因组为模板设计甘油脱水酶GtW扩增引物获取GtW编码基因：
GtWF：CGCCATATGAAACGCCAGAAAC(下划线为Nde I识别序列)
GtWR：CCGCTCGAGTTAC AGTTCCAGATGT(下划线为XhoI识别序列)
以常规PCR方式扩增并获得野生型GtW编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI 两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将GtW目的片段回收，获取野生型GtW编码基因。
以回收的甘油脱水酶GtW编码基因为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入T260L突变位点，获取突变体Gt9编码基因。
260F：ATGCGCTTTCTCAGCGGCG
260R：CGCCGCTGAGAAAGCGCAT
Gt9F：CGCCATATGAAACGCCAGAAAC(下划线为Nde I识别序列)
Gt9R：CCGCTCGAGTTAC AGTTCCAGATGT(下划线为XhoI识别序列)
以常规PCR方式扩增并获得突变体Gt9编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI 两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20S，57℃20S，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将Gt9目的片段回收，获取Gt9编码基因。
以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的Gt9目的片段和pET28a载体于37℃水浴中双酶切8h，以凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在T4连接酶作用下于16℃环境中将Gt9编码基因正向插入pET28a的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得突变体Gt9重组表达质粒。
2、突变体Gt9重组表达菌株的构建
将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中于，转化产物涂板于LB(含100mg/L 氨苄青霉素)平板在37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有10mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)试管中，于37℃、200rpm进行过夜培养后，取菌液保存于-80℃中。
3、发酵培养
在37℃、220rpm条件下，将甘油脱水酶Gt9重组表达菌株接种于含100mL液体LB培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD600值至0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至28℃进行诱导表达，以MBTH酶活力测定法检测发酵液中Gt9活力变化。
MBTH酶活力检测体系0.5m L，各成份如下：0.2mmol/L甘油、15μmol/L维生素B12、0.035mol/L pH 8.0磷酸钾缓冲液、0.05mol/L KCl和适量酶液。酶催化反应混合液37℃水浴 10min，反应完成后添加1.0m L 0.1mol/L pH3.6柠檬酸钾溶液终止反应，然后添加50μL1％的MBTH(w/v)并在37℃下水浴15min，在光波波长305nm处测定反应混合液的吸光值并计算酶活，定义一个单位的酶活(U)为一分钟内转化1μM底物所需的酶量。
4、粗酶液获得
连续检测甘油脱水酶Gt9活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、12000rpm 下离心20min，弃上清液收集沉淀菌体。以pH7.0的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，加入适量缓冲液以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4℃、12000rpm下离心20min，弃沉淀收集上清液获取Gt9粗酶液1L。使用300mL规格超滤浓缩装置在4℃、0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得甘油脱水酶Gt9浓缩粗酶液30mL。
5、甘油脱水酶Gt9纯化
以Ni柱亲和层析纯化甘油脱水酶Gt9，配制纯化溶液：
Wash buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM 2-ME， 20mM imidazole，pH7.0。
Elution buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME， 250mM imidazole，pH7.0。
Saving buffer：20mM Tris-HCl buffer，100mM NaCl，10％(v/v)glycerol，7mM2-ME， pH7.0。
将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：
(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；
(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；
(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液。
(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合，同时对比野生型等量发酵液纯化后蛋白情况(图1)。
(5)将混合液置于透析袋中，在4℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换甘油脱水酶保存体系。每隔5h更换一次透析缓冲液，连续透析三次，获得甘油脱水酶Gt9 纯酶液。
实施例2：甘油脱水酶Gt9和GtW对甘油耐受比较
构建甘油脱水酶对甘油耐受检测体系2mL：15μmol/L维生素B12、0.035mol/L pH8.0磷酸钾缓冲液、0.05mol/L KCl，分别在体系中含有0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、500mmol/L甘油浓度下，加入等量Gt9和GtW酶液，以MBTH酶活力检测法检测体系内酶活力变化。结果显示，Gt9在甘油浓度200mM和300mM孵育下，其相对酶活相比野生型GtW均提高约50％，即说明突变体对甘油的耐受能力提高约50％(图2)。
实施例3：甘油脱水酶Gt9和GtW抑菌比较
分别将甘油脱水酶Gt9和GtW重组表达菌株接种于含100mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，培养基中均含有200mM甘油，在37℃、220rpm条件下培养至菌体生物量OD600值至0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至28℃进行诱导表达20h。分别将两组发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取菌体生物量OD600值为4.0进行细胞破碎，取 50μL破碎液进行大肠杆菌平板抑菌试验。抑菌圈对比结果显示，相比野生型GtW，突变体 Gt9由于具有更高的甘油耐受性，对甘油转化能力提高，使抑菌素罗伊氏菌素产量提高，因此其抑菌圈也明显大于野生型GtW(图3)。
SEQ ID No：1甘油脱水酶Gt9蛋白序列
MKRQKRFEELEKRPIHQDTFVKEWPEEGFVAMMGPNDPKPSVKVENGKIVEMDGKKLEDF DLIDLYIAKYGINIDNVEKVMNMDSTKIARMLVDPNVSRDEIIEITSALTPAKAEEIISKLDFGEMIMAVKKMRPRRKPDNQCHVTNTVDNPVQIAADAADAALRGFPEQETTTAVARYAPFNA ISILIGAQTGRPGVLTQCSVEEATELQLGMRGFTAYAETISVYGTDRVFTDGDDTPWSKGFLA SCYASRGLKMRFLSGAGSEVLMGYPEGKSMLYLEARCILLTKASGVQGLQNGAVSCIEIPGAVPNGIREVLGENLLCMMCDIECASGCDQAYSHSDMRRTERFIGQFIAGTDYINSGYSSTPNY DNTFAGSNTDAMDYDDMYVMERDLGQYYGIHPVKEETIIKARNKAAKALQAVFEDLGLPKITDEEVEAATYANTHDDMPKRDMVADMKAAQDMMDRGITAIDIIKALYNHGFKDVAEAI LNLQKQKVVGDYLQTSSIFDKDWNVTSAVNDGNDYQGPGTGYRLYEDKEEWDRIKDLPF ALDPEHLEL
SEQ ID No：2甘油脱水酶Gt9基因序列 CATATGAAACGCCAGAAACGCTTTGAAGAACTGGAAAAACGCCCGATTCATCAGGATACCTTTGTGAAAGAATGGCCGGAAGAAGGCTTTGTGGCGATGATGGGCCCGAATGATCCGA AACCGAGCGTGAAAGTGGAAAATGGCAAAATTGTGGAAATGGACGGCAAAAAGCTGGAGGATTTTGATCTGATCGATCTGTATATTGCGAAGTACGGCATTAATATCGACAACGTGGA GAAGGTGATGAACATGGATAGCACCAAAATTGCGCGCATGCTGGTGGATCCGAATGTGAGCAGAGATGAAATTATTGAAATCACCAGCGCGCTGACCCCGGCGAAAGCGGAAGAAAT TATTAGCAAACTGGATTTCGGCGAGATGATCATGGCGGTGAAAAAAATGCGCCCGCGCCGCAAACCGGATAATCAGTGTCATGTGACCAATACCGTGGATAATCCGGTGCAGATTGCGGCGGATGCGGCGGATGCGGCATTACGTGGTTTTCCAGAACAAGAAACCACCACCGCGGT GGCGCGTTATGCGCCATTTAATGCGATTAGCATTCTGATTGGCGCGCAGACCGGCCGCCCAGGTGTTTTAACTCAATGTAGCGTGGAAGAAGCGACCGAACTGCAGCTGGGCATGCGC GGTTTTACCGCGTATGCGGAAACCATTAGCGTGTATGGCACCGATCGCGTGTTTACCGAT GGCGATGATACCCCGTGGAGCAAAGGCTTTCTGGCGAGCTGTTATGCGAGCCGCGGTCTGAAAATGCGCTTTCTCAGCGGCGCGGGCAGTGAAGTTTTGATGGGTTATCCAGAAGGCA AAAGCATGCTGTATCTGGAAGCGCGCTGCATTCTGCTGACCAAAGCGAGCGGTGTGCAGGGCTTACAAAATGGCGCGGTTAGCTGTATTGAAATTCCGGGCGCGGTTCCGAATGGCATT CGCGAAGTGTTAGGCGAAAATCTGCTGTGCATGATGTGCGATATTGAATGCGCGAGCGGCTGCGATCAGGCGTATAGTCATAGCGATATGCGCCGCACCGAACGCTTTATTGGCCAGTT TATTGCGGGCACCGATTATATTAATAGCGGCTATAGCAGCACCCCGAATTATGATAATACCTTTGCGGGCAGCAATACCGATGCGATGGATTATGATGATATGTATGTGATGGAGCGCGAC CTGGGCCAGTATTATGGCATTCATCCGGTGAAAGAAGAAACCATTATTAAGGCGCGCAATAAGGCGGCGAAAGCGCTGCAAGCGGTTTTTGAAGATCTGGGCTTACCGAAAATTACCGA TGAAGAAGTGGAAGCGGCGACCTATGCGAATACCCATGATGATATGCCGAAACGCGATATGGTGGCGGATATGAAAGCGGCGCAGGATATGATGGATCGCGGCATTACCGCGATTGATA TTATTAAAGCGCTGTACAATCACGGCTTCAAAGATGTGGCGGAAGCGATTCTGAATCTGC AGAAACAGAAAGTGGTGGGCGATTATCTGCAGACCAGCAGCATTTTTGATAAAGATTGGAATGTGACCAGCGCGGTGAATGATGGCAATGATTATCAGGGCCCGGGCACCGGCTATCG CTTATATGAAGATAAAGAAGAGTGGGATCGCATTAAGGACCTGCCGTTTGCGCTGGATCC GGAACATCTGGAACTGTAACTCGAG。
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<120> Title : 一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用
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SequenceDescription :
Claims (4)
1.一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.编码权利要求1所述细菌甘油脱水酶突变体Gt9的基因序列，其特征在于所述基因序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种权利要求1所述细菌甘油脱水酶突变体Gt9表达菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：突变体Gt9编码基因的获得
以罗伊氏乳杆菌甘油脱水酶GtW的cDNA为模板，以如下引物在氨基酸序列中引入T260L突变位点：
260F：ATGCGCTTTCTCAGCGGCG
260R：CGCCGCTGAGAAAGCGCAT
Gt9F：CGCCATATGAAACGCCAGAAAC
Gt9R：CCGCTCGAGTTACAGTTCCAGATGT
以常规PCR方式扩增并获得突变体Gt9编码基因，并在全长序列扩增时引入NdeI和XhoI两处酶切位点，以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将Gt9目的片段回收；
步骤2：重组质粒的构建
以NdeI和XhoI两种限制内切酶分别将回收后的Gt9目的片段和pET28a载体于30-37℃水浴中双酶切3-5h，以凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在T4连接酶作用下于12-16℃环境中将Gt9编码基因正向插入pET28a的NdeI和XhoI酶切位点之间，获得重组质粒；
步骤3：突变体Gt9重组表达菌株的构建
将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂板于LB平板在20-37℃培养；随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆；将阳性克隆接种于含有10mL液体LB试管中，于20-37℃、100-220rpm进行培养，取菌液放置于-80℃中以保菌。
4.以权利要求3构建获得的表达菌株发酵制备甘油脱水酶突变体Gt9的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：发酵培养制备粗酶液
在20-37℃、100-220rpm条件下，将甘油脱水酶Gt9重组表达菌株接种于含100mL液体LB培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD600值至0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，并降温至16-28℃进行诱导表达，以MBTH酶活力测定法检测发酵液中Gt9活力变化；连续检测甘油脱水酶Gt9活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4-10℃、12000rpm下离心10-20min，弃上清液收集沉淀菌体；以pH＝7.0的Na-K缓冲液重悬沉淀并清洗两次后，再以Na-K缓冲液重悬细胞并以超声破碎方式对菌体进行破壁，将破碎液在4-10℃、12000rpm下离心10-20min，弃沉淀收集上清液获取Gt9粗酶液1L；使用300mL规格超滤浓缩装置在4-10℃、0.2-0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得甘油脱水酶Gt9浓缩粗酶液30mL；
步骤2：甘油脱水酶Gt9的纯化
(1)用0.22um的滤膜过滤粗酶液，样品上清液上Ni-柱；
(2)待样品上清液流净后，加入10倍柱体积的Wash buffer清洗杂蛋白；
(3)加入3倍柱体积的Elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始分管收集目的蛋白，调整咪唑浓度50mM-250mM，从低到高浓度下依次冲洗收集蛋白洗脱液；
(4)以15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合；
(5)将混合液置于透析袋中，在4-10℃环境中，将透析袋置于Saving buffer中进行透析更换甘油脱水酶保存体系，每隔3-5h更换一次透析缓冲液，连续透析3-4次，获得甘油脱水酶Gt9纯酶液。
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