WO2013137277A1 - ３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、並びに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、並びに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂の製造方法 Download PDF

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    • C12Y102/01075—Malonyl CoA reductase (malonate semialdehyde-forming)(1.2.1.75)
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01028—Propanediol dehydratase (4.2.1.28)
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/0103—Glycerol dehydratase (4.2.1.30)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid, a recombinant microorganism, and a method for producing an acrylic acid, a water-absorbent resin, an acrylic ester, and an acrylic ester resin using the method.
  • biomass resources such as starch biomass such as corn and wheat, sugar biomass such as sugar cane, and cellulose biomass such as shredded rapeseed and rice straw Attempts have been made to develop methods for use as raw materials.
  • biomass-derived saccharides a method of using carbon monoxide and hydrogen obtained by gasifying woody biomass as fermentation raw materials and a method of gasifying woody biomass to synthesize methanol are also examined. ⁇ It has been reported.
  • 3-hydroxypropionic acid (3HP) and esters thereof are useful compounds as raw materials for aliphatic polyesters, and polyesters synthesized therefrom are attracting attention as biodegradable earth-friendly polyesters.
  • 3-hydroxypropionic acid is usually prepared by the addition of water to acrylic acid or by the reaction of ethylene chlorohydrin with sodium cyanide. Since the reaction to hydrate acrylic acid is an equilibrium reaction, there is a problem that the reaction rate is controlled. Also, in the case of ethylene chlorohydrin, the use of highly toxic substances is required, and an additional hydrolysis step has to be added. In this case, there is also a problem that large amounts of sodium chloride and ammonium salt are generated.
  • 3-hydroxypropionic acid can produce acrylic acid by dehydration.
  • Acrylic acid is mainly used as an intermediate in the production of acrylic esters, and acrylic esters are used in the production of coatings, finishes, paints and adhesives, in the production of additives for adsorbents and detergents Is also used.
  • a water absorbing resin can also be produced by partially neutralizing acrylic acid and copolymerizing with a crosslinkable monomer.
  • Hydrolysis of acrylonitrile with sulfuric acid is known as an alternative method for producing acrylic acid. However, this method produces a large amount of ammonium sulfate waste and is not implemented commercially because of the cost involved.
  • 3-hydroxypropionic acid can be produced by enzymatic reaction or fermentation.
  • a pathway by 3HP cycle carbon fixation pathway
  • a pathway using ⁇ -alanine as an intermediate are proposed.
  • WO 2008/027742 describes a method for fermentatively producing 3HP utilizing the above-mentioned route (2).
  • the route of (2) the number of reaction stages required from pyruvic acid as a raw material to 3 HP is 4 or more, and it can not be said that it is an efficient production method of 3 HP.
  • the method of using the routes of (1) and (2) has not been able to produce 3HP efficiently. Therefore, in recent years, methods using other 3HP fermentation production pathways have been studied.
  • Examples of the other 3HP fermentative production pathway include (3) a pathway by malonyl CoA ⁇ 3HP, and (4) a pathway by glycerin ⁇ 3-hydroxypropionaldehyde (3HPA) ⁇ 3HP.
  • the methods utilizing the above routes (3) and (4) are mainly intended to efficiently produce 3HP using a genetically modified microorganism in which a gene of a required enzyme has been introduced into a microorganism such as E. coli.
  • a gene encoding malonyl CoA reductase or the like is introduced, and in the method (4) above, a microorganism into which a gene encoding glycerol dehydratase, aldehyde dehydrogenase or the like is introduced is used. .
  • a method of purifying 3HP after converting 3HP salt in fermentation liquid to 3HP has been proposed.
  • an amine solvent is added to a solution containing 3HP ammonium salt obtained by fermentation near neutrality, and the 3HP ammonium salt is converted to 3HP by heating, A method of extracting 3HP is disclosed.
  • a tertiary amine solvent is added to a solution containing 3 HP calcium salt, and 3 HP calcium salt is converted to 3 HP by feeding carbon dioxide, and in tertiary amine solvent Discloses a method of extracting 3HP.
  • the fermentation host used in the method of fermentatively producing a large number of 3HPs including the above pathways (3) and (4) is usually E. coli whose growth is suppressed under acidic conditions.
  • E. coli whose growth is suppressed under acidic conditions.
  • the fermentation production method of 3HP which combines the production method of 649-657 3HP and the purification method of WO2002 / 090312 or WO2005 / 073161 capable of efficiently purifying the produced 3HP salt is , Have given a certain effect.
  • the present invention aims to provide a method for efficiently producing 3-hydroxypropionic acid (3HP).
  • the inventors of the present invention conducted intensive studies to solve the above problems, and using the recombinant microorganism into which a gene encoding an enzyme required for a microorganism having acid resistance was introduced, the production amount of 3HP was improved. It has been found that the produced 3HP can be easily purified from the fermented liquid while the present invention is completed. That is, the present invention introduces a gene encoding foreign malonyl-CoA reductase, or a gene encoding foreign malonate semialdehyde dehydrogenase and a gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase into a microorganism having acid resistance.
  • a gene encoding foreign glycerol dehydratase and a gene encoding glycerol dehydratase reactivating factor, or a gene encoding foreign diol dehydratase and diol dehydratase A 3-hydroxypropionic acid comprising using a second genetically modified microorganism into which a gene encoding an activation factor and a gene encoding a foreign aldehyde dehydrogenase have been introduced. Production method on.
  • FIG. 1 shows a plasmid map of pADH.
  • FIG. 1 shows a plasmid map of pGPD.
  • FIG. 1 shows a plasmid map of pG418.
  • FIG. 1 shows a plasmid map of pAUR.
  • FIG. 6 shows a mass spectrum of 3HP and a mass spectrum of a culture supernatant of S. pombe (mcr). It is the graph which compared transition of 3HP production amount and transition of pH with S. pombe (mcr, acc, gpd1) and S. pombe (mcr, acc) in Example 4.
  • the present invention relates to a microorganism having acid resistance, which has introduced a gene encoding foreign malonyl CoA reductase, or a gene encoding foreign malonate semialdehyde dehydrogenase and a gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase.
  • 3-hydroxypropionic acid (3HP) can be produced efficiently.
  • the 3HP generation path according to the present invention can be used in any path as long as 3HP generation is possible.
  • (a) glucose 3HP generation pathway for producing 3HP by the route of (a) glucose ⁇ ⁇ ⁇ pyruvate ⁇ lactic acid ⁇ lactyl CoA ⁇ acrylyl CoA ⁇ 3-hydroxypropionyl CoA ⁇ 3HP (i) glucose ⁇ ⁇ ⁇ pyruvate ⁇ 3HP generation pathway via malonyl-CoA to generate 3HP by the pathway of acetyl CoA ⁇ malonyl CoA ⁇ 3HP, 3HP is created by the pathway of (u) glucose ⁇ ⁇ ⁇ pyruvate ⁇ acetyl CoA ⁇ malonyl CoA ⁇ malonate semialdehyde ⁇ 3HP Malonyl-CoA-malonic acid-semialdehyde-mediated 3HP generation pathway, (E) glucose ⁇ ⁇ ⁇ pyruvate ⁇ oxalo
  • Metabolic pathways are available.
  • the 3HP generation pathways described in (a) to (iv) may be used alone or in combination with a plurality of 3HP generation pathways.
  • the method for producing 3HP by (3) the pathway for formation of 3HP via malonyl-CoA and (3) the pathway for formation of 3HP via glycerin is described in detail.
  • the present invention is not limited to the following embodiments.
  • FIG. 1 conceptually illustrates a method according to an embodiment of the present invention.
  • 3HP is produced by the (3) malonyl CoA ⁇ 3HP pathway.
  • (3-a) malonyl-CoA is directly produced by 3HP
  • (3-b) malonyl-CoA is intermediate 3HP via malonic acid semialdehyde.
  • 3-b) malonic acid semialdehyde is used.
  • 3HP is produced by the route of (4) glycerin ⁇ 3-hydroxypropionaldehyde (3HPA) ⁇ 3HP.
  • the first genetically modified microorganism according to the present invention comprises (a) a microorganism having acid resistance, into which a gene encoding foreign malonyl CoA reductase has been introduced; (i) a microorganism having acid resistance, a foreign malon A gene into which a gene encoding acid semialdehyde dehydrogenase and a gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase have been introduced; or (c) a gene encoding foreign malonyl CoA reductase, a microorganism having acid resistance, a foreign malon It may be either a gene encoding acid semialdehyde dehydrogenase or one into which a gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase has been introduced.
  • the microorganism having acid resistance is not particularly limited as long as it can grow in a medium having 3HP of 90 g / L or more, preferably 100 g / L or more, more preferably 100 to 300 g / L.
  • the acid-resistant microorganism include bacteria and yeast.
  • bacteria having acid resistance examples include, for example, Acetobacter bacteria such as Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti etc., acetic acid bacteria such as Gluconacetobacter bacteria such as Gluconobacter oxydans and Gluconobacter frateurii; Lactobacillus bacteria, Lactococcus bacteria, Enterococcus bacteria, etc. Lactic acid bacteria, such as bacteria and Leuconostoc genus bacteria, etc. are mentioned.
  • yeast having acid resistance examples include Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Torulaspora, Zygosaccharomyces, Candida and the like.
  • Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida sonorensis and the like can be mentioned.
  • a genetically modified microorganism modified to continue fermentation even at low pH a genetically modified microorganism modified to suppress growth inhibition by 3HP, mutation treatment to continue fermentation even at low pH
  • Any of the mutant strains subjected to and the mutant strains having improved resistance to growth inhibition by 3HP can be used.
  • the microorganism having acid resistance is preferably a yeast, more preferably a Schizosaccharomyces genus, and still more preferably a Schizosaccharomyces pombe.
  • acetic acid can be by-produced together with 3HP, but when fermentation is performed using yeast, ethanol is by-produced and the amount of by-product acetic acid can be reduced.
  • Acetic acid is difficult to separate from 3HP, and even when acrylic acid is produced using the generated 3HP, separation of acrylic acid and acetic acid becomes difficult, so that byproduct formation of acetic acid is suppressed in the 3HP generation stage. It is preferable to use a yeast that can be used.
  • Malonyl CoA reductase is a protein having an enzymatic activity that catalyzes a de-CoA reaction and a reduction reaction using malonyl CoA as a substrate.
  • the gene encoding foreign malonyl CoA reductase which can be used is not particularly limited, and any known gene can be used.
  • any known gene can be used.
  • Chloroflexus aurantiacus Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii, Roseiflexus sp. , Erythrobacter sp. , Gamma proteobacterium, Roseiflexussp. Strain RS-1, Erythrobacter sp.
  • Strain NAP1 Metallosphaera sedula, Sulfolobus tokodaii, Acidian's brierleyi, Sulfolobus metallicus, Acidian's infernos, Acidian's brierleyi, Metallicosphaera sedula, Acidian's amivalens, Sulfolobus sp.
  • Stygiolobus azoricus a gene encoding malonyl CoA reductase derived from Pyrolobus fumarii.
  • Chloroflexus aurantiacus Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii, Roseiflexus sp. , Erythrobacter sp.
  • the amino acid sequence of malonyl CoA reductase from Chloroflexus aurantiacus is exemplified in SEQ ID NO: 1
  • the base sequence of the malonyl CoA reductase gene from Chloroflexus aurantiacus is exemplified in SEQ ID NO: 2.
  • mutations such as deletion, substitution, addition, etc. may occur in one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Malonic acid semialdehyde dehydrogenase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction of using malonyl CoA as a substrate to generate malonic acid semialdehyde.
  • the gene encoding foreign malonic acid semialdehyde dehydrogenase that can be used is not limited, and any known gene can be used.
  • Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas sp. , Lactobacillus casei, Pseudomonas sp.
  • Chloroflexus aurantiacus Chloroflexus aggregans, Metallosphaera sedula, Sulfolobus tokodaii, Acidianus brierleyi, Sulfolobus metallicus, Acidianus infernus, Acidianus brierleyi, Metallosphaera sedula, Acivalius And a gene encoding malonic acid semialdehyde dehydrogenase derived from These genes encoding malonic acid semialdehyde dehydrogenase may be used alone or in combination of two or more. A modified malonic acid semialdehyde dehydrogenase modified by adding a point mutation to the malonic acid semialdehyde dehydrogenase may be used.
  • Gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction of malonic acid semialdehyde as a substrate to generate 3HP.
  • the gene encoding foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase which can be used is not particularly limited, and any known gene can be used.
  • Candida catenulata Candida gropengiesseri, Candida rugosa, Escherichia coli, Pichia haplophila, Propionibacterium shermanii, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Chloroflexus aurantiacus, Chloroflexus aggregans, Metallosphaera sedula, Sulfolobus tokodaii, Acidianus brier eyi, Sulfolobus metallicus, Acidianus infernus, Acidianus brierleyi, Metallosphaera sedula, Acidianus ambivalens, Sulfolobus sp.
  • the genes encoding 3-hydroxypropionate dehydrogenase may be used alone or in combination of two or more.
  • a modified 3-hydroxypropionate dehydrogenase may be used which is modified by adding a point mutation to the 3-hydroxypropionate dehydrogenase.
  • the nucleotide sequence of 3-hydroxypropionate dehydrogenase of Alcaligenes faecalis is exemplified in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is exemplified in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of 3-hydroxypropionate dehydrogenase of Pseudomonas aeruginosa is exemplified in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is exemplified in SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotide sequence of 3-hydroxy propionate dehydrogenase of Pseudomonas putida is exemplified in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is exemplified in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotide sequence of 3-hydroxypropionate dehydrogenase of Escherichia coli is exemplified in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is exemplified in SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 9 The nucleotide sequence of 3-hydroxypropionate dehydrogenase of Escherichia coli is exemplified in SEQ ID NO: 9
  • amino acid sequence is exemplified in SEQ ID NO: 10.
  • the first genetically modified microorganism is in the form into which the gene encoding foreign malonyl CoA reductase has been introduced, or the gene encoding foreign malonic acid semialdehyde dehydrogenase and the foreign 3-hydroxypropionate dehydrogenase
  • the gene-introduced form is described, other enzymes capable of producing 3HP from malonyl CoA may be used alone or in combination of two or more.
  • a gene encoding foreign acetyl-CoA carboxylase may be further introduced into the first recombinant microorganism.
  • the first genetically modified microorganism can produce malonyl CoA in the first genetically modified microorganism, using acetyl CoA as a raw material.
  • acetyl-CoA carboxylase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction of acetyl-CoA as a substrate to generate malonyl-CoA.
  • the gene encoding foreign acetyl-CoA carboxylase that can be used is not particularly limited, and any known gene can be used.
  • Corynebacterium is used, For example, Corcinobacterium glutinous bacteria, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus cerivus, No.
  • S hizosaccharomyces pombe Setaria viridis, Solanum tuberosum, Spinacia oleracea, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor, Sulfolobus metallicus, Takifugu sp.
  • Candida catenulata Candida gropengiesseri, Candida rugosa, Pichia haplophila, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas sp.
  • Chloroflexus aggregans Metallosphaera sedula, Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Escherichia blattae, Candida sonorensis, Candida methanosorbosa, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces thermotolerans, Ittatchenkia orientalis, Candida curvata, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus curvatus, Trichosporon cutaneum, include genes encoding acetyl CoA carboxylase derived from Lipomyces starkeyi.
  • acetyl CoA carboxylase derived from Corynebacterium glutamicum or Saccharomyces cerevisiae.
  • the above genes encoding acetyl-CoA carboxylase may be used alone or in combination of two or more.
  • a modified acetyl-CoA carboxylase modified by adding a point mutation to the acetyl-CoA carboxylase may be used.
  • acetyl CoA carboxylase accBC
  • dtsR1 acetyl CoA carboxylase
  • SEQ ID NO: 14 The nucleotide sequence of the acetyl-CoA carboxylase (acc1) gene of and the gene sequence of Biotin: apoprotein ligase (bpl1) derived from Saccharomyces cerevisiae in SEQ ID NO: 30 are also exemplified.
  • one or more of the corresponding amino acid sequences can be modified by changing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 13, 14, 29, 30 Mutations such as deletions, substitutions, additions, etc. may occur in amino acids.
  • modification of a gene encoding an acid-resistant microorganism or enzyme may be performed. Specifically, modification of a gene related to at least one selected from the group consisting of glucose, acetyl CoA, malonyl CoA, malonic acid semialdehyde, 3HP, and by-products obtained in the fermentation process (acetic acid, ethanol, etc.) Can be mentioned.
  • modifications of acetyl-CoA carboxylase modifications to increase the amount of malonyl-CoA in cells, modifications of 3HP metabolism suppression, and modifications to increase the amount of acetyl-CoA are exemplified below.
  • Acetyl CoA carboxylase may be subject to feedback inhibition by the generated malonyl CoA, 3HP and the like. Therefore, a microorganism having acid resistance or a gene encoding acetyl-CoA carboxylase can be modified to have an effect of increasing the amount of biosynthesis of malonyl-CoA.
  • the modification method is not particularly limited, and (a) a method of highly expressing the acetyl CoA carboxylase gene originally possessed by the host, (b) a method of introducing an acetyl CoA carboxylase from an organism different from the host, (c 2.) A method of introducing a mutation into the acetyl-CoA carboxylase gene such that regulation by intracellular acetyl-CoA or malonyl-CoA does not occur can be mentioned.
  • the method for highly expressing the acetyl CoA carboxylase gene originally possessed by the host of (a) is not particularly limited.
  • a fragment obtained by inserting the acetyl CoA carboxylase gene downstream of the high expression promoter is used on the chromosome of the host microorganism.
  • Method for introducing multiple copies e.g., 1 to 10 copies
  • Method for transforming an expression vector having multiple copies (e.g., 1 to 10 copies) of the acetyl CoA carboxylase gene into the same host High expression of acetyl CoA carboxylase Method of culturing under such culture conditions; a method of using a mutant strain in which acetyl CoA carboxylase is highly expressed by mutation treatment; N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonic acid For treatment of mutagens such as (EMS) Ri and a method using malonyl CoA and / or acetyl-CoA biosynthesis large amount since mutations organisms like.
  • acetyl-CoA carboxylase is a biotin-dependent enzyme
  • genetically modified organisms or mutant organisms having improved biotin biosynthetic ability may be used.
  • the method for introducing acetyl CoA carboxylase from an organism different from the host in (b) is not particularly limited as long as the gene encoding acetyl CoA carboxylase derived from the above-described microorganism can be introduced into another microorganism.
  • one or more copies (for example, 1 to 200 copies) of an acetyl CoA carboxylase gene are transformed into a host (for example, a microorganism) belonging to a species different from a host (for example, a microorganism) which originally has the acetyl CoA carboxylase And the like.
  • the acetyl-CoA carboxylase to be introduced is preferably inserted on a chromosome, since it can be stably held in the microorganism by inserting it on the chromosome of the host microorganism.
  • the method for introducing a mutation into the acetyl-CoA carboxylase gene so as not to cause regulation by acetyl-CoA or malonyl-CoA in the cell of (c) is not particularly limited, but for example, it is responsible for feedback control etc. in the acetyl-CoA carboxylase gene
  • the methods (a) to (c) may be applied singly or in combination of two or more.
  • the method (a) and the method (b) are preferably used, and the method (b) is more preferably used. That is, it is preferable that the effect of increasing the biosynthetic amount of malonyl CoA is obtained by transforming acetyl CoA carboxylase into a microorganism belonging to a different species from the microorganism originally having the acetyl CoA carboxylase.
  • the form of acetyl CoA carboxylase is not particularly limited, and any known form can be applied.
  • modification to increase the amount of malonyl CoA in cells can be carried out by suppressing or destroying the activity of an enzyme gene that catalyzes a reaction (such as conversion reaction to fatty acid) using malonyl CoA as a substrate.
  • a reaction such as conversion reaction to fatty acid
  • inhibition or destruction of fatty acid synthetase gene catalyzing fatty acid synthesis reaction from malonyl-CoA, synthesis of malonyl-ACP using malonyl-CoA as a substrate, destruction of malonyl-CoA-ACP transacylase gene, ⁇ -ketoacyl-ACP A method etc. which suppress that malonyl-CoA is converted into a fatty acid can be utilized by highly expressing the fabF gene which encodes synthase II.
  • the amount of malonyl-CoA in cells can be increased by highly expressing the malonyl-CoA reductase gene, or modifying it to introduce / highly express a foreign malony
  • 3HP metabolism suppression there is mentioned a method of modifying an enzyme gene which catalyzes a reaction using 3HP as a substrate. Specifically, by destroying the enzyme gene catalyzing the redox reaction using propionyl CoA synthase, 3-hydroxypropionyl-CoA synthetase or 3HP as a substrate, it becomes possible to suppress the degradation of 3HP in culture, and 3HP productivity Can be improved.
  • modification to an enzyme gene catalyzing a reaction for producing acetyl CoA for example, introduction or modification of a foreign gene having an effect of increasing acetyl CoA production amount
  • acetyl CoA examples include introduction or modification of foreign genes that have the effect of reducing consumption.
  • a genetically modified strain in which a pyruvate dehydrogenase complex gene is highly expressed which produces acetyl-CoA using pyruvate as a substrate, or a host using a pyruvate dehydrogenase complex gene derived from an organism other than an organism used as a host A method of introducing and highly expressing, a method of using a gene-disrupted strain in which the PdhR gene is disrupted to control the expression of the pyruvate dehydrogenase complex gene, or a gene modification in which the expression amount of pyruvate dehydrogenase complex is increased due to a mutation in the PdhR gene. The method etc.
  • acetyl-CoA synthetase acetyl-CoA ligase
  • acetyl-CoA ligase acetyl-CoA ligase
  • the acetic acid consumption can be improved, the by-product amount of acetic acid can also be reduced.
  • a method of introducing phosphoketolase such as D-xylose-5-phosphate phosphoketolase and / or fructose-6-phosphate phosphoketolase and phosphotransacetylase can also be used. .
  • D-xylose-5-phosphate phosphoketolase is an enzyme that catalyzes a reaction that converts xylulose-5-phosphate to acetyl phosphate and glyceraldehyde 3-phosphate.
  • Fructose-6-phosphate phosphoketolase is an enzyme that catalyzes a reaction for converting fructose-6-phosphate to erythrose-4-phosphate and acetylphosphate.
  • phosphotransacetylase phosphotransacetylase
  • phosphotransacetylase is an enzyme that catalyzes a reaction of converting acetyl phosphate and CoA into acetyl CoA.
  • acetyl phosphate is synthesized by phosphoketolase (D-xylose-5-phosphate phosphoketolase and / or fructose-6-phosphate phosphoketolase), and the obtained acetyl phosphate is used as a raw material for Acetyl-CoA can be synthesized by transacetylase.
  • phosphoketolase D-xylose-5-phosphate phosphoketolase and / or fructose-6-phosphate phosphoketolase
  • transacetylase can be synthesized by transacetylase.
  • the amount of acetyl-CoA can be further increased by destroying an enzyme that catalyzes the acetaldehyde ⁇ ethanol pathway, such as the alcohol dehydrogenase gene.
  • an enzyme gene that catalyzes a reaction using pyruvate which is a precursor of acetyl CoA, as a substrate, for example, lactate dehydrogenase catalyzing a reaction of pyruvate ⁇ lactic acid, alanine dehydrogenase catalyzing a reaction of pyruvate ⁇ L alanine, pyruvine
  • lactate dehydrogenase catalyzing a reaction of pyruvate ⁇ lactic acid
  • alanine dehydrogenase catalyzing a reaction of pyruvate ⁇ L alanine pyruvine
  • an enzyme gene such as pyruvate carboxylase catalyzing the reaction of acid ⁇ oxaloacetate, pyruvate decarboxylase catalyzing the reaction of pyruvate ⁇ acetaldehyde, pyruvate oxidase catalyzing the reaction of pyruvate
  • acetyl-CoA it is also possible to increase the amount of acetyl-CoA in cells by destroying or weakening other metabolic pathways that consume acetyl-CoA.
  • a phosphoacylase gene that produces acetyl phosphate using acetyl-CoA as a substrate
  • a citrate synthase gene that synthesizes citric acid using acetyl-CoA and oxaloacetic acid as a substrate
  • an acetyl-CoA such as an acetaldehyde dehydrogenase gene that produces acetaldehyde using acetyl-CoA as a substrate
  • Examples include a gene-disrupted strain obtained by disrupting an enzyme gene catalyzing an enzyme reaction as a substrate, or a method using a mutant microorganism having a reduced enzymatic activity using the above-mentioned acetyl-CoA as a substrate.
  • TCA cycle modification to the citric acid cycle (TCA cycle), which is a metabolic pathway in which acetyl-CoA is most utilized, is also effective in increasing the amount of malonyl-CoA produced.
  • TCA cycle citric acid cycle
  • (1) utilization of a genetically modified strain or mutant strain in which the activity of each enzyme constituting the TCA cycle has become low, and (2) change of culture conditions such that the activity of each enzyme constituting the TCA cycle becomes low Can be mentioned.
  • the amount of acetyl-CoA which flows into a TCA cycle can be reduced, for example by culture
  • the acid-resistant microorganism is preferably S. Pombe. Therefore, according to the present invention, Schizosaccharomyces pombe contains a gene encoding foreign malonyl CoA reductase, a gene encoding foreign acetyl CoA carboxylase, and a gene encoding a foreign gene having an effect of increasing the amount of acetyl CoA produced. There is provided a genetically modified microorganism introduced with The foreign gene having the effect of increasing the amount of acetyl-CoA production is preferably a combination of a gene encoding phosphoketolase and a gene encoding phosphotransacetylase.
  • the phosphoketolase is preferably D-xylose-5-phosphate phosphoketolase and / or fructose-6-phosphate phosphoketolase, and D-xylose-5-phosphate phosphoketolase and It is more preferable that it is a phosphoketolase derived from Bifidobacterium genus bacteria, since it has both activities of fructose-6-phosphate phosphoketolase.
  • the foreign gene having the effect of increasing acetyl CoA production is a gene encoding fructose-6-phosphate phosphoketolase and a phosphotransacetylase It is preferable that it is a gene encoding (phosphotransacetylase).
  • acetyl-CoA carboxylase obtained by the gene is a mixture of acetyl-CoA as a substrate and marlonyl-CoA.
  • the term "functionally equivalent gene” means a biological function or biochemical equivalent to a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence represented by each SEQ ID NO of the protein encoded by the gene of interest It refers to having a function.
  • Stringent conditions are conditions under which a specific hybrid is formed and non-specific hybrids are not formed, that is, conditions under which DNA having high homology to each gene is hybridized. More specifically, such conditions involve hybridization at 42-68 ° C. in the presence of 0.5-1 M NaCl, or at 42 ° C. in the presence of 50% formamide, or at 65-68 ° C. in aqueous solution Then, the filter can be achieved by washing the filter at room temperature (20.degree. C.) to 68.degree. C. with a 0.1 to 2-fold concentration of SSC (saline sodium citrate) solution.
  • SSC saline sodium citrate
  • the target nucleotide sequence has at least 80% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% identity, still more preferably at least 99% identity
  • a gene consisting of a base sequence having identity can be hybridized with a gene consisting of a base sequence complementary to the target base sequence.
  • Each gene also includes a gene encoding a protein functionally equivalent to a protein consisting of each amino acid sequence.
  • a protein functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 And proteins showing the activity of malonyl CoA reductase.
  • the side chains of amino acids that are constituents of proteins differ from each other in hydrophobicity, charge, size, etc., but substantially affect the three-dimensional structure (also referred to as steric structure) of the entire protein.
  • three-dimensional structure also referred to as steric structure
  • glycine (Gly) and proline (Pro) glycine and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid ( Glu) and glutamine (Gln), aspartate (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), threonine and serine (Ser) or amino acids such as alanine, lysine (Lys) and arginine (Arg) Substitutions between are known.
  • the mutant protein consists of the amino acid sequence obtained as a result of deletion, addition, insertion or substitution of one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the mutation is SEQ ID NO: If the mutation is a highly conserved mutation in the three-dimensional structure of the amino acid sequence described in 1, and the mutant protein has an enzyme activity of producing 3HP using malonyl CoA as a substrate, these mutant proteins
  • the gene coding for is also included in the gene coding for malonyl CoA reductase.
  • severe is generally 2 to 5, preferably 2 to 3.
  • the gene encoding malonyl CoA reductase has at least 80% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 95% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 99% identity and having an activity of using malonyl CoA as a substrate to generate 3HP The same applies to the genes encoding other malonic acid semialdehyde dehydrogenase, 3-hydroxypropionate dehydrogenase, and acetyl-CoA carboxylase.
  • Schizosaccharomyces pombe NSH-2 (Accession number: FERM ABP-11527) (S. pombe (mcr)), Schizosaccharomyces pombe NSH-3 (Accession number: FERM ABP-11528) among the first genetically modified microorganisms described above It is particularly preferred to use (S. pombe (mcr, acc)).
  • a second genetically modified microorganism according to the present invention comprises: (a) a microorganism having acid resistance, which encodes a gene encoding foreign glycerol dehydratase, a gene encoding glycerol dehydratase reactivating factor, and foreign aldehyde dehydrogenase (A) a microorganism having acid resistance, which has a gene encoding a foreign diol dehydratase, a gene encoding a diol dehydratase reactivating factor, and a gene encoding a foreign aldehyde dehydrogenase Or (c) a microorganism having acid resistance, a gene encoding foreign glycerol dehydratase, a gene encoding glycerol dehydratase reactivation factor, a gene encoding foreign diol dehydratase, diol dehydratase
  • microorganism with acid resistance The microorganism having acid resistance is the same as the first genetically modified microorganism, and thus the description thereof is omitted here.
  • Schizosaccharomyces pombe itself has a metabolic pathway from glucose to glycerol, and glucose can be used for the production of 3HP, and the amount of glycerol produced can also be a general recombinant microorganism, for example, glycerol produced.
  • Glycerin dehydratase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction using glycerol as a substrate to produce 3-hydroxypropionaldehyde (3HPA).
  • the gene encoding foreign glycerin dehydratase which can be used is not particularly limited, and any known gene can be used.
  • genes derived from microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, Escherichia, and Listeria can be used.
  • the genes encoding glycerol dehydratase may be used alone or in combination of two or more.
  • a modified glycerin dehydratase modified by adding a point mutation to the above-mentioned glycerin dehydratase may be used.
  • Clostridium butyricum-derived GD which is a vitamin B12-independent GD, can also be used.
  • Glycerin dehydratase reactivating factor reverses coenzyme B12 of the reaction center portion of glycerin dehydratase inactivated by catalyzing the conversion reaction of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde, and regains the activity again Have a role. Therefore, when GDR is not introduced, the inactivated glycerol dehydratase is not reactivated, and glycerol dehydration activity can not be maintained, so that the dehydration activity of glycerol becomes very low. In some cases, no enzyme activity may be observed.
  • the second genetically modified microorganism essentially comprises a glycerin dehydratase reactivating factor together with a glycerin dehydratase.
  • GD-AE glycerol dehydratase activating enzyme
  • the gene encoding a glycerol dehydratase reactivating factor that can be used is not particularly limited, and any known gene can be used. See, for example, WO 98/21341; Daniel et al. , J. Bacteriol. , 177, 2151 (1995); Toraya and Mori, J. et al. Biol. Chem. , 274, 3372 (1999); and Tobimatsu et al. , J. Bacteriol. 181, 4110 (1999) and the like.
  • a glycerol dehydratase gene derived from a microorganism belonging to the genus Clostridium specifically, a glycerol dehydratase gene derived from Clostridium perfringens may be used.
  • the genes encoding the glycerol dehydratase reactivating factor may be used alone or in combination of two or more.
  • a glycerin dehydratase reactivating factor modified by adding a point mutation to the above glycerin dehydratase reactivating factor may be used.
  • Diol dehydratase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction using glycerol as a substrate to produce 3-hydroxypropionaldehyde (3HPA).
  • the gene encoding foreign diol dehydratase which can be used is not particularly limited, and any known gene can be used. Examples include a gene encoding a diol dehydratase derived from a microorganism belonging to the genus Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, and Listeria.
  • Lactobacillus reuteri Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillu sleichmannii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Enterobacter agglomerans, Clostridium butyricum, Caloramator viterbensis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and the like genes encoding the diol dehydratase derived from Listeria innocua and the like.
  • the genes encoding the diol dehydratase may be used alone or in combination of two or more.
  • a diol dehydratase modified by adding a point mutation to the diol dehydratase may be used.
  • Diol dehydratase reactivation factor (A gene encoding a diol dehydratase reactivating factor) Diol dehydratase reactivation factor (DDR) reverses coenzyme B12 in the reaction center of diol dehydratase inactivated by catalyzing the conversion reaction of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde, and regains the activity again Have a role. Therefore, when the DDR is not introduced, the inactivated diol dehydratase is not reactivated, and the dehydration activity of glycerin is extremely low because the activity of dehydration of glycerin can not be maintained. In some cases, no enzyme activity may be observed.
  • DDR Diol dehydratase reactivation factor
  • the second genetically modified microorganism essentially comprises a diol dehydratase reactivating agent together with a diol dehydratase.
  • the gene encoding the diol dehydratase reactivating factor that can be used is not particularly limited, and any known gene can be used. For example, Kajiura H. et al. , J. Biol. Chem. , 276, 36 514 (2001), and the like.
  • the GD-GDR gene derived from a microorganism belonging to the genus Clostridium and the DD-DDR gene derived from a microorganism belonging to the genus Lactobacillus are used. It is preferable to use the GD-GDR gene derived from Clostridium perfringens, and the DD-DDR gene derived from Lactobacillus reuteri.
  • Aldehyde dehydrogenase is a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction of 3HPA as a substrate to produce 3-hydroxypropionic acid (3HP).
  • the gene encoding foreign aldehyde dehydrogenase which can be used is not particularly limited, and any known gene can be used.
  • Escherichia, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Flavobacterium, Klebsiella, Micrococcus, Protinobacter, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Staphycobacterium Included are genes encoding aldehyde dehydrogenases derived from microorganisms belonging to the genera Shigella, Erwinia, Neisseria, and Lactobacillus.
  • Escherichia coli Aerobacter aerogenes, Agrobacterium radiobacteria, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes viscolactis, Arthrobacter simplex, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Corynebacterium equi, Flavobacterium sp.
  • Klebsiella pneumonia Micrococcus glutamicus, Protaminobacter alboflavus, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Erwinia carotovora, Neisseria meningitides, Neisseria gonorr hoeae, Lactobacillus reuteri, Schizosaccharomyces pombe, Al derived from the Azospirillum brasilense Gene encoding hydrate dehydrogenase and the like.
  • enzyme genes derived from Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, and Azospirillum brasilense are preferably used, and it is more preferable to use the aldH gene derived from Escherichia coli.
  • ⁇ -glutamyl- ⁇ -aminobutyraldehyde dehydrogenase ⁇ -ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase ( ⁇ -ketoglutaric semidehydrogenase) and the like can also be used.
  • a microorganism having acid resistance, modification of a gene encoding an enzyme In order to increase the amount of 3HP produced by fermentation by the second genetically modified microorganism, modification of a gene encoding an acid-resistant microorganism or enzyme may be performed. Specifically, modification of a gene associated with at least one selected from the group consisting of glucose, glycerin, 3HPA, and 3HP can be mentioned.
  • the above modification can be performed by the same method as the method described in the first genetically modified microorganism.
  • Schizosaccharomyces pombe NSH-1 S. Pombe OB1 (GD, GDR, aldH)
  • Schizosaccharomyces pombe NSH-1 S. Pombe OB1 (GD, GDR, aldH)
  • a gene encoding an enzyme may be introduced into the genome, may be introduced into the same vector for transformation, or may be introduced into separate vectors for transformation.
  • a gene into a microorganism having acid resistance to be used as a host the above gene or a part thereof is linked to an appropriate vector, and the obtained recombinant vector is introduced into the host so that the desired gene can be expressed. Or by inserting a gene of interest or a part thereof at any position on the genome by homologous recombination.
  • the "portion" refers to a portion of each gene capable of expressing a protein encoded by each gene when introduced into a host, or capable of expressing a protein having a desired enzymatic activity.
  • genes include DNA and RNA, preferably DNA.
  • the vector to which the gene is linked is not particularly limited as long as it can be replicated in the host. Examples include plasmids, phages, cosmids and E. coli artificial chromosomes (BACs) used for foreign gene transfer. Examples of plasmids used for introducing foreign genes into E.
  • coli include pHSG398, pUC18, pBR322, pSC101, pUC19, pUC118, pUC119, pACYC117, pAUR224, pGPD, pBluescript II SK (+), pETDuet-1, pACYCDuet- 1, pCDFDuet-1, pRSFDuet-1, pCOLADuet-1, PinPoint Xa-1 (Promega) and the like, and examples of phages include ⁇ gt10, Charon 4A, EMBL-, M13mp18, M13mp19 and the like.
  • any plasmid that contains a promoter and a terminator used when expressing the foreign gene in yeast and a replication origin responsible for replication of the plasmid in yeast can be used. It is available. In addition, it may contain a 5 'untranslated region, a 3' untranslated region, and may also contain marker genes such as auxotrophic complementation markers and antibiotic resistance genes. Specifically, pART, pSM, REP3X, pSLF101, pAUR224, pDUAL, pDUAL2 etc. may be mentioned.
  • an appropriate expression promoter is connected upstream of the gene.
  • the expression promoter to be used is not particularly limited, and those skilled in the art may appropriately select a promoter capable of efficiently performing gene expression under culture conditions suitable for the host used and 3HP fermentation production.
  • T7 promoter lac promoter, trp promoter, trc promoter, ⁇ -PL promoter, tac promoter, T7 promoter, etc. which are generally used for foreign gene expression in E. coli, they are involved in nitric acid respiration from E.
  • Nar promoter region of the nitrate reduction gene narGHJI operon or the promoter region of the Frd gene which is a nitrate reductase gene of E. coli.
  • the Nar promoter region and the Frd promoter are promoters that receive gene expression induction under anaerobic conditions.
  • promoter regions such as glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene and 6-phosphofructokinase gene involved in glucose metabolism, and promoter regions such as glutamate decarboxylase gene involved in acid resistance mechanism in E. coli are also used. be able to.
  • promoters used for foreign gene expression in yeast nmt1 promoter, nmt41 promoter, nmt81 promoter, fbp1 promoter, inv1 promoter, ctr4 promoter, CaMV 35 S promoter, adh1 promoter, SV40 promoter, urg1 promoter, cytomegalovirus (CMV 2.) Promoter, efa1a-c promoter, tif51 promoter, cam1 promoter, promoter regions such as glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene involved in glucose metabolism and 6-phosphofructokinase gene can be used.
  • the method of gene disruption can use a well-known method. Specifically, a method (gene targeting method) for disrupting the gene using a vector (targeting vector) that causes homologous recombination at any position of the target gene, or a trap vector (promoter) at any position of the target gene Knockout cells, transgenic animals (including knockout animals), and the like in the art such as a method (gene trap method) for inserting the reporter gene (not having the gene) to destroy the gene and losing its function (gene trap method)
  • a method gene trap method for inserting the reporter gene (not having the gene) to destroy the gene and losing its function
  • a method of introducing a vector expressing an antisense cDNA of a gene to be disrupted or a method of introducing a vector expressing a double-stranded RNA of a gene to be disrupted into cells can also be used.
  • the vector include viral vectors, plasmid vectors and the like, and based on a conventional genetic engineering method, for example, Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. It can be prepared according to the basic document of Press (1989).
  • a commercially available vector can be cleaved with any restriction enzyme to incorporate a desired gene or the like for semi-synthesis.
  • the position at which the homologous substitution is to be performed or the position at which the trap vector is inserted is not particularly limited as long as it is a position which causes a mutation to abolish the expression of the target gene to be destroyed.
  • gene disruption system by homologous recombination using a combination protein, which is sold by Gene Bridge, is used, destruction of Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Serratia, or Citrobacter bacteria can be performed. It is possible to construct a gene disruption strain in which only the desired gene is selectively disrupted. Furthermore, by using TargeTron Gene Knockout System, which is a gene disruption system utilizing Group 2 introns sold by Sigma-aldrich, it is possible to use Escherichia coli, Staphylococcus, Clostridium, Lactococcus, Shigella, Salmonella, Clostridium, Francisella, Azospirillum, and the like. Gene disruption of Pseudomonas and Agrobacterium is also possible.
  • the method of introducing the vector into the host may be selected according to the host to be used, and is not particularly limited. For example, methods using calcium ion generally used for vector introduction, protoplast method, electroporation method, lithium acetate method and the like can be used.
  • the method of inserting the gene of interest at any position on the genome by homologous recombination is to insert the gene of interest together with the promoter into a sequence homologous to the sequence on the genome, and this nucleic acid fragment is electroporated or a cell of lithium acetate by the lithium acetate method. It can be carried out by introducing it inside to cause homologous recombination. At the time of introduction into the genome, a strain in which homologous recombination has occurred can be easily selected by using a nucleic acid fragment in which a target gene and a drug resistance gene are linked.
  • a gene linked with a drug resistance gene and a gene that functions lethally under a specific condition is inserted into the genome by the above-mentioned method by homologous recombination, and then the drug resistance gene is lethally added under a specific condition.
  • the target gene can also be introduced by homologous recombination in the form of replacing the
  • the method for selecting a recombinant microorganism into which a target gene has been introduced is not particularly limited, but a method capable of easily selecting only a recombinant microorganism into which a target gene has been introduced is preferable.
  • the method of producing the 3HP solution is produced by culturing the first recombinant microorganism or the second recombinant microorganism in the presence of malonyl CoA or glycerol, respectively, and the microorganism in the process of assimilating malonyl CoA or glycerol. It can be carried out by accumulating the 3HP in the culture solution.
  • the first genetically modified microorganism and the second genetically modified microorganism may be used in combination.
  • Malonyl CoA and glycerin Malonyl CoA and glycerin, which is a raw material of 3HP, may be added separately to the medium, or may be added to the culture medium, or a microorganism (including the first genetically modified microorganism, the second genetically modified microorganism) It may be prepared from
  • the method for preparing malonyl CoA and glycerin using a microorganism is not particularly limited, and known methods may be used.
  • Malonyl CoA is an important precursor in fatty acid synthesis and can be synthesized by many microorganisms.
  • a gene encoding the above-mentioned acetyl-CoA carboxylase can be introduced to prepare malonyl-CoA using acetyl-CoA as a substrate.
  • Acetyl-CoA is an important metabolic intermediate which is located at the entrance of the TCA cycle which is important for living organisms and which is produced in large quantities as a metabolic intermediate in the metabolism of various compounds.
  • malonyl CoA can be sourced by sugar alcohols, alcohols, fatty acids, carboxylic acids.
  • Microorganisms that can be used for preparation of malonyl-CoA are not particularly limited, and include Escherichia coli, Lactobacillus, Salmonella, Klebsiella, Propionibacterium, Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Streptomyces, Synechococcus, Sulfolobus, Thermolobus, Thermoplasma, Acetobacterium, Moorella, Chloroflexus, Metallosphaera, Acid anus genus, Alcaligenes sp., Thermomicrobium genus, Rhodobaca genus, Rhodospirillum spp., Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., and a microorganism belonging to the genus Pichia.
  • microorganisms which fermentatively produce glycerol there is no restriction
  • the microorganisms originally having the ability to produce glycerol from sugars in the above (1) and (2) are not particularly limited, and examples thereof include Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Torulaspora, Zygosaccharomyces, Candida Yeast belonging to etc. can be used.
  • Schizosaccharomyces Saccharomyces cerevisiae
  • Schizosaccharomyces pombe it is more preferable to use Schizosaccharomyces pombe
  • Schizosaccharomyces pombe it is more preferable to use Schizosaccharomyces pombe.
  • the expression promoter of the enzyme gene can be a high expression promoter, for example, in the case of yeast Method to change to GAP promoter, CMV promoter or nmt1 promoter, Method to increase copy number of enzyme gene in cell by cloning into a plasmid that can exist in multiple copies in cell, and introduce enzyme gene into host chromosome A method of increasing the copy number of the enzyme gene and the like by inserting it at a plurality of upper positions can be mentioned.
  • Specific examples of the method (2c) of culturing under hyperosmotic conditions include methods such as a method of culturing using a medium having high sugar concentration and / or salt concentration.
  • the enzyme required for producing glycerol from sugar is not particularly limited.
  • GDP glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • GFP glycerol Glycerol-3-phosphatase
  • dihydroxyacetone phosphatase catalyzing the reaction of converting dihydroxyacetone phosphate generated by glycolysis into dihydroxyacetone
  • glyceraldehyde glycerin
  • glycerin dehydrogenase which catalyzes a reaction of converting into
  • the gene encoding the enzyme necessary for producing glycerin from the above-mentioned sugar is not particularly limited, but as the gene encoding GDP, for example, a gene derived from a microorganism belonging to the genus Saccharomyces can be mentioned. Among these, it is preferable to use a gene derived from Saccharomyces cerevisiae.
  • the gene which codes GPP the gene derived from the microorganism which belongs to Saccharomyces genus, etc. are mentioned, for example. Among these, it is preferable to use a gene derived from Saccharomyces cerevisiae.
  • the malonyl CoA and glycerin are produced by one or more microorganisms which are brought into contact with the first and / or the second recombinant microorganism which performs fermentative production of 3HP even when added directly to the medium.
  • it is preferable it is preferable to impart the ability to produce malonyl CoA and / or glycerin to the first genetically modified microorganism and / or the second genetically modified microorganism.
  • the term "contacting" includes culturing a microorganism or a treated product thereof in the presence of a compound used as a raw material, and conducting a reaction using a treated product of the microorganism.
  • the treated product includes cells treated with acetone, toluene, etc., dead cells, freeze-dried cells, crushed cells, cell-free extract obtained by breaking cells, crude enzyme solution from which enzymes are extracted, and purification An enzyme etc. are mentioned.
  • bacterial cells, treated products, enzymes and the like immobilized on a carrier by a conventional method can also be used.
  • sugars that can be used general sugars that can be used in culture in the art can be used without limitation.
  • specific examples of sugars in this embodiment include sugars derived from biomass resources, and glucose, mannose, galactose, fructose, sorbose, sorbose, hexose such as tagatose, peninose such as arabinose, xylose, ribose, xylulose, ribulose , Maltose, sucrose, lactose, trehalose, starch, disaccharides and polysaccharides such as cellulose, sugar alcohols such as mannitol, xylitol and ribitol (but excluding glycerin), biomass derived from biomass saccharification products such as cellulose and lignocellulose Sugar etc. are mentioned.
  • glucose and / or xylose One of these sugars may be used alone, or two or more thereof may be used in combination, and
  • the reaction from malonyl CoA to 3HP is carried out using the first recombinant microorganism in the presence of malonyl CoA reductase, it is preferable to carry out the reaction under conditions of high NADPH.
  • the first gene recombinant microorganism may be one into which another foreign gene, for example, a gene encoding acetyl-CoA carboxylase has been introduced. This condition is preferably applied particularly when utilizing NADPH-dependent malonyl CoA reductase.
  • the gene encoding the NADPH-dependent malonyl CoA reductase includes, but is not particularly limited to, the gene encoding malonyl CoA reductase derived from Chloroflexus aurantiacus, Sulfolobus tokodaii.
  • microorganisms capable of generating more NADPH on metabolic pathways that assimilate compounds (such as glucose) used as raw materials and more It is preferable to use a genetically modified organism which has been metabolically modified to produce NADPH.
  • Microorganisms capable of producing more NADPH include microorganisms that highly express genes having an effect of increasing the amount of NADPH in cells.
  • the gene having the effect of increasing the amount of NADPH in the cells is not particularly limited, but glucose-6-phosphate dehydrogenase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, NADP-dependent glyceraldehyde-3- Examples include phosphate dehydrogenase (glyceride dehydrogenase 3-phosphate dehydrogenase, EC.1.2.1.9, EC.1.2.1.13, EC.1.2.1.59 etc.) genes and the like.
  • a genetically modified organism which has been metabolically modified to generate more NADPH a genetically modified organism into which the above three genes are introduced can also be used.
  • the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene and the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene are enzyme genes that catalyze an NADP-dependent reaction in the pentose phosphate pathway.
  • glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is an enzyme gene that catalyzes an NADP-dependent reaction in glycolysis, gluconeogenesis, carbon fixation and the like.
  • the reaction from malonyl-CoA to 3HP is carried out in the presence of malonyl-CoA reductase
  • the reaction from malonyl-CoA to 3HP is carried out according to It is preferable to carry out by using a microorganism that highly expresses the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Or the following reaction:
  • Transduction balance in cells can be controlled by introducing or highly expressing a transhydrogenase gene catalyzing C., and efficient 3HP fermentation production can also be performed.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase has the following reaction:
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein having an enzyme activity catalyzing C., and known proteins can be used.
  • the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene to be used is glucose originally possessed by the organism used as a host due to the ease of expression of the gene, the ease of synthesis of the enzyme protein synthesized by expression of the gene, etc. It is preferable to highly express the -6-phosphate dehydrogenase gene. For example, when E. coli is used as a host, a glucose-6-phosphate dehydrogenase gene from Escherichia coli is preferred.
  • SEQ ID NO: 19 to E.I The base sequence of the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene from E. coli is exemplified. As long as a protein containing an amino acid sequence derived from these nucleotide sequences has glucose-6-phosphate dehydrogenase activity, by changing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, one or several amino acids in the corresponding amino acid sequence Mutations such as deletion, substitution and addition may occur.
  • 6-phosphogluconate dehydrogenase has the following reaction:
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein having an enzyme activity catalyzing C., and known proteins can be used.
  • the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene to be used is originally possessed by an organism to be used as a host from the ease of expression of the gene, the ease of synthesis of the enzyme protein synthesized by expression of the gene, etc. It is preferable to highly express the phosphogluconate dehydrogenase gene. For example, when E. coli is used as a host, 6-phosphogluconate dehydrogenase from Escherichia coli is preferred.
  • SEQ ID NO: 20 to E.I The base sequence of the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene from E. coli is exemplified. As long as a protein containing an amino acid sequence derived from these nucleotide sequences has 6-phosphogluconate dehydrogenase activity, one or several amino acids in the corresponding amino acid sequence are deleted by alteration of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 Mutations such as deletion, substitution and addition may occur.
  • NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase has the following reaction:
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein having an enzyme activity catalyzing C., and known proteins can be used.
  • Specific examples of NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase include, for example, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase derived from Kluyveromyces lactis.
  • the gene encoding NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase derived from Kluyveromyces lactis may be introduced as a foreign gene into a microorganism such as S. pombe.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase and NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be used alone or as a mixture of two or more.
  • one or more of glucose-6-phosphate dehydrogenase, one or more of 6-phosphogluconate dehydrogenase and one or more of NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be used in combination.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-phosphogluconate dehydrogenase and NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase used in the method of the present invention are not particularly limited, and any known forms Is also applicable.
  • an enzyme protein itself purified from cells may be used, or glucose-6-phosphate dehydrogenase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in cells
  • combined by having expressed, the immobilization enzyme of the said enzyme, etc. can be utilized.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase have one or several amino acids in their amino acid sequences as long as they exhibit the enzyme activity. Mutations such as deletion, substitution and addition may occur.
  • organisms that use glucose-6-phosphate dehydrogenase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, and NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene as transgenic hosts to be transformed are acetyl-CoA Any organism that can biosynthesize malonyl CoA may be used, but a microorganism is preferred in consideration of ease of operation, versatility of a host that can be used, growth rate of the organism, and the like. The choice of host may be made depending on whether it has assimilability of the compound used as the raw material of 3HP.
  • an assimilability of a compound to be used as a raw material may be imparted to an organism having advantageous traits in 3HP fermentation production, such as high growth rate, high resistance to acid, and the like.
  • a microorganism having a 3 HP cycle may be used as a host for gene recombination.
  • the gene encoding malonyl-CoA reductase and the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene, the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene and / or the NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase are the same host (although they may be transformed into one recombinant microorganism) or into different hosts, it is preferable to be transformed into the same host.
  • the reaction of acetyl CoA ⁇ malonyl CoA ⁇ 3 HP is performed in one host (for example, the first genetically modified microorganism), and thus the above reaction proceeds efficiently.
  • transformed hosts can be cultured under optimal culture conditions.
  • efficient transfer of oxidizing power (NAD, NADP) and reducing power (NADH, NADPH) required for each enzyme reaction is carried out by performing an enzyme reaction with each enzyme gene in one cell. It has the advantage of being able to improve 3HP productivity.
  • metabolic modification such that more NADPH is generated in a metabolic pathway that uses a compound as a raw material, or genetic modification for controlling the redox balance in cells were described.
  • any metabolically modified or mutant strain that produces the same effect can be used as a recombinant host of the method of the present invention.
  • the acid-resistant microorganism is preferably S. Pombe. Therefore, according to the present invention, Schizosaccharomyces pombe is encoded with a gene encoding foreign malonyl CoA reductase, a gene encoding foreign acetyl CoA carboxylase, and an exogenous gene having an effect of increasing the amount of NADPH in cells. There is provided a genetically modified microorganism into which a gene has been introduced.
  • the exogenous gene having an effect of increasing the amount of NADPH in the cell is glucose-6-phosphate dehydrogenase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene It is more preferable that the gene is an NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene, and more preferably a gene encoding NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase derived from Kluyveromyces lactis.
  • Schizosaccharomyces pombe a gene encoding foreign malonyl CoA reductase, a gene encoding foreign acetyl CoA carboxylase, a gene encoding a foreign gene having an effect of increasing the amount of NADPH in cells, and acetyl in cells It is also possible to use a genetically modified microorganism into which a gene encoding a foreign gene having an effect of increasing CoA production has been introduced.
  • a gene encoding foreign malonyl-CoA reductase a gene encoding foreign acetyl-CoA carboxylase, foreign NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, foreign fructose
  • the microorganism is a gene into which a gene encoding -6-phosphate phosphoketolase and a gene encoding a foreign phosphotransacetylase have been introduced.
  • the culture medium and culture conditions used for the culture may be selected according to the growth conditions of the microorganism, and in addition to the above-mentioned sugars, use a common culture medium containing a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace nutrients as needed.
  • a common culture medium containing a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace nutrients as needed.
  • E. coli when E. coli is used as a host microorganism, LB medium can be exemplified, and when yeast is used as a host microorganism, YPD medium, YES medium, EMM medium, etc. can be exemplified.
  • the culture may be performed under conditions suitable for the growth of the microorganism, and is not particularly limited.
  • the culture temperature is more than 20 ° C. and less than 37 ° C., more preferably 22 to 35 ° C., and still more preferably in consideration of the production efficiency of 3HP. 25 to 30 ° C.
  • E. coli is used as the host microorganism
  • the 3HP generation efficiency can be improved if the recombinant microorganism is cultured in a temperature region lower than the general culture temperature.
  • the results of experiments using E. coli as a host microorganism are shown in the following examples. It can be seen that the generation efficiency of 3HP is higher in the case of 25 ° C.
  • the culture time is also not particularly limited, but preferably 10 to 100 hours, more preferably 15 to 60 hours.
  • the pH in the culture of the microorganism is not particularly limited as long as 3HP can be efficiently produced by fermentation.
  • the production of a fermentation product continues even at a low pH, it is possible to culture without adding an alkaline reagent to adjust the pH to around neutral.
  • culture is started from the pH of the culture medium used (near neutral) at the start of culture, but the pH of the culture medium is gradually lowered as 3HP is produced.
  • the carbon source in the medium is assimilated and the 3HP production continues even if the pH of the medium is lowered to pH 3 or less, for example, around pH 1.
  • the pH of the medium is less than 4.
  • 3HP having a growth inhibitory activity of a microorganism which is about 1.4 times higher than lactic acid is cultured without adding an alkaline reagent in the fermentation step to obtain a 3HP fermented solution having a pH of less than 4.
  • the pH may be adjusted to an appropriate range in consideration of the growth of microorganisms, pKa (4.5) of 3HP, and the like.
  • a method of adjusting pH there is a method of adding an alkaline substance to a culture solution as needed during fermentation, a method of using a medium having a buffer action, and the like.
  • an alkaline reagent such as sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, ammonium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, potassium acetate aqueous solution etc. is generally used.
  • Alkaline reagents can be used.
  • calcium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, ammonium carbonate, ammonia, hydroxide is previously used as the culture medium used for fermentation. The method of using the culture medium which added ammonium etc. is mentioned.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as a nitrogen source suitable for the growth of the microorganism to be used is selected.
  • a nitrogen source suitable for the growth of the microorganism to be used is selected.
  • ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate
  • peptone such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate
  • inorganic substances are not particularly limited as long as nitrogen sources suitable for the growth of microorganisms are selected.
  • potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like can be mentioned.
  • antibiotics such as kanamycin, ampicillin, streptomycin, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin, G418, hygromycin B, aureobasidin A, streptolysin, blastcidin, phleomycin may be added to the medium .
  • an inducer can also be added to the medium. For example, isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), indole acetic acid (IAA), arabinose, lactose, etc. can be added to the medium.
  • bacteria are collected from the culture of the organism obtained in the above by centrifugation or the like, and suspended in an appropriate buffer or medium.
  • 3-hydroxypropionic acid can also be produced by suspending this bacterial cell suspension in a buffer containing malonyl-CoA and / or acetyl-CoA and carrying out a reaction with the bacterial cells.
  • the reaction conditions are, for example, a reaction temperature of 10 to 80 ° C., preferably 15 to 50 ° C., a reaction time of 5 minutes to 96 hours, preferably 10 minutes to 72 hours, and a pH of 5.0 or more, preferably 5.
  • reaction conditions are not particularly limited as long as the reaction conditions are suitable for 3HP production.
  • the reaction is carried out continuously, the reaction is carried out for 1 week to 3 months.
  • the 3HP-containing solution to be subjected to the purification step of 3HP has a concentration of 3HP of preferably 90 g / L or more, more preferably 100 g / L or more, and still more preferably 100 to 300 g / L. It is preferred to use.
  • 3-hydroxypropionic acid can be obtained from the culture medium by subjecting the reaction mixture to extraction with an organic solvent, distillation and column chromatography (US Pat. No. 5,356,812). Further, it is preferable to concentrate the fermentation broth with an ultrafiltration membrane or a zeolite separation membrane or the like which allows only low molecules such as water to permeate. By performing concentration, energy for evaporating water can be reduced.
  • 3-hydroxypropionic acid can also be identified directly by subjecting the medium to high performance liquid chromatography (HPLC) analysis.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the production amount of 3-hydroxypropionic acid can be improved by using the first and / or the second recombinant microorganism. Also, since 3-hydroxypropionic acid is obtained in the form of acid, 3-hydroxypropionic acid can be more easily and in high yield as compared with the method of adding a conventional alkaline reagent obtained in the form of 3HP salt. Can be refined.
  • the 3-hydroxypropionic acid produced by the method of the present invention can be used in various fields.
  • acrylic acid can be produced by dehydrating 3-hydroxypropionic acid obtained by the above method. That is, the present invention also provides a process for producing acrylic acid comprising dehydrating 3-hydroxypropionic acid produced by the process of the present invention.
  • the dehydration of 3-hydroxypropionic acid can be carried out by a known reaction.
  • 3-hydroxypropionic acid can be easily converted to acrylic acid by vacuum distillation in the presence of a catalyst.
  • composition containing acrylic acid obtained by the method of the present invention may be purified, and in the case of purification, preferably, a crystallization step is used. Therefore, the present invention also provides a production method for purifying acrylic acid produced by the method of the present invention by a purification step such as crystallization to obtain purified acrylic acid.
  • the crystallization step is a step of obtaining purified acrylic acid by supplying a composition containing acrylic acid to a crystallizer for crystallization.
  • a method of crystallization a conventionally known crystallization method may be adopted, and it is not particularly limited.
  • the crystallization may be carried out using a continuous or batch type crystallization apparatus 1 It can be implemented in stages or two or more stages.
  • the crystals of acrylic acid thus obtained can be further purified, if necessary, by purification such as washing and perspiration to obtain purified acrylic acid of higher purity.
  • a crystallization apparatus in which a crystallization part, a solid-liquid separation part and a crystal purification part are integrated (for example, BMC (Backmixing Column Crystallizer) manufactured by Nippon Steel Chemical Co., Ltd., Tsukishima Continuous melting and refining system manufactured by Kabushiki Kaisha, Crystallizing section (for example, CDC (Cooling Disk Crystallizer) apparatus manufactured by GMF GOUDA), solid-liquid separation section (for example, centrifugal separator, belt filter) and crystal refining section (for example, a crystallization apparatus combined with a KCP (Kureha Crystal Purifier) purification apparatus manufactured by Toha Techno-Engine Co., Ltd. can be used.
  • BMC Backmixing Column Crystallizer
  • Crystallizing section for example, CDC (Cooling Disk Crystallizer) apparatus manufactured by GMF GOUDA
  • solid-liquid separation section for example, centrifugal
  • a layer crystallization apparatus (dynamic crystallization apparatus) manufactured by Sulzer Chemtech, a static crystallization apparatus manufactured by BEFS PROKEM, etc. can be used.
  • dynamic crystallization for example, a tubular crystallizer equipped with a temperature control mechanism for crystallization, sweating, and melting, a tank for recovering mother liquor after perspiration, and crude acrylic acid supplied to the crystallizer
  • a dynamic crystallization apparatus which is equipped with a circulation pump and can transfer crude acrylic acid to the upper part of the pipe of the crystallizer from the storage provided at the lower part of the crystallizer by the circulation pump.
  • static crystallization is, for example, a tubular crystallizer equipped with a temperature control mechanism for performing crystallization, sweating, and melting, and recovers a crystallizer having a withdrawal valve at the bottom, and mother liquor after sweating. Crystallization using a static crystallization apparatus equipped with
  • crude acrylic acid is introduced into the crystallizer as a liquid phase, and the acrylic acid in the liquid phase is solidified and generated on the cooling surface (tube wall surface).
  • the mass of the solid phase formed on the cooling surface is preferably 10 to 90% by mass, more preferably 20 to 80% by mass with respect to the crude acrylic acid introduced to the crystallizer, the liquid phase is crystallized immediately And separate the solid and liquid phases.
  • the discharge of the liquid phase may be either of a pumping method (dynamic crystallization) or a method of flowing out of a crystallizer (static crystallization).
  • purification such as washing or sweating may be performed to further improve the purity.
  • the number of crystallization stages required depends on how much purity is required, but the number of stages required to obtain high purity acrylic acid is usually 1 to 6 purification stages (dynamic crystallization). , Preferably 2 to 5 times, more preferably 2 to 4 times, and the stripping step (dynamic crystallization and / or static crystallization) is usually 0 to 5 times, preferably 0 to 3 times.
  • all the steps to obtain acrylic acid having higher purity than the crude acrylic acid supplied are all purification steps and all other steps are stripping steps.
  • the stripping step is carried out to recover the acrylic acid contained in the remaining mother liquor from the purification step.
  • the stripping step is not necessarily required. For example, when the low boiling point component is separated from the remaining mother liquor of the crystallizer using a distillation column, the stripping step may be omitted.
  • the crystals of acrylic acid obtained in the crystallization step may be used as products as they are, or, if necessary, such as washing or sweating.
  • the product may be purified after purification.
  • the residual mother liquor discharged in the crystallization step may be taken out of the system.
  • the acrylic acid produced by the above method can be used as a raw material for acrylic acid derivatives such as polyacrylic acid, so the method for producing acrylic acid in the method for producing acrylic acid derivative is used. It is also possible to use an acrylic acid production process. That is, in one embodiment, the acrylic acid obtained by the above method is partially neutralized to produce partially neutralized acrylic acid, and this is subjected to (co) polymerization with other monomers if necessary. Resin can be produced.
  • the present invention comprises partially neutralizing acrylic acid produced by the method of the present invention to produce partially neutralized acrylic acid, and copolymerizing said partially neutralized acrylic acid with a crosslinkable monomer, water absorption
  • a method of making the above partial neutralization and (co) polymerization can be carried out by a known reaction, for example, acrylic acid and / or a salt thereof obtained by the production method of the present invention as a main component of the monomer component (Preferably 70 mol% or more, more preferably 90 mol% or more), and further 0.001 to 5 mol% (value relative to acrylic acid) of a crosslinking agent, 0.001 to 2 mol% (relative to the monomer component)
  • a cross-linked polymerization is carried out using a radical polymerization initiator of about (value), and then dried and pulverized to obtain a water-absorbent resin.
  • the water-absorbent resin is a water-swellable water-insoluble polyacrylic acid having a cross-linked structure, which absorbs pure water or physiological saline at least 3 times, preferably 10 to 1,000 times its own weight. Also, it means polyacrylic acid which forms a water-insoluble hydrogel in which the water-soluble component (water-soluble component) is preferably 25% by mass or less, more preferably 10% by mass or less. Specific examples and physical property measuring methods of such a water absorbent resin are described, for example, in US Pat. No. 6,107,358, US Pat. No. 6,174,978, US Pat. No. 6,241,928, etc. ing.
  • Preferred production methods from the viewpoint of improving productivity are, for example, US Pat. Nos. 6,867,269, 6,906,159, 7,091,253, WO 01 / No. 038402, and WO 2006/034806.
  • a series of processes for producing a water absorbent resin by neutralization, polymerization, drying and the like using acrylic acid as a starting material are, for example, as follows.
  • Part of the acrylic acid obtained by the production method of the present invention is supplied to the production process of the water absorbent resin through a line.
  • acrylic acid is introduced into the neutralization step, the polymerization step, and the drying step, and a desired treatment is performed to produce a water-absorbent resin.
  • a desired treatment may be applied for the purpose of improving various physical properties, and for example, a crosslinking step may be interposed during or after polymerization.
  • the neutralization step is an optional step, and for example, a method of mixing a predetermined amount of powder or aqueous solution of a basic substance and acrylic acid or polyacrylic acid (salt) may be exemplified. It may be adopted and is not particularly limited.
  • the neutralization step may be performed either before or after polymerization, or may be performed both before and after polymerization.
  • a basic substance used for neutralization of acrylic acid and polyacrylic acid (salt) for example, conventionally known basic substances such as carbonate (hydrogen) salts, hydroxides of alkali metals, ammonia, organic amines, etc. It may be used.
  • the neutralization rate of polyacrylic acid is not particularly limited, and may be adjusted to be an arbitrary neutralization rate (for example, an arbitrary value in the range of 30 to 100 mol%).
  • the polymerization method in the polymerization step is not particularly limited, and conventionally known polymerization methods such as polymerization by radical polymerization initiator, radiation polymerization, polymerization by irradiation of electron beam or active energy ray, ultraviolet polymerization by photosensitizer, etc. Should be used. Further, various conditions such as a polymerization initiator and polymerization conditions can be arbitrarily selected. Of course, if necessary, conventionally known additives such as crosslinking agents and other monomers, as well as water-soluble chain transfer agents and hydrophilic polymers may be added.
  • the polymerized acrylate-based polymer i.e., water-absorbent resin
  • the drying method is not particularly limited, and using a conventionally known drying means such as a hot air dryer, a fluidized bed dryer, a Nauta dryer, etc., at a desired drying temperature, preferably 70 to 230 ° C. It may be dried appropriately.
  • the water-absorbent resin obtained through the drying step may be used as it is, or may be used after granulation / grinding or surface crosslinking into a desired shape, and may be conventionally known, such as a reducing agent, a fragrance, a binder, etc. You may use, after performing the post-process according to a use, such as adding an additive.
  • an acrylic ester can be produced by reacting the acrylic acid produced by the method described above with an alcohol for esterification.
  • the present invention provides a process for the production of acrylic esters comprising esterifying the acrylic acid produced by the process of the present invention.
  • the esterification is a reaction of dehydration condensation of the carboxy group of acrylic acid with the hydroxyl group of alcohol.
  • the esterification reaction is not particularly limited, and known techniques can be appropriately adopted, but it is preferable to carry out the esterification reaction in the presence of a catalyst.
  • the alcohol may be appropriately selected according to the desired acrylic ester.
  • Specific examples of the alcohol include lower aliphatic alcohols having 1 to 4 carbon atoms and alicyclic alcohols having 3 to 6 carbon atoms.
  • the catalyst is not particularly limited, and examples thereof include strongly acidic cation exchange resins.
  • strongly acidic cation exchange resins include C-26C (made by duolite), PK-208, PK-216, PK-228 (all are Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), MSC-1 88 (manufactured by Dow), Amber List 16 (manufactured by Rohm and Haas), SPC-108, SPC-112 (all manufactured by Bayer), and the like.
  • an additive such as a polymerization inhibitor may be added.
  • the polymerization inhibitor is not particularly limited, but quinones such as hydroquinone and methoquinone (p-methoxyphenol); phenothiazine, bis- ( ⁇ -methylbenzyl) phenothiazine, 3,7-dioctylphenothiazine, bis- ( ⁇ - Phenothiazines such as dimethylbenzyl) phenothiazine; 2,2,6,6-tetramethyl piperidino oxyl, 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl piperidino oxyl, 4,4 ′, 4 ′ ′ N-oxyl compounds such as -tris- (2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxyl) phosphite; copper dialkyldithiocarbamate, copper acetate, copper naphthenate, copper acrylate, copper sulfate, copper nitrate, Copper salt compounds such as copper chloride; manganese dialkyldithiocarbamates,
  • the esterification can usually be carried out in the liquid phase.
  • the reaction temperature of esterification is usually in the range of 50 ° C. to 110 ° C. although it varies depending on the reaction.
  • acrylic acid ester resin can be manufactured by performing the polymerization reaction which uses the acrylic acid ester manufactured above as a monomer component.
  • the present invention also provides a process for the production of acrylic ester resins, which comprises polymerizing the monomer components comprising acrylic esters produced by the process of the present invention.
  • An acrylic ester resin can be produced by polymerizing a monomer component containing an acrylic ester and any other monomer by a known polymerization method.
  • Examples of the other monomers include (meth) acrylic acid and esters and amides thereof.
  • a desired polymer can be obtained by combining and polymerizing these monomers.
  • the polymerization method is not particularly limited, and known methods such as solution polymerization, suspension polymerization, emulsion polymerization and bulk polymerization can be used.
  • acrylic resin resins having various properties are obtained by designing based on the formula of FOX with the glass transition temperature of the homopolymer of each monomer component as an index. be able to.
  • the acrylic ester resin thus obtained can be used in various applications such as pressure-sensitive adhesives, dispersants, adhesives, films, sheets, and paints.
  • the invention also relates to a composition for producing 3-hydroxypropionic acid from malonyl-CoA and / or acetyl-CoA, comprising malonyl-CoA reductase activity and / or acetyl-CoA carboxylase activity.
  • the composition can be produced from an organism producing these enzymes or a processed product thereof.
  • Example 1 Acid resistance test of Schizosaccharomyces pombe OB2
  • acidic medium (3HP added YES liquid medium) containing 3-hydroxypropionic acid (3HP)
  • S. pombe OB2 contained 3HP and was able to produce a metabolite under acidic conditions was examined .
  • an acidic medium containing 3HP (3HP-added YES liquid medium) was prepared as follows. Specifically, 3-hydroxypropionic acid (3HP) reagent (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) is added to the YES liquid culture medium to a final concentration of 120 g / L, and 3HP added YES liquid culture medium of pH 2.6 (3HP concentration of 3HP reagent converted as 200 g / L).
  • 3-hydroxypropionic acid (3HP) reagent manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • 3HP added YES liquid culture medium of pH 2.6 3HP concentration of 3HP reagent converted as 200 g / L.
  • Example 2 Acid resistance test of Kluyveromyces marxianus ATCC 524866
  • an acidic medium (3 HP added YM liquid medium) containing 3-hydroxypropionic acid (3 HP)
  • K. marxianus ATCC 52486 contains 3 HP and can be grown under acidic conditions.
  • yeast extract 3 g / L
  • Malt extract 3 g / L
  • glucose 10 g / L
  • peptone 5 g / L
  • an acidic medium (3 HP added YM liquid medium) containing 3 HP was prepared as follows. Specifically, 3HP reagent (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the YM liquid medium to a final concentration of 120 g / L to obtain 3HP added YM liquid medium of pH 2.4 (3HP reagent 3HP concentration converted as 200 g / L).
  • 3HP reagent manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • K. marxianus ATCC 52486 can be grown in an acidic medium containing 3 HP was examined by the following method. That is, the whole amount of the bacterial cell pellet obtained above was suspended in 5 mL of 3 HP added YM liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. for 96 hours. The obtained culture broth was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the supernatant of the culture broth was collected. The supernatant was diluted 10-fold with 5 mM sulfuric acid and then passed through a 0.45 ⁇ m filter to give a liquid chromatography (LC) analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below.
  • LC liquid chromatography
  • Example 3 Construction of various plasmids
  • Example 3-1 Construction of pADH
  • the construction of plasmid pADH (G418R-adh1-nmt1 / pUC18) in which the adh1 fragment, the G418R fragment and the nmt1 fragment were introduced into pUC18 was carried out. Details are shown below.
  • the plasmid map of pADH is shown in FIG.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an Alchol dehydrogenase peripheral region fragment (adh1 fragment).
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pUC18 fragment.
  • adh1 fragment and the pUC18 fragment obtained by the PCR amplification described above cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct adh1 / pUC18.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an adh1 / pUC18 fragment.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes), and a G418 resistant gene fragment (G418R fragment) was obtained.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a G418R-adh1 / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct G418R-adh1-nmt1 / pUC18.
  • Example 3-2 Construction of pGPD
  • the construction of plasmid pGPD (G418R-gpd1-nmt1 / pUC18) in which the gpd1 fragment, the G418R fragment and the nmt1 fragment were introduced into pUC18 was carried out. Details are shown below.
  • the plasmid map of pGPD is shown in FIG.
  • a PCR amplification was carried out using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of S. pombe strain OB2 as a template, and the Glycerol-3-phosphate dehydrogenase peripheral region fragment (gpd1 fragment) Obtained.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pUC18 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct gpd1 / pUC18.
  • the plasmid DNA of gpd1 / pUC18 was subjected to PCR amplification using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a gpd1 / pUC18 fragment.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes), and a G418 resistant gene fragment (G418R fragment) was obtained.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct G418R-gpd1 / pUC18.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of G418R-gpd1 / pUC18 as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a G418R-gpd1 / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct G418R-gpd1-nmt1 / pUC18.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pUC18 fragment.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes), and a G418 resistant gene fragment (G418R fragment) was obtained.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct G418R / pUC18.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of G418R / pUC18 as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a G418R / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pAUR224 fragment.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of pEBMulti-Hyg (Wako Pure Chemical Industries) as a template, and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes), and the hygromycin B-resistant structural gene fragment (HygR_ORF fragment Got).
  • HygR / pAUR224 was constructed.
  • HygR fragment a hygromycin B resistant gene fragment
  • PCR amplification was carried out using the plasmid DNA of G418R-HygR / pUC18 as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a G418R-HygR / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct G418R-HygR-nmt1 / pUC18.
  • Example 3-4 Construction of pHYG
  • plasmid pHYG HygR-AbAR-nmt1 / pUC18
  • HygR, AbAR, and nmt1 fragments were introduced into pUC18. Details are shown below.
  • the plasmid map of pHYG is shown in FIG.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pUC18 fragment.
  • HygR fragment a hygromycin B resistant gene fragment
  • HygR / pUC18 Using the pUC18 fragment and the HygR fragment obtained by the PCR amplification described above, cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct HygR / pUC18.
  • HygR / pUC18 plasmid DNA of HygR / pUC18 as a template
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a HygR / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of pAUR224 (Takara) as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an aureobasidin A resistant gene fragment (AbAR fragment) .
  • HygR / pUC18 fragment and AbAR fragment obtained by the PCR amplification described above cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct HygR-AbAR / pUC18.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of HygR-AbAR / pUC18 as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a HygR-AbAR / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 fragment.
  • HygR-AbAR / pUC18 fragment and the nmt1 fragment obtained by PCR amplification described above cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct HygR-AbAR-nmt1 / pUC18.
  • Example 3-5 Construction of pAUR
  • the construction of the plasmid pAUR (leu2-AbAR-nmt1 / pUC18) was carried out in which the AbAR fragment, the leu2 fragment and the nmt1 fragment were introduced into pUC18. Details are shown below.
  • the plasmid map of pAUR is shown in FIG.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of pAUR224 (Takara) as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an aureobasidin A resistant gene fragment (AbAR fragment) .
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an AbAR / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of REP3X (ATCC 87603) as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a beta-isopropyl-malate dehydrogenase fragment (leu2 fragment).
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a leu2-AbAR / pUC18 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 fragment.
  • Example 4 Cloning of foreign genes into various vectors
  • Example 4-1 Construction of CP_GD_ ⁇ / pADH
  • GD glycerol dehydrogenase
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of CP strain as a template to obtain an ⁇ subunit fragment of GD (CP_GD_ ⁇ fragment).
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pADH fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GD_ ⁇ / pADH in which the CP_GD_ ⁇ fragment was inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • Example 4-2 Construction of CP_GD_ ⁇ / pADH
  • the ⁇ subunit of glycerol dehydrogenase (GD) from Clostridium perfringens ATCC 13124 (CP) strain was introduced into pADH to construct CP_GD_ ⁇ / pADH. Details are shown below.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of CP strain as a template to obtain a ⁇ subunit fragment of GD (CP_GD_ ⁇ fragment).
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pADH fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GD_ ⁇ / pADH in which the CP_GD_ ⁇ fragment was inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • Example 4-3 Construction of CP_GD_ ⁇ / pG4108
  • the ⁇ subunit of glycerol dehydrogenase (GD) from Clostridium perfringens strain ATCC 13124 (CP) was introduced into pG418 to construct CP_GD_ ⁇ / pG418. Details are shown below.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of CP strain as a template to obtain a ⁇ subunit fragment of GD (CP_GD_ ⁇ fragment).
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of pG418 as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pG418 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GD_ ⁇ / pG418 in which the CP_GD_ ⁇ fragment was inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • Example 4-4 Construction of CP_GD_ ⁇ and ⁇ / pG418)
  • GD glycerol dehydrogenase
  • CP Clostridium perfringens strain ATCC 13124
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the plasmid DNA of CP_GD_ ⁇ / pADH as a template to obtain Glycerol dehydratase ⁇ subunit expression cassette fragment (CP_GD_ ⁇ expression cassette fragment)
  • Finnzymes Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a CP_GD_ ⁇ / pG418 necessary region fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GD_ ⁇ and ⁇ / pG418.
  • Example 4-5 Construction of CP_GDR_L / pHYG
  • the L (Large) subunit of glycerol dehydrogenase reactivating factor (GDR) from Clostridium perfringens strain ATCC 13124 (CP) was introduced into pHYG to construct CP_GDR_L / pHYG. Details are shown below.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of the CP strain as a template to obtain an L subunit fragment (CP_GDR_L fragment) of GDR.
  • pHYG plasmid DNA As a template, PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pHYG fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GDR_L / pHYG in which the CP_GDR_L fragment was inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • Example 4-6 Construction of CP_GDR_S / pADH
  • S (Small) subunit of glycerol dehydrogenase reactivating factor (GDR) derived from Clostridium perfringens strain ATCC 13124 (CP) was introduced into pHYG to construct CP_GDR_S / pADH. Details are shown below.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of the CP strain as a template to obtain an S subunit fragment (CP_GDR_S fragment) of GDR.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pADH fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GDR_S / pADH in which the CP_GDR_S fragment was inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • CP_GDR_LandS / pHYG was constructed by introducing L (Large) subunit and S (Small) subunit of glycerol dehydrogenase reactivating factor (GDR) from Clostridium perfringens strain ATCC 13124 (CP) into pHYG. Details are shown below.
  • a PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the plasmid DNA of CP_GDR_S / pADH as a template, and Glycerol dehydratase factor subunit subunit expression cassette fragment (CP_GDR_S expression cassette fragment Got).
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a CP_GDR_L / pHYG required region fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CP_GDR_LandS / pHYG.
  • aldH ⁇ -glutamyl- ⁇ -aminobutyraldehyde dehydrogenase derived from Escherichia coli W3110 (E. coli) strain was introduced into pAUR to construct aldH / pAUR. Details are shown below.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of E. coli strain as a template to obtain an aldH fragment.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pAUR fragments.
  • aldH and pAUR fragments obtained by the above PCR amplification were cloning performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct aldH / pAUR having the aldH fragment inserted downstream of the nmt1 promoter .
  • Example 5 Preparation of DNA fragment used for transformation
  • Example 5-1 Preparation of G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ )
  • the G418R-nmt1 promoter was prepared from CP-GD_ ⁇ / pADH.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) with the plasmid DNA of CP-GD_ ⁇ / pADH as a template to obtain G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ )
  • Finnzyme Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
  • Example 5-2 Preparation of HygR-nmt1 Promoter (GD_ ⁇ and ⁇ )
  • the G418R-nmt1 promoter was prepared from CP-GD_ ⁇ and ⁇ / pG418.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) with the plasmid DNA of CP-GD_ ⁇ and ⁇ / pG418 as a template to obtain the HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ )
  • Finnzyme Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
  • Example 5-3 Preparation of AbAR-nmt1 Promoter (GDR_S)
  • the AbAR-nmt1 promoter was prepared from CP-GDR_LandS / pHYG.
  • PCR amplification is performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme Finnzyme) with the plasmid DNA of CP-GDR_LandS / pHYG as a template to obtain the AbAR-nmt1 promoter (GDR_LandS)
  • Prusion High-Fidelity DNA Polymerase Framogenzyme
  • GDR_LandS AbAR-nmt1 promoter
  • Example 5-4 Preparation of Leu2-nmt1 promoter (aldH)
  • the Leu2-nmt1 promoter was prepared from aldH / pAUR.
  • PCR amplification was performed using plasmid DNA of aldH / pAUR as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain Leu2-nmt1 promoter (aldH).
  • Example 6 Transformation
  • Example 6-1 Preparation of S. pombe OB1 (GD_ ⁇ )
  • the G418 R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ ) prepared in Example 5-1 above was transformed into Schizosaccharomyces pombe OB1 to prepare S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ). Details are shown below.
  • the G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ ) was introduced into the cultured S. pombe OB1. More specifically, 0.1 M LiAc solution (100 mM Litium Acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, and acetic acid) adjusted to pH 4.9 was added to the cell pellet obtained above. 10 mL was added to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution.
  • the replica plate method was used to inoculate YES agar medium to which G418 was added to a final concentration of 150 ⁇ g / mL, and incubation was performed at 30 ° C. for 72 hours.
  • the obtained single colony was inoculated in YES liquid medium and shake culture was performed at 30 ° C. Then, centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute to obtain cell pellet.
  • Genomic DNA was extracted using the obtained bacterial cell pellet according to the protocol of Puregene Yeast / Bact kit B (Qiagen) to obtain G418 resistant S. pombe genomic DNA.
  • PCR amplification was performed using the following primer set (1) and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme).
  • G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ ) was introduced into S. pombe, and an about 3.8 kb PCR amplified fragment was observed, which was observed only when the G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ ) was inserted. This confirmed that the G418R-nmt1 promoter (GD_ ⁇ ) was inserted into the S. pombe chromosome.
  • Example 6-2 Preparation of S. pombe OB1 (GD)
  • the HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) prepared in Example 5-2 above was transformed into S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ) prepared in Example 6-1 above to prepare S. pombe OB1 (GD). Details are shown below.
  • culture of S. pombe OB1 was performed. More specifically, S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ) was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) was introduced into the cultured S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the bacterial cell suspension, 2 ⁇ g of HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) and 290 ⁇ L of 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ L of sterile water was added to the obtained cell pellet to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, cell pellets were suspended in 300 ⁇ l of sterile water, and then the cells were spread on YES agar medium and incubated at 30 ° C. for 24 hours.
  • the replica plate method was used to inoculate YES agar medium to which Hygromycin B (Hyg) was added to a final concentration of 150 ⁇ g / mL, and incubation was performed at 30 ° C. for 72 hours. The obtained single colony was inoculated in YES liquid medium and shake culture was performed at 30 ° C.
  • Genomic DNA was extracted using the obtained cell pellet according to the protocol of Puregene Yeast / Bact kit B (Qiagen) to obtain Hyg-resistant S. pombe genomic DNA.
  • PCR amplification was performed using the following primer set (2), primer set (3), and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme).
  • HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) was introduced into S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ). As a result, it was observed only when the HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) was inserted. Confirmation of the 2 kb PCR amplified fragment confirmed that the HygR-nmt1 promoter (GD_ ⁇ and ⁇ ) was inserted into the chromosome of S. pombe OB1 (GD_ ⁇ ).
  • Example 6-3 Preparation of S. pombe OB1 (GD, GDR)
  • the AbAR-nmt1 promoter (GDR_LandS) prepared in Example 5-3 above was transformed into S. pombe OB1 (GD) prepared in Example 6-2 above to prepare S. pombe OB1 (GD, GDR). Details are shown below.
  • S. pombe OB1 GD
  • S. pombe OB1 GD
  • shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • the AbAR-nmt1 promoter (GDR_LandS) was introduced into the cultured S. pombe OB1 (GD). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the cell suspension, 2 ⁇ g of AbAR-nmt1 promoter (GDR_LandS) and 290 ⁇ L of 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • GDR_LandS AbAR-nmt1 promoter
  • Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ L of sterile water was added to the obtained cell pellet to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3,000 rpm for 1 minute, cell pellets were suspended in 300 ⁇ l of sterile water, and then the cells were spread on YES agar medium and incubated at 30 ° C. for 24 hours.
  • the replica plate method was used to inoculate YES agar medium to which Aureobasidin A (AbA) was added to a final concentration of 0.5 ⁇ g / mL, and incubation was performed at 30 ° C. for 72 hours. The obtained single colony was inoculated in YES liquid medium and shake culture was performed at 30 ° C.
  • Genomic DNA was extracted using the obtained bacterial cell pellet according to the protocol of Puregene Yeast / Bact kit B (Qiagen) to obtain the genomic DNA of AbA resistant S. pombe.
  • PCR amplification was performed using the following primer set (4), primer set (5), and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme).
  • Example 6-4 Preparation of a cultured enzyme crude enzyme solution of S. pombe OB1 (GD, GDR)
  • Colonies of S. pombe OB1 (GD, GDR) were inoculated in EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • thiamine a final concentration of 15 ⁇ M
  • shake culture was performed at 30 ° C.
  • 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C.
  • 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C.
  • the cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended with EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • the cell suspension was inoculated into EMM liquid medium to 2.21 ⁇ 10 5 cells / mL, and shake culture was performed at 30 ° C. for 48 hours.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was discarded to obtain cultured cells.
  • the resulting cultured cells were treated with Yeast Buster Protein Extraction Reacgent (Novagen) to obtain a crude enzyme solution.
  • Example 6-5 Measurement of glycerol dehydration activity of crude enzyme solution of S. pombe (GD, GDR) cultured cells
  • Example 6-6 Preparation of S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH)
  • the Leu2-nmt1 promoter (aldH) prepared in Example 5-4 above was transformed into S. pombe OB1 (GD, GDR) prepared in Example 6-3 above, and S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH) was transformed Made. Details are shown below.
  • S. pombe OB1 (GD, GDR) was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • the Leu2-nmt1 promoter (aldH) was introduced into the cultured S. pombe OB1 (GD, GDR). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the cell suspension, 2 ⁇ g of Leu2-nmt1 promoter (aldH) and 290 ⁇ L of 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • Genomic DNA was extracted using the obtained bacterial cell pellet according to the protocol of Puregene Yeast / Bact kit B (Qiagen) to obtain leucine auxotrophic complement S. pombe genomic DNA.
  • PCR amplification was performed using the following primer set (6) and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme).
  • Leu2-nmt1 promoter was introduced into S. pombe OB1 (GD, GDR).
  • a gene encoding foreign glycerol dehydratase thus obtained, a gene encoding glycerol dehydratase reactivating factor, and a gene-recombinant microorganism into which a gene encoding foreign aldehyde dehydrogenase is introduced ie, Schizosaccharomyces pombe OB01 (GD, GDR, aldH) was named Schizosaccharomyces pombe NSH-1.
  • Example 1 3HP production by S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH)
  • S. pombe OB1 GD, GDR, aldH
  • Schizosaccharomyces pombe NSH-1 prepared in Example 6-3 above, it was examined whether 3HP could be produced.
  • culture of S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH) was performed. Specifically, colonies of S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH) are inoculated into EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture is performed at 30 ° C. Did. 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. until it became 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • reagent A solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) and 200 ⁇ L of reagent B solution were added and mixed well, and then treated at 60 ° C. for 20 minutes. After cooling to room temperature, it was passed through a 0.45 mm filter to obtain an LC analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below.
  • acetic acid was confirmed using the above supernatant. Specifically, the supernatant was diluted 10-fold with a 5 mM sulfuric acid solution and then passed through a 0.45 mm filter to obtain an LC analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below.
  • an acetic acid production amount of 0.4 g / L 64 hours after the start of culture was the largest.
  • the acetic acid production amount of S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH) is described in E. coli fusion blue (TacP-GDP-GPP / pCDF, TacP-LR_DD-DDR / pACYC, TacP-aldH / pUC18) described later. It was confirmed that the amount of acetic acid produced was lower when S. pombe was used as a host in comparison with the amount of acetic acid produced (Table 2).
  • Example 7 Construction of various plasmids
  • Example 7-1 Construction of TacP-GDP-GPP / pCDF
  • a GDP-GPP fragment (constructed by introducing a GDP fragment and a GPP fragment into pUC18), and a plasmid TacP-GDP-GPP / pCDF in which a TacP fragment was introduced into pCDF, were constructed.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a pUC18 fragment.
  • GDP fragment glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene fragment
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a glycerol-3-3 phosphatase gene fragment (GPP fragment).
  • cloning is performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and the GDP gene and GPP gene derived from S. cerevisiae are Lac We constructed GDP-GPP / pUC18 cloned downstream of the promoter.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a GDP-GPP fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a pCDF fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct GDP-GPP / pCDF.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a GDP-GPP / pCDF fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a TacP fragment.
  • cloning is performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and the S. cerevisiae-derived gene and GPP gene downstream of the Tac promoter
  • the cloned TacP-GDP-GPP / pCDF was constructed.
  • Example 7-2 Construction of TacP-LR-DD-DDR / pACYC
  • a plasmid TacP-LR-DD-DDR / pACYC was constructed in which a TacP-LR-DD-DDR fragment (constructed by introducing the LR-DD-DDR fragment into PinPoint Xa-1) was introduced into pACYC.
  • DD gene diol dehydratase gene
  • DDR gene diol dehydratase reactivation factor
  • PinPoint Xa-1 plasmid DNA of PinPoint Xa-1 (Invitrogen) as a template
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a PinPoint Xa-1 fragment.
  • LR-DD-DDR fragment and PinPoint Xa-1 fragment obtained by PCR amplification cloning is performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and DD-derived from L. reuteri is downstream of the Tac promoter.
  • LR-DD-DDR / PinPoint Xa-1 was constructed in which the DDR gene was inserted.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme), and the TacP-LR-DD-DDR fragment was Obtained.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain pACYC fragment.
  • TacP-LR-DD-DDR fragment and pACYC fragment obtained by PCR amplification cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct TacP-LR-DD-DDR / pACYC .
  • Example 7-3 Construction of TacP-aldH / pUC18
  • the plasmid TacP-aldH / pUC18 was constructed in which a TacP-aldH fragment (constructed by introducing an aldH fragment into PinPoint Xa-1) was introduced into pUC18.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) with the genomic DNA of Escherichia coli strain W3110 as a template to obtain a ⁇ -glutamyl- ⁇ -aminobutyraldehyde dehydrogenase (aldH) fragment .
  • Finnzyme Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
  • aldH ⁇ -glutamyl- ⁇ -aminobutyraldehyde dehydrogenase
  • PinPoint Xa-1 plasmid DNA of PinPoint Xa-1 (Invitrogen) as a template
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a PinPoint Xa-1 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a TacP-aldH fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzyme) to obtain a pUC18 fragment.
  • Example 8 Transformation
  • the TacP-GDP-GPP / pCDF, TacP-LR-DD-DDR / pACYC, and TacP-aldH / pUC18 prepared in Examples 7-1 to 7-3 above were introduced into E. coli. Details are shown below.
  • Example 9 Conversion of glucose to glycerol by E. coli fusion blue (TacP-GDP-GPP / pCDF, TacP-LP_DD-DDR / pACYC, TacP-aldH / pUC18))
  • E. coli fusion blue (TacP-GDP-GPP / pCDF, TacP-LP_DD-DDR / pACYC, TacP-aldH / pUC18), which is a genetically modified microorganism, as described above, to glycerin of glucose We examined conversion of.
  • E. coli fusion blue (TacP-GDP-GPP / pCDF, TacP-LP_DD-DDR / pACYC, TacP-aldH / pUC18) will be 100 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • the cells were inoculated in LB liquid medium supplemented with chloramphenicol, streptomycin and ampicillin as described above, and shake culture was performed at 37 ° C. for 24 hours. The obtained culture solution was inoculated so that the value of OD660 at the start of culture became 0.018, and shaking culture was started at 25 ° C.
  • the amount of acetic acid produced 144 hours after the start of culture was 2.6 g / L
  • the amount of acetic acid produced 216 hours after the start of culture was 4.3 g / L.
  • the comparison of the acetic acid production amount with S. pombe OB1 (GD, GDR, aldH) is as shown in Table 2 above.
  • Example 10 Conversion of glucose to glycerol by S. pombe
  • S. pombe S. pombe ATCC 26189 (972 h-) and S. pombe OB1 were used.
  • Colonies of S. pombe ATCC 26189 (972 h-) and S. pombe OB1 were inoculated in YES liquid medium and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C.
  • the cells were inoculated at 3.13 ⁇ 10 4 cells / mL in g / L and shake culture was performed at 30 ° C.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain a culture supernatant.
  • LC analysis sample After 1 mL of the obtained culture supernatant was diluted 10-fold with a 5 mM sulfuric acid solution, it was passed through a 0.45 mm filter to obtain an LC analysis sample. Using the LC sample, high performance liquid chromatography (LC) analysis was performed under the following conditions.
  • Example 11 Construction of mcr / pGPD plasmid
  • the plasmid mcr / pGPD was constructed in which the mcr fragment was introduced into pGPD.
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) with the genomic DNA of Chloroflexus aurantiacus strain ATCC 29365 as a template to obtain a malonyl CoA reductase (mcr) gene fragment.
  • Finnzymes Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
  • PCR amplification was performed using the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pGPD fragments.
  • the mcr and pGPD fragments obtained by the above PCR amplification were cloned according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and the mcr gene derived from C. aurantiacus was cloned downstream of the nmt1 promoter, mcr / PGPD was constructed.
  • Example 12 Preparation of G418R-nmt1 promoter (mcr) fragment
  • the G418R-nmt1 promoter fragment was prepared from mcr / pGPD.
  • PCR amplification was performed using mcr / pGPD plasmid DNA as a template and the following two primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a G418R-nmt1 promoter (mcr) fragment .
  • Example 13 Transformation
  • the G418 R-nmt1 promoter (mcr) fragment prepared in Example 12 above was transformed into Schizosaccharomyces pombe OB2 to prepare S. pombe OB2 (mcr). Details are shown below.
  • the G418R-nmt1 promoter (mcr) fragment was introduced into the cultured S. pombe OB2. More specifically, 0.1 M LiAc solution (100 mM Litium Acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, and acetic acid) adjusted to pH 4.9 was added to the cell pellet obtained above. 10 mL was added to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution.
  • Genomic DNA was extracted using the obtained bacterial cell pellet according to the protocol of Puregene Yeast / Bact kit B (Qiagen) to obtain G418 resistant S. pombe genomic DNA.
  • PCR amplification was performed using the following primer set (7) and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes).
  • the genetically modified microorganism into which the gene encoding foreign malonyl-CoA reductase thus obtained has been introduced ie, Schizosaccharomyces pombe (mcr), is named Schizosaccharomyces pombe NSH-2, and as of March 9, 2012.
  • Schizosaccharomyces pombe NSH-2 Schizosaccharomyces pombe NSH-2, and as of March 9, 2012.
  • the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Deposited at Accession No. FERM P-2227, with accession number FERM P-2227, February 27, 2013 , Transferred to the international deposit.
  • the receipt number is FERM ABP-11527.
  • Example 2 3HP production by S. pombe (mcr)
  • S. pombe (mcr) was inoculated into EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. until it became 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • the cell suspension was inoculated into EMM liquid medium and cultured at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute, and suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • the resulting cell suspension was used to inoculate EMM liquid medium at a cell concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / mL, and shake culture was performed at 30 ° C. for 70 hours.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes to obtain a culture supernatant.
  • ⁇ L of the internal standard solution was added to 100 ⁇ L of a diluted solution obtained by diluting the obtained culture supernatant 10-fold with 0.25 M sulfuric acid. Subsequently, 200 ⁇ L of reagent A solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) and 200 ⁇ L of reagent B solution were added and mixed well, and then treated at 60 ° C. for 20 minutes. Further, 200 ⁇ L of reagent C solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) was added and mixed well, and treated at 60 ° C. for 15 minutes. After cooling to room temperature, it was passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain an LC analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below.
  • FIG. 7 shows the mass spectrum of 3HP and the mass spectrum of the culture supernatant of S. pombe (mcr).
  • Example 14 Construction of plasmid nmt1P-acc1-bpl1 / pG418)
  • the plasmid nmt1P-acc1-bpl1 / pG418 was constructed in which the nmt1 P-acc1 fragment and the nmt1 P-bpl1 fragment (constructed by introducing the bpl1 fragment into pHYG) were introduced into pG418.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an acetyl CoA carboxylase fragment (acc1 fragment).
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pG418 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and the accl gene derived from S. cerevisiae was cloned downstream of the nmt1 promoter. nmt1P-acc1 / pG418 was constructed.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a biotin apoprotein ligase fragment (bpl1 fragment).
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pHYG fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and the bpl1 gene derived from S. cerevisiae was cloned downstream of the nmt1 promoter, nmt1P-bpl1 / pHYG was constructed.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 P-acc1 / pG418 fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a nmt1 P-bpl1 fragment.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct nmt1 P-acc1-bpl1 / pG418 .
  • HygR-nmt1P (acc1-bpl1) fragment was prepared from nmt1 P-acc1-bpl1 / pG418.
  • PCR amplification is performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes), using the nmt1P-acc1-bpl1 / pG418 plasmid DNA as a template, and the HygR-nmt1P promoter (acc1-bpl1) fragment I got
  • culture of S. pombe (mcr) was performed. More specifically, S. pombe (mcr) was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • the HygR-nmt1P promoter (acc1-bpl1) fragment was introduced into the cultured S. pombe OB2 (mcr). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the bacterial cell suspension, 1 ⁇ g of HygR-nmt1P promoter (acc1-bpl1) fragment and 290 ⁇ L of 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ L of sterile water was added to the obtained cell pellet to suspend the cell pellet. After centrifuging at 3000 rpm for 1 minute, the cell pellet was suspended in 400 ⁇ l of sterile water, spread on a YES agar medium, and incubated at 30 ° C. for 20 hours.
  • S. pombe (mcr, acc) was obtained by smearing on a YES agar medium supplemented with Hygromycin B to a final concentration of 150 ⁇ g / mL and incubating at 30 ° C. for 72 hours.
  • a gene encoding the foreign malonyl-CoA reductase thus obtained and a recombinant microorganism into which a gene encoding foreign acetyl-CoA carboxylase has been introduced ie, Schizosaccharomyces pombe (mcr, acc), Schizosaccharomyces pombe NSH- Named as No. 3 on March 9, 2012, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (1-1-1 Tsukuba Center Chuo 6th, Tsukuba, Ibaraki Prefecture), Accession No. FERM P-2228 And transferred to the international deposit on February 27, 2013. The receipt number is FERM ABP-11528.
  • Example 3 3HP production by S. pombe (mcr, acc)
  • S. pombe (mcr, acc) Schizosaccharomyces pombe NSH-3 (Accession number: FERM ABP-11528) prepared in Example 16 above, whether 3HP was produced was examined.
  • Colonies of S. pombe (mcr-acc) were inoculated in EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. until it reached 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • the cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • the cell suspension was inoculated into EMM liquid medium and cultured at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the resulting culture solution was centrifuged at 3,000 rpm for 1 minute, and suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • the resulting cell suspension was used to inoculate EMM liquid medium at a cell concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / mL, and shake culture was performed at 30 ° C. for 120 hours.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to obtain a culture supernatant.
  • Example 17 Construction of CMV-gpd1 / pAUR224
  • the CMV-gpd1 / pAUR224 was constructed by introducing the gpd1 fragment into pAUR224 (having CMV as a promoter).
  • Genomic DNA of Kluyveromyces lactis NBRC 1267 (purchased from Biological Resource Center, NITE) was extracted using a Puregene Yeast / Bact kit (Qiagen). Using the extracted DNA as a template, PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain NADP-dependent glycerolde 3-phosphate dehydrogenase (gpd1 fragment).
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pAUR224 fragment.
  • the gpd1 fragment and the pAUR224 fragment obtained by the PCR amplification described above were used for cloning according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and gpd1 derived from Kluyveromyces lactis was cloned downstream of the CMV promoter, CMV- gpd1 / pAUR224 was constructed.
  • Example 18 Preparation of CMV-gpd1 / pAUR224 fragment
  • the AbaR-CMV-gpd1 fragment was prepared from CMV-gpd1 / pAUR224.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain an AbaR-CMV-gpd1 fragment.
  • Example 19 Transformation
  • S. pombe OB2 (mcr, acc): Schizosaccharomyces pombe NSH-3 (Accession number: FERM ABP-11528) prepared in Example 16 above, S pombe OB2 (mcr, acc, gpd1) was prepared. Details are shown below.
  • culture of S. pombe (mcr, acc) was performed. More specifically, S. pombe (mcr, acc) was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • the AbaR-CMV-gpd1 fragment was introduced into the cultured S. pombe OB2 (mcr, acc). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the bacterial cell suspension, 1 ⁇ g of AbaR-CMV-gpd1 fragment and 290 ⁇ L of a 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ L of sterile water was added to the obtained cell pellet to suspend the cell pellet. After centrifuging at 3000 rpm for 1 minute, the cell pellet was suspended in 400 ⁇ l of sterile water, spread on a YES agar medium, and incubated at 30 ° C. for 20 hours. The cells were coated on a YES agar medium supplemented with Aureobasidin A (Takara Bio Inc.) to a final concentration of 0.5 ⁇ g / mL and incubated at 30 ° C. for 96 hours to obtain S. pombe (mcr, acc, gpd1) Obtained.
  • Example 4 3HP production by S. pombe (mcr, acc, gpd1)
  • 3 S. pombe (mcr, acc, gpd1) prepared in Example 19 above Using 3 S. pombe (mcr, acc, gpd1) prepared in Example 19 above, a 3HP generation test was performed.
  • a colony of S. pombe (mcr, acc, gpd1) was inoculated into an EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. until 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • the cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension. Inoculate the cell suspension into an AMM liquid medium having the composition shown in Table 4 below so as to be 3.1 ⁇ 10 5 cells / mL, culture at 30 ° C., and culture the medium every 24 hours. I sampled it.
  • the sampled culture solution was centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes to obtain a culture supernatant.
  • the obtained culture supernatant was diluted 10-fold with 0.25 M sulfuric acid to obtain 100 ⁇ L of a diluted solution.
  • 200 ⁇ L of internal standard solution was added to the diluted solution, 200 ⁇ L of reagent A solution of hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) and 200 ⁇ L of reagent B solution were added and mixed well, and then treated at 60 ° C. for 20 minutes.
  • 200 ⁇ L of reagent C solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) was added, mixed well, and treated at 60 ° C. for 15 minutes. After cooling to room temperature, it was passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain an LC analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below. The obtained results are shown in FIG. 8 and Table 5 below.
  • S. pombe (mcr, acc, gpd1) was confirmed to have a high 3HP production amount, as compared to S. pombe (mcr, acc). Also, as apparent from Table 5, S. pombe (mcr, acc, gpd1), in contrast to S. pombe (mcr, acc), confirmed that 3HP can be selectively generated. It was done. Therefore, it was confirmed that the gene modification to improve the amount of NADPH in cells can improve the amount of 3HP generated.
  • Example 20 Construction of CMV-pkt ⁇ pta / pAUR
  • Construction of CMV-pkt ⁇ pta / pAUR224 was carried out in which pkt fragment and pta fragment were introduced into pAUR224 (having CMV as a promoter).
  • the pkt gene fragment of SEQ ID NO: 215 and the pta gene fragment of SEQ ID NO: 216 were selected as codons suitable for S. pombe.
  • the DNA fragment of the above sequence was synthesized by gene synthesis (a request from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pkt fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a pta fragment.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain pAUR224 fragment.
  • cloning is performed according to the protocol of In-Fusion PCR cloning kit (Takara), and pkt is cloned downstream of CMV promoter, CMV-pkt / pAUR224 It was constructed.
  • cloning was performed using the pta fragment and the pAUR224 fragment according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CMV-pta / pAUR224, in which pta was cloned downstream of the CMV promoter.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a CMV-pkt fragment.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of CMV-pta / pAUR224 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 223 and 224 and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a CMV-pka fragment. .
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain AbaR_arm_leu2 / The pUC18 fragment was obtained.
  • cloning was performed according to the protocol of the In-Fusion PCR cloning kit (Takara) to construct CMV-pta / pAUR.
  • PCR amplification was performed using the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a CMV-pkt fragment.
  • PCR amplification was performed using the plasmid DNA of CMV-pta / pAUR as a template and the following primers and Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) to obtain a leu_CMV-pta / pAUR fragment.
  • Example 21 Preparation of leu_CMV-pta pta fragment
  • the leu_CMV-pta pta fragment was prepared from CMV-pkt pta / pAUR.
  • PCR amplification is performed using the plasmid DNA of CMV-pkt ⁇ pta / pAUR as a template and the primers of SEQ ID NOS: 93 and 94 described above and KOD-FX (Toyobo), and leu_CMV-pta ⁇ pta I got a fragment.
  • S. pombe OB2 (mcr, acc): Schizosaccharomyces pombe NSH-3 (Accession number: FERM ABP-11528) prepared in Example 16 above is transformed into S. pombe OB2 (mcr, acc) prepared in Example 16 above, S pombe OB2 (mcr, acc, pkt ⁇ pta) was prepared. Details are shown below.
  • culture of S. pombe (mcr, acc) was performed. More specifically, S. pombe (mcr, acc) was inoculated into a YES liquid medium, and shake culture was performed at 30 ° C. to 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute to obtain a cell pellet.
  • the leu_CMV-pta pta fragment was introduced into the cultured S. pombe OB2 (mcr, acc). More specifically, 10 mL of a 0.1 M LiAc solution was added to the cell pellet obtained above to suspend the cell pellet. Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and the obtained cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of a 0.1 M LiAc solution. To 100 ⁇ L of the bacterial cell suspension, 1 ⁇ g of leu_CMV-pta ⁇ pta fragment and 290 ⁇ L of 50% PEG solution were added and mixed, and incubation was performed at 30 ° C. for 1 hour.
  • Centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ L of sterile water was added to the obtained cell pellet to suspend the cell pellet. After centrifuging at 3000 rpm for 1 minute, suspend the cell pellet with 400 ⁇ L of sterile water, spread on leucine-free EMM medium, and incubate at 30 ° C. for 96 hours, S. pombe (mcr, acc, pkt ⁇ pta) I got
  • Example 5 3HP production by S. pombe (mcr, acc, pkt ⁇ pta)
  • the 3HP generation test was performed using S. pombe (mcr, acc, pkt ⁇ pta) prepared above.
  • Colonies of S. pombe (mcr, acc, pkt ⁇ pta) were inoculated in EMM liquid medium (MP Biomedicals) supplemented with thiamine to a final concentration of 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture broth was inoculated into EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. 100 ⁇ L of the obtained culture solution was inoculated in EMM liquid medium supplemented with thiamine 15 ⁇ M, and shake culture was performed at 30 ° C. until it reached 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • EMM liquid medium MP Biomedicals
  • the cells were washed three times with EMM liquid medium, and the obtained cell pellet was suspended in EMM liquid medium to obtain a cell suspension.
  • the bacterial cell suspension is inoculated into an AMM liquid medium having the composition shown in Table 4 so that the cell suspension becomes 3.1 ⁇ 10 5 cells / mL, and culture is performed at 30 ° C. I sampled it.
  • the sampled culture solution was centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes to obtain a culture supernatant.
  • the obtained culture supernatant was diluted 10-fold with 0.25 M sulfuric acid to obtain 100 ⁇ L of a diluted solution.
  • 200 ⁇ L of internal standard solution was added to the diluted solution, 200 ⁇ L of reagent A solution of hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) and 200 ⁇ L of reagent B solution were added and mixed well, and then treated at 60 ° C. for 20 minutes.
  • 200 ⁇ L of reagent C solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) was added, mixed well, and treated at 60 ° C. for 15 minutes. After cooling to room temperature, it was passed through a 0.45 ⁇ m filter to obtain an LC analysis sample. LC analysis was performed using the sample under the conditions shown below. The obtained results are shown in Table 6 below.
  • Example 23 Production of 3HP by E. coli into which a gene encoding foreign malonyl CoA reductase has been introduced
  • PCR amplification was performed using the designed primers as a template for genomic DNA of Chloroflexus aurantiacus ATCC 29365 strain to obtain the malonyl CoA reductase gene of Chloroflexus aurantiacus ATCC 29365.
  • the acquired malonyl CoA reductase gene was cloned downstream of the Tac promoter of PinPoint Xa-1 vector (Promega) to construct mcr / PinPoint Xa-1.
  • the constructed mcr / PinPoint Xa-1 was introduced by the heat shock method, Coli (mcr / PinPoint Xa-1) was obtained.
  • E. E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was inoculated into M9 medium (manufactured by Difco) supplemented with IPTG (final concentration 1 mM) and 2 wt / vol% glucose and cultured at 37 ° C. for 48 hours. 200 ⁇ L of internal standard solution was added to 100 ⁇ L of culture supernatant. After adding 200 ⁇ L of reagent A solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) and 200 ⁇ L of reagent B solution and thoroughly mixing, they were treated at 60 ° C. for 20 minutes. 200 ⁇ L of reagent C liquid of hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) was added and mixed well.
  • E.I. E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was inoculated into M9 medium (Difco) supplemented with IPTG (final concentration 1 mM) and 4 wt / vol% glycerol and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • the obtained culture solution was subjected to analysis by high performance liquid chromatography in the same manner as described above, and a peak was confirmed at 7.9 minutes which corresponds to the peak of 3-hydroxypropionic acid.
  • E.I. It was confirmed that 3HP was produced from glycerol by fermentation using E. coli (mcr / PinPoint Xa-1).
  • the obtained accBC gene and dtsR1 gene were cloned downstream of the mcr / PinPoint Xa-1 mcr gene described in Example 23, to construct mcr-acc / PinPoint Xa-1.
  • the constructed mcr-acc / PinPoint Xa-1 was introduced by the heat shock method, Coli (mcr-acc / PinPoint Xa-1) was obtained.
  • E. E. coli (mcr-acc / PinPoint Xa-1) was inoculated into M9 medium (manufactured by Difco) supplemented with IPTG (final concentration 1 mM) and 2 wt / vol% glucose, and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • the obtained culture broth was subjected to analysis by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 23. As compared with Example 23, a peak at 7.9 minutes corresponding to the peak of 3-hydroxypropionic acid was obtained. Increased to a predominance.
  • Example 25 Production of 3HP by E. coli into which a gene encoding foreign malonyl CoA reductase has been modified, which has been genetically modified to increase the availability of intracellular NADPH
  • E. Based on the nucleotide sequences (SEQ ID NOs: 19 and 20) of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf) gene and the 6-phosphogluconate dehydrogenase (gnd) gene of E. coli, primers (E. coli) for amplifying the zwf and gnd genes. Primers for amplification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from E.
  • E. coli SEQ ID NOS: 21, 22 and primers for amplification of 6-phosphogluconate dehydrogenase from E. coli; SEQ ID NOS: 23, 24) were designed. Using the designed primers, E.I. PCR amplification was performed using the genomic DNA of E. coli K12 as a template. E. coli-derived zwf gene and gnd gene were obtained. The obtained zwf and gnd genes were cloned downstream of the T7 promoter of pCDFDuet-1 (Takara) to construct zwf-gnd / pCDF.
  • Example E as described in Example 23.
  • E. coli (mcr / PinPoint) was transfected with zwf-gnd / pCDF.
  • Coli (mcr / PinPoint Xa-1, zwf-gnd / pCDF) was obtained.
  • the obtained culture broth was subjected to analysis by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 23.
  • Example 26 Production of 3HP by E. coli into which a gene encoding foreign malonyl CoA reductase and a gene encoding foreign acetyl CoA carboxylase have been genetically modified to increase the availability of NADPH in cells
  • the zwf-gnd / pCDF described in Example 25 was introduced into E. coli (mcr-acc / PinPoint Xa-1) described in Example 24, and E. coli (mcr-acc / PinPoint Xa-1, zwf-gnd). Obtained / pCDF).
  • Example 23 As compared with Example 23 and Examples 24 and 25, a peak at a position of 7.9 minutes corresponding to the peak of 3HP. Increased to a predominately.
  • Example 27 Synthesis of acrylic acid and super absorbent resin using 3HP fermentatively produced from sugar
  • 100 g of the fermentation broth containing 3HP obtained in Examples 1, 2 and 3 and Examples 24, 25 and 26 were respectively centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes, and the culture supernatant was recovered.
  • 100 g of tri-n-octylamine was added to the collected culture supernatant, and gently mixed using a stirrer at room temperature (25 ° C.) for 24 hours.
  • the mixture was allowed to stand to be separated into two phases, and the organic phase was recovered.
  • 50 g of aluminum oxide was added to the organic phase containing the reaction mixture, and the mixture was heated and distilled at 170 ° C. for 1 hour.
  • the obtained distillate was collected, cooled to room temperature, and gradually heated from 100 ° C. to 130 ° C. to remove the distillate. Thereafter, the pressure was reduced, and the pressure in the system was gradually heated to 200 ° C. while maintaining the pressure at 20 kPa, and the distillate was recovered to obtain a solution containing acrylic acid (acrylic acid solution).
  • acrylic acid solution 60 mass ppm (against acrylic acid) of hydroquinone as a polymerization inhibitor was added.
  • 75 mol% of acrylic acid is added by adding the above-mentioned polymerization inhibitor-added acrylic acid solution under cooling (liquid temperature 35 ° C.) to a NaOH aqueous solution obtained from caustic soda containing 0.2 mass ppm of iron.
  • the neutralization was done.
  • a monomer is obtained by dissolving 0.05 mol% of polyethylene glycol diacrylate (value relative to sodium acrylate) as an internal crosslinking agent in the obtained sodium acrylate aqueous solution having a neutralization ratio of 75 mol% and a concentration of 35 mass%. I got the ingredients.
  • the obtained water-containing gel-like crosslinked polymer was subdivided by a meat chopper (pore diameter: 8 mm) at 45 ° C., and then dried by heating at 170 ° C. for 20 minutes with a hot air drier. Furthermore, the dry polymer (solid content: about 95%) is crushed with a roll mill, and classified into particle sizes of 600 to 300 ⁇ m with a JIS standard sieve to obtain a polyacrylic acid-based water absorbent resin (neutralization ratio: 75%). Obtained.
  • the polymerizability of acrylic acid obtained by the production method of the present invention was equivalent to the polymerizability of acrylic acid obtained by the method of producing acrylic acid using propylene as a raw material.
  • the water absorbent resin obtained by the production method of the present invention had no odor, and had the same physical properties as the water absorbent resin produced using propylene as a raw material.
  • Example 28 Synthesis of Acrylic Ester Using Acrylic Acid Synthesized in Example 27
  • the acrylic acid solution obtained in Example 27 was purified by crystallization. With respect to 2 parts by mass of the obtained purified acrylic acid, 3 parts by mass of n-butanol was used as a raw material, and a transesterification reaction was performed at 65 ° C. using a strongly acidic cation exchange resin as a catalyst.
  • the resulting reaction solution was extracted with water to remove unreacted acrylic acid contained in the reaction solution and water produced by the reaction. Then, the extract was introduced into a distillation column and distilled to obtain n-butyl acrylate having a purity of 99.8% by mass or more from the column bottom.
  • the n-butanol containing n-butyl acrylate distilled from the top of the column was reused in the transesterification reaction.
  • Example 29 Synthesis of acrylic acid ester resin using acrylic acid ester synthesized in Example 28 and application to adhesive
  • Coronate L-55E manufactured by Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd.
  • isocyanate crosslinking agent is added to 100 parts by mass of the obtained acrylic acid ester resin solution, and the mixture is uniformly stirred and mixed.
  • An adhesive was prepared.
  • the performance evaluation about the obtained adhesive was performed. Specifically, the adhesive was applied on a polyethylene terephthalate (PET) film (Toray Industries, Inc., 25 ⁇ m thick) so that the thickness after drying was 30 ⁇ m, and then dried at 80 ° C. for 5 minutes . Thereafter, release paper K-80HS (manufactured by Sun Aiken Co., Ltd.) was adhered to the surface of the adhesive for protection, and then aged for 7 days under an atmosphere of 23 ° C. and a relative humidity of 65%. The cured adhesive film was cut into a predetermined size to prepare a test piece.
  • PET polyethylene terephthalate
  • release paper K-80HS manufactured by Sun Aiken Co., Ltd.
  • the retention test was done about the obtained test piece. Specifically, a test piece from which the release paper was peeled off was attached to a SUS304 stainless steel plate, and a test piece was crimped to the stainless steel plate by reciprocating 2 kg of a rubber roller twice under an atmosphere of 23 ° C. and a relative humidity of 65%. At this time, the attachment area was 25 mm ⁇ 25 mm. After left to stand for 25 minutes, it was vertically suspended in a holding strength tester set at 80 ° C. and left for 20 minutes. The sample was then loaded with a weight of 1 kg. The load at this time was 1.568 N / cm 2 .

Abstract

本発明は、効率的に３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を製造する方法を提供する。本発明は、耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、もしくは外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した第１の遺伝子組換え微生物；または耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子およびグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、または外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子およびジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子と、外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、を導入した第２の遺伝子組換え微生物を用いることを有する、３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関する。

Description

３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、並びに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂の製造方法
　本発明は、３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、ならびに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂を製造する方法に関する。
　地球温暖化防止および環境保護の観点から、炭素源としてリサイクル可能な生物由来資源を従来の化石原料の代替として用いることが注目されている。例えば、汎用化成品、プラスチック、および燃料生産の原料として、トウモロコシや小麦等の澱粉系バイオマス、サトウキビなどの糖質系バイオマス、および菜種の絞りかすや稲わら等のセルロース系バイオマス等のバイオマス資源を原料として利用する方法の開発が試みられている。また、バイオマス由来の糖類の利用以外にも、木質系バイオマスをガス化して得られる一酸化炭素と水素とを発酵原料として利用する方法や木質系バイオマスをガス化してメタノールを合成する方法についても検討・報告されている。
　３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）およびそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これから合成されるポリエステルは生分解性の地球にやさしいポリエステルとして注目されている。３－ヒドロキシプロピオン酸は、通常、アクリル酸に対する水の付加により、またはエチレンクロロヒドリンとシアン化ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和する反応は平衡反応であるため、反応率が制御されるという問題がある。また、エチレンクロロヒドリンの場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解工程を追加しなくてはならない。この場合、塩化ナトリウムおよびアンモニウム塩が大量に生じるという問題もある。
　３－ヒドロキシプロピオン酸は、脱水することによりアクリル酸を製造することができる。アクリル酸は、主にアクリル酸エステル製造の中間体として使用されており、アクリル酸エステルはコーティング剤、仕上げ剤、ペイント、接着剤の製造に使用され、吸着剤や洗浄剤用添加剤の製造にも使用されている。また、アクリル酸を部分中和させ、架橋性モノマーと共重合させることで吸水性樹脂を製造することもできる。アクリル酸の代替製造法としては、アクリロニトリルの硫酸による加水分解が知られている。しかし、この方法では、硫酸アンモニウム廃棄物が大量に生成し、それに伴うコストのために商業的には実施されていない。
　３－ヒドロキシプロピオン酸は、酵素反応または発酵により生成可能なことが報告されている。当該酵素反応による３ＨＰの発酵生産経路としては、（１）３ＨＰサイクル（炭素固定経路）による経路、（２）βアラニンを中間体とする経路が提案されている。
　Ｈｅｌｇｅ　Ｈｏｌｏ．，Ａｒｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，１５１：２５２－２５６には、上記（１）の経路を利用した３－ＨＰの発酵生産についての記載がある。具体的には、３ＨＰサイクルを保有するＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの発酵において、３ＨＰサイクルの中間代謝産物として３ＨＰが得られるというものである。しかしながら、生産された発酵液中の３ＨＰは、さらに３ＨＰサイクルによって３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡやアクリロイルＣｏＡに変換されるため、生産される３ＨＰはごく微量である。
　また、国際公開第２００８／０２７７４２号には、上記（２）の経路を利用した３ＨＰを発酵生産する方法が記載されている。しかしながら、（２）の経路によれば、原料となるピルビン酸から３ＨＰまでに必須となる反応段数が４段以上となってしまい、効率的な３ＨＰの生産方法とはいえなかった。
　このように、上記（１）および（２）の経路を利用する方法は、３ＨＰを効率的に生産できるというものではなかった。そこで、近年、その他の３ＨＰの発酵生産経路を利用する方法が検討されている。当該その他の３ＨＰ発酵生産経路としては、例えば、（３）マロニルＣｏＡ→３ＨＰによる経路、（４）グリセリン→３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）→３ＨＰによる経路等が挙げられる。上記（３）および（４）の経路を利用する方法は、主として、大腸菌等の微生物に、所要とする酵素の遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を利用して、３ＨＰを効率的に生産しようとするものである。例えば、上記（３）の方法では、マロニルＣｏＡレダクターゼ等をコードする遺伝子が導入され、上記（４）の方法では、グリセロールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子が導入された微生物が用いられている。
　具体例を挙げると、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９　Ｓｅｐ，８４（４），ｐ．６４９－６５７には、上記（４）の経路を利用した３ＨＰを発酵生産する方法が記載されている。より詳細には、グリセロールデヒドラターゼをコードするＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｄｈａＢ遺伝子と、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする大腸菌由来のａｌｄＨ遺伝子を有する遺伝子組換え大腸菌を調製し、これをグリセリンの存在下で培養したところ、フラスコスケールのバッチ培養では４８時間で４．４ｇ／Ｌ、バイオリアクターを用いたフェドバッチ培養では７２時間で３１ｇ／Ｌ（収率３５％）の３ＨＰが生産されたことが開示されている。
　ところで、３ＨＰの発酵生産は、通常、微生物の培養によって行われるが、３ＨＰの生産に伴い、培養培地のｐＨが酸性となっていく。その結果、微生物の生育が阻害され、３ＨＰの生産が抑制されうる。そうすると、例えば、上記（３）および（４）の経路を利用して理論的に３ＨＰの発酵生産量を増加させることができるとしても、発酵液中のｐＨが酸性となった場合、微生物の生育および３ＨＰ生産が抑制されるため、実際に得られる３ＨＰの発酵生産量は小さくなりうる。
　そこで、このような培地のｐＨ低下に伴う３ＨＰの生産抑制を防止するため、培地にアルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に保ちながら発酵を行う方法が提案されている。しかし、ｐＨを中性付近で発酵を行うと、発酵工程終了後の発酵液中の３ＨＰは、塩（３ＨＰ塩）の状態で得られる。発酵液から当該３ＨＰ塩を精製する場合、回収率は低く、続く３ＨＰのアクリル酸への脱水反応において収率が低下する等の問題が生じうる。
　そこで、３ＨＰ塩を効率的に精製する方法として、発酵液中の３ＨＰ塩を３ＨＰに変換してから３ＨＰを精製する方法が提案されている。例えば、国際公開第２００２／０９０３１２号には、中性付近で発酵を行って得られた３ＨＰアンモニウム塩を含む溶液に、アミン系溶媒を添加、加熱することで３ＨＰアンモニウム塩を３ＨＰに変換し、３ＨＰを抽出する方法が開示されている。また、国際公開第２００５／０７３１６１号には、３ＨＰカルシウム塩を含む溶液に第３級アミン溶媒を添加し、二酸化炭素を流加するによって３ＨＰカルシウム塩を３ＨＰに変換し、第３級アミン溶媒中に３ＨＰを抽出する方法が開示されている。
　上記（３）および（４）の経路を含む多くの３ＨＰを発酵生産する方法において用いられる発酵宿主は、通常、酸性条件下で生育が抑制される大腸菌である。したがって、例えば、３ＨＰの生産量を向上できるＡｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９　Ｓｅｐ，８４（４），ｐ．６４９－６５７の３ＨＰの製造方法と、生成される３ＨＰ塩を効率的に精製できる国際公開第２００２／０９０３１２号または国際公開第２００５／０７３１６１号の精製方法と、を組み合わせた３ＨＰの発酵生産方法は、一定の効果をあげている。
　しかしながら、発酵後に３ＨＰに変換するための試薬および処理が必要となり、コストや追加の工程が必要となる等の問題があり、さらなる効率的な３ＨＰの生産方法が求められている。
　そこで、本発明は、効率的に３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、耐酸性を有する微生物に所要とする酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を用いると、３ＨＰの生産量を向上させつつ、製造された３ＨＰを発酵液から容易に精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、もしくは外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した第１の遺伝子組換え微生物；または耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子およびグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、または外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子およびジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子と、外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、を導入した第２の遺伝子組換え微生物を用いることを有する、３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関する。
本発明の方法を概念的に示す図である。 ｐＡＤＨのプラスミドマップを示す図である。 ｐＧＰＤのプラスミドマップを示す図である。 ｐＧ４１８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＨＹＧのプラスミドマップを示す図である。 ｐＡＵＲのプラスミドマップを示す図である。 ３ＨＰのマススペクトルおよびS. pombe (mcr)の培養上清のマススペクトルを示す図である。 実施例４における、S.pombe (mcr,acc,gpd1)とS.pombe (mcr,acc)との３ＨＰ生成量の推移およびｐＨの推移を比較したグラフである。
　本発明は、耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、もしくは外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した第１の遺伝子組換え微生物；または耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子およびグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、または外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子およびジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子と、外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、を導入した第２の遺伝子組換え微生物を用いることを有する、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）の製造方法に関する。
　本発明によれば、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を効率よく製造することができる。
　以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。また、以下には所望の反応を触媒する酵素名または酵素遺伝子名を記載しているが、所望の反応を触媒できる酵素または酵素遺伝子であれば、その酵素名、酵素遺伝子名、ＥＣ番号に関わらず、本特許記載の酵素または酵素遺伝子と同様に利用することが可能である。
　本発明に係る３ＨＰ生成経路は３ＨＰ生成が可能であればどのような経路でも利用可能である。例えば、（ア）グルコース→→→ピルビン酸→乳酸→ラクチルＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ→３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成する乳酸経由３ＨＰ生成経路、（イ）グルコース→→→ピルビン酸→アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するマロニルＣｏＡ経由３ＨＰ生成経路、（ウ）グルコース→→→ピルビン酸→アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→マロン酸セミアルデヒド→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するマロニルＣｏＡ－マロン酸セミアルデヒド経由３ＨＰ生成経路、（エ）グルコース→→→ピルビン酸→オキサロ酢酸→アスパラギン酸→βアラニン→βアラニルＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ→３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するβアラニン－アクリリルＣｏＡ経由３ＨＰ生成経路、（オ）グルコース→→→ピルビン酸→オキサロ酢酸→アスパラギン酸→βアラニン→マロン酸セミアルデヒド→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するβアラニン－マロン酸セミアルデヒド経由３ＨＰ生成経路、（カ）グルコース→→→ピルビン酸→αアラニン→βアラニン→マロン酸セミアルデヒド→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するαアラニン－βアラニン経由３ＨＰ生成経路、（キ）グルコース→→→ピルビン酸→αアラニン→βアラニン→βアラニルＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ→３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するα－アラニン－アクリリルＣｏＡ経由３ＨＰ生成経路、（ク）グルコース→→→オキサロ酢酸→マロン酸セミアルデヒド→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するオキサロ酢酸経由３ＨＰ生成経路、（ケ）グルコース→グリセリン→３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド→３ＨＰの経路によって３ＨＰを生成するグリセリン経由３ＨＰ生成経路等の３ＨＰ生成が可能な代謝経路が利用できる。上記（ア）～（ケ）の３ＨＰ生成経路は単独で利用しても、複数の３ＨＰ生成経路を併用して利用しても良い。３ＨＰまでの反応段数の少なさ、細胞内における３ＨＰ前駆体の生成量の多さから、（イ）のマロニルＣｏＡ経由３ＨＰ生成経路および／または（ケ）のグリセリン経由３ＨＰ生成経路を利用することが好ましい。このため、以下では、（イ）のマロニルＣｏＡ経由３ＨＰ生成経路および（ケ）のグリセリン経由３ＨＰ生成経路による３ＨＰの製造方法について、詳述する。しかし、本発明は下記形態に限定されるものではない。
　図１は、本発明の一実施形態に係る方法を概念的に示す図である。
　第１の遺伝子組換え微生物によれば、３ＨＰは、（３）マロニルＣｏＡ→３ＨＰによる経路により製造される。この際、前記（３）の経路は、（３－ａ）マロニルＣｏＡが、直接３ＨＰが製造される経路と、（３－ｂ）マロニルＣｏＡが、中間体であるマロン酸セミアルデヒドを介して３ＨＰが製造される経路とに分類される。前記（３－ｂ）の経路では、マロン酸セミアルデヒドを経由する。また、第２の遺伝子組換え微生物によれば、３ＨＰは、（４）グリセリン→３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）→３ＨＰによる経路により製造される。
　［第１の遺伝子組換え微生物］
　本発明に係る第１の遺伝子組換え微生物は、（ア）耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入したもの；（イ）耐酸性を有する微生物に、外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入したもの；または（ウ）耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入したもの、のいずれであってもよい。
　（耐酸性を有する微生物）
　耐酸性を有する微生物としては、３ＨＰが９０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００～３００ｇ／Ｌの培地で生育可能なものであれば特に制限されない。当該耐酸性を有する微生物としては、細菌、酵母が挙げられる。
　耐酸性を有する細菌としては、例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒａｔｅｕｒｉｉ等のＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌などの酢酸菌；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属細菌などの乳酸菌等が挙げられる。
　耐酸性を有する酵母としては、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等が挙げられる。具体的には、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ等が挙げられる。
　上記細菌および酵母の他、低ｐＨでも発酵が継続するように改変した遺伝子組換え微生物、３ＨＰによる生育阻害を抑制するように改変した遺伝子組換え微生物、低ｐＨでも発酵が継続するように変異処理を施した変異株、または３ＨＰによる生育阻害に対する耐性を向上させた変異株のいずれも利用可能である。
　これらのうち、耐酸性を有する微生物は、酵母であることが好ましく、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属であることがより好ましく、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅであることがさらに好ましい。通常、細菌を用いて発酵すると、３ＨＰとともに酢酸を副生しうるが、酵母を用いて発酵すると、エタノールが副生され、酢酸の副生量は低減されうる。酢酸は３ＨＰとの分離が困難となり、また、生成した３ＨＰを用いてアクリル酸を製造する場合にも、アクリル酸と酢酸の分離が困難となるため、３ＨＰの生成段階において酢酸の副生を抑制できる酵母を用いることが好ましい。
　（外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子）
　マロニルＣｏＡレダクターゼは、マロニルＣｏＡを基質とした脱ＣｏＡ反応および還元反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．、ｇａｍｍａ　ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　ＲＳ－１、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　ＮＡＰ１、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｉｎｆｅｒｎｏｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｐ．、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ　ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ　ｆｕｍａｒｉｉに由来するマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらのうち、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．、ｇａｍｍａ　ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ，　Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｐ．に由来するマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を用いることが好ましく、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓに由来するマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を用いることがより好ましい。上記マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。上記マロニルＣｏＡレダクターゼに点突然変異を加えて改変した改変マロニルＣｏＡレダクターゼを利用してもよい。
　配列番号：１にＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号：２にＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がマロニルＣｏＡレダクターゼ活性を有する限り、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　また、ＮＡＤＰＨ依存性のマロニルＣｏＡレダクターゼに、点突然変異法等によりＮＡＤＨ依存性の酵素に改変した改変マロニルＣｏＡレダクターゼを用いることで、より効率的に３ＨＰを生成することも可能である。
　（外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）
　マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、マロニルＣｏＡを基質としてマロン酸セミアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｐ．に由来するマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらのマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。上記マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼに点突然変異を加えて改変した改変マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用してもよい。
　（外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）
　３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは、マロン酸セミアルデヒドを基質とし３ＨＰを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ　ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｐｉｃｈｉａ　ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ　ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｐ．に由来する３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらのうち、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに由来する３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を用いることが好ましい。上記３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼに点突然変異を加えて改変した改変３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを利用してもよい。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓの３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：３に、アミノ酸配列を配列番号：４に例示した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に例示した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａの３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：７に、アミノ酸配列を配列番号：８に例示した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：９に、アミノ酸配列を配列番号：１０に例示した。配列番号：４、６、８、または１０のアミノ酸配列を含むタンパク質が３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：４、６、８、または１０で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　上記では第１の遺伝子組換え微生物は、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入された形態、または外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された形態が記載されているが、それぞれマロニルＣｏＡから３ＨＰを生成できるその他の酵素を単独または２種類以上組み合わせて利用してもよい。
　（外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子）
　前記第１の遺伝子組換え微生物には、さらに外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入してもよい。これにより、第１の遺伝子組換え微生物は、アセチルＣｏＡを原料として、第１の遺伝子組換え微生物内でマロニルＣｏＡを生産することができる。
　アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、上述のように、アセチルＣｏＡを基質としマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｐｉｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ｔａｋｉｆｕｇｕ　ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ　ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｅｄｕｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｂｌａｔｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｉｔｔａｔｃｈｅｎｋｉａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉに由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらのうち、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を用いることが好ましい。上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼに点突然変異を加えて改変した改変アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを利用してもよい。
　配列番号：１３にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃＢＣ）遺伝子の塩基配列を、配列番号：１４にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ｄｔｓＲ１）遺伝子の塩基配列を、配列番号：２９にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ１）遺伝子の塩基配列を、また、配列番号：３０にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＢｉｏｔｉｎ：ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｇａｓｅ（ｂｐｌ１）の遺伝子配列を例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する限り、配列番号：１３、１４、２９、３０で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　（耐酸性を有する微生物、酵素をコードする遺伝子の改変）
　第１の遺伝子組換え微生物による３ＨＰの発酵生産量を増加させるため、耐酸性を有する微生物、酵素をコードする遺伝子の改変を行ってもよい。具体的には、グルコース、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド、３ＨＰ、および発酵過程で得られる副生物（酢酸、エタノール等）からなる群から選択される少なくとも１つに関連する遺伝子の改変が挙げられる。
　具体的な改変として、以下にアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの改変、細胞内のマロニルＣｏＡ量を増加させる改変、３ＨＰ代謝抑制の改変、およびアセチルＣｏＡの量を増加させる改変について例示する。
　アセチルＣｏＡカルボキシラーゼについては、生成されるマロニルＣｏＡや３ＨＰ等によってフィードバック阻害を受ける可能性がある。そこで、耐酸性を有する微生物またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を、マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するように修飾することができる。当該修飾する方法としては、特に制限されないが、（ａ）宿主が本来保有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を高発現させる方法、（ｂ）宿主とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを導入する方法、（ｃ）細胞内のアセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡによる制御が生じないようにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子に突然変異を導入する方法などが挙げられる。
　（ａ）の宿主が本来保有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を高発現させる方法としては、特に制限されないが、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を高発現プロモーターの下流に挿入した断片を、宿主微生物の染色体上に複数コピー（例えば、１～１０コピー）を導入する方法；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の複数コピー（例えば、１～１０コピー）を有する発現ベクターを同じ宿主に形質転換する方法；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを高発現するような培養条件で培養する方法；変異処理によりアセチルＣｏＡカルボキシラーゼが高発現するようになった変異株を用いる方法；Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の変異剤処理によりマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡ生合成量が多くなった突然変異生物を用いる方法などが挙げられる。また、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼがビオチン依存性の酵素であることから、ビオチン生合成能を向上させた遺伝子改変生物または変異生物を利用してもよい。
　また、（ｂ）の宿主とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを導入する方法としては、上述した微生物に由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を別の微生物に導入することができれば特に制限されない。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の１コピーまたは複数コピー（例えば、１～２００コピー）を、当該アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する宿主（例えば、微生物）とは異なる種に属する宿主（例えば、微生物）に形質転換する方法などが挙げられる。導入するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、宿主微生物の染色体上に挿入することで安定に微生物内で保持させることが可能となるため、染色体上に挿入することが好ましい。
　（ｃ）の細胞内のアセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡによる制御が生じないようにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子に突然変異を導入する方法としては、特に制限されないが、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子においてフィードバック制御等を担うアミノ酸に変異を導入し、フィードバック制御等を受けないように改変した変異アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを利用する方法が挙げられる。
　上記（ａ）～（ｃ）の方法は、単独で適用されてもあるいは２種以上を組み合わせて適用されてもよい。これらのうち、（ａ）の方法、（ｂ）の方法を利用することが好ましく、（ｂ）の方法を利用することがより好ましい。すなわち、マロニルＣｏＡの生合成量の増加効果は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、当該アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する微生物とは異なる種に属する微生物に形質転換することによって得られることが好ましい。ここで、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの形態は、特に制限されず、公知のいずれの形態を適用できる。
　また、細胞内のマロニルＣｏＡ量を増加させる改変については、マロニルＣｏＡを基質とした反応（脂肪酸への変換反応等）を触媒する酵素遺伝子の活性の抑制または破壊することで実施できる。例えば、マロニルＣｏＡからの脂肪酸合成反応を触媒する脂肪酸合成酵素遺伝子の活性抑制または破壊、マロニルＣｏＡを基質としてマロニル－ＡＣＰを合成する、マロニル－ＣｏＡ－ＡＣＰトランスアシラーゼ遺伝子の破壊、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするｆａｂＦ遺伝子を高発現させることでマロニルＣｏＡが脂肪酸に変換されることを抑制する方法等が利用できる。また、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を高発現させる、または外来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を導入・高発現させる改変を行うことでも細胞内のマロニルＣｏＡ量を増加させることが可能である。
　さらに３ＨＰ代謝抑制の改変としては、３ＨＰを基質とする反応を触媒する酵素遺伝子を改変する方法が挙げられる。具体的にはプロピオニルＣｏＡシンターゼ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅまたは３ＨＰを基質として酸化還元反応を触媒する酵素遺伝子を破壊することで、培養中の３ＨＰの分解を抑制することが可能となり、３ＨＰ生産性を向上させることができる。
　また、アセチルＣｏＡの量を増加させる改変の方法としては、アセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素遺伝子に対する改変、例えばアセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子の導入または改変、アセチルＣｏＡ消費量を低減させる効果を有する外来の遺伝子の導入または改変が挙げられる。具体的には、ピルビン酸を基質としアセチルＣｏＡを生成するｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子を高発現させた遺伝子改変株の利用や、宿主として利用する生物以外の生物由来のｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子を利用する宿主に導入し高発現させる方法、ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子の発現を制御するＰｄｈＲ遺伝子を破壊した遺伝子破壊株を利用する方法、またはＰｄｈＲ遺伝子内に変異が起こる等によりｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘの発現量が増加した遺伝子改変株を利用する方法等が考えられる。加えて、酢酸を基質としてアセチルＣｏＡを合成するａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（アセチルＣｏＡリガーゼ）遺伝子を高発現させる方法も利用できる。当該改変によれば、酢酸消費量を向上させることができるため、酢酸の副生量を低減させることもできる。さらに、Ｄ－キシロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）等のホスホケトラーゼと、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）と、を導入する方法も利用できる。Ｄ－キシロース－５－リン酸ホスホケトラーゼは、キシルロース－５－リン酸を、アセチルリン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸に変換する反応を触媒する酵素である。また、フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）は、フルクトース－６－リン酸を、エリスロース－４－リン酸およびアセチルリン酸に変換する反応を触媒する酵素である。そして、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）は、アセチルリン酸およびＣｏＡを、アセチルＣｏＡに変換する反応を触媒する酵素である。よって、当該改変によれば、ホスホケトラーゼ（Ｄ－キシロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ）により、アセチルリン酸を合成し、得られたアセチルリン酸を原料とし、ホスホトランスアセチラーゼにより、アセチルＣｏＡを合成することができる。これにより、アセチルＣｏＡの量を増加させることができる。また、アセトアルデヒド→エタノールの経路を触媒する酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することでさらにアセチルＣｏＡの量を増加させることもできる。さらに、アセチルＣｏＡの前駆物質であるピルビン酸を基質とした反応を触媒する酵素遺伝子、例えば、ピルビン酸→乳酸の反応を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼやピルビン酸→Ｌアラニンの反応を触媒するアラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸→オキサロ酢酸の反応を触媒するピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸→アセトアルデヒドの反応を触媒するピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸→アセチルリン酸の反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ等の酵素遺伝子を破壊することで、他の代謝経路で消費されるピルビン酸量を低下させることが可能となり、その結果、細胞内のアセチルＣｏＡの生成量を増加させることも可能となる。また、アセチルＣｏＡを消費する他の代謝経路を破壊または弱化させることで細胞内のアセチルＣｏＡ量を増加させることも可能である。例えば、アセチルＣｏＡを基質としアセチルリン酸を生成するｐｈｏｓｐｈｏａｃｙｌａｓｅ遺伝子、アセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を基質としてクエン酸を合成するｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、アセチルＣｏＡを基質としアセトアルデヒドを生成するａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子等のアセチルＣｏＡを基質とする酵素反応を触媒する酵素遺伝子を破壊することによって得られる遺伝子破壊株、または上記アセチルＣｏＡを基質とする酵素活性が低下した突然変異微生物を利用する方法が挙げられる。また、アセチルＣｏＡが最も利用される代謝経路であるクエン酸回路（ＴＣＡサイクル）に対する改変もマロニルＣｏＡの生成量増加に有効である。具体的には、（１）ＴＣＡサイクルを構成する各酵素活性が低くなった遺伝子改変株や変異株の利用、（２）ＴＣＡサイクルを構成する各酵素活性が低くなるような培養条件の変更等が挙げられる。前記（２）の方法としては、例えば、嫌気条件下で培養を行うことでＴＣＡサイクルに流れるアセチルＣｏＡ量を減らすことができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐酸性を有する微生物が、S. Pombeであることが好ましい。したがって、本発明によれば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、およびアセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子をコードする遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物が提供される。前記アセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子としては、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子と、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子と、の組み合わせであることが好ましい。この際、前記ホスホケトラーゼは、Ｄ－キシロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）であることが好ましく、Ｄ－キシロース－５－リン酸ホスホケトラーゼおよびフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼの両者の活性を有することから、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌由来のホスホケトラーゼであることがより好ましい。本発明の一実施形態によれば、前記アセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子は、フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子であることが好ましい。
　以上のような遺伝子の改変を行った遺伝子であっても、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼに改変を行った遺伝子であっても、当該遺伝子により得られるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼが、アセチルＣｏＡを基質としマルロニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有する限り、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼと機能的に同等の遺伝子であり、当該機能的に同等の遺伝子も本発明に包含される。「機能的に同等の遺伝子」とは、対象となる遺伝子によってコードされるタンパク質が、各配列番号で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
　あるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，９．４７－９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。
　例えば、配列番号：２で表される塩基配列の全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断による核酸断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号：２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、マロニルＣｏＡレダクターゼの活性、すなわち、マロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰを生成する酵素活性を有する限り、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子に含まれるのである。
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５～１ＭのＮａＣｌ存在下４２～６８℃で、または５０％ホルムアミド存在下４２℃で、または水溶液中６５～６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温（２０℃）～６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
　上記のようなストリンジェントな条件においては、対象となる塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子が、対象となる塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズすることができる。
　各遺伝子には、各アミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子も包含される。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号：１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、マロニルＣｏＡレダクターゼの活性を示すタンパク質が挙げられる。
　ここで、タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。
　したがって、配列番号：１のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号：１に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質がマロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰを生成する酵素活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質をコードする遺伝子もまたマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子に包含される。ここで、数個とは、通常２～５個、好ましくは２～３個である。
　また、マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子には、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、マロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含される。その他のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、並びにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子についても同様である。
　以上述べた第１の遺伝子組換え微生物のうち、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＮＳＨ－２（受領番号：ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１５２７）（Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｍｃｒ））、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＮＳＨ－３（受領番号：ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１５２８）（Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｍｃｒ，ａｃｃ））を用いることが特に好ましい。
　［第２の遺伝子組換微生物］
　本発明に係る第２の遺伝子組換え微生物は、（ア）耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、および外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入したもの；（イ）耐酸性を有する微生物に、外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、および外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入したもの；または（ウ）耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、および外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入したもの、のいずれであってもよい。
　（耐酸性を有する微生物）
　耐酸性を有する微生物は、第１の遺伝子組換え微生物と同様であるので、ここでは説明を省略する。
　なお、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅは、それ自体がグルコースからグリセリンへの代謝経路を有しており、３ＨＰの生産にグルコースを用いることができ、グリセリン生成量も、一般的な遺伝子組換え微生物、例えば、グリセリン生成能を有さない大腸菌に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびグリセロール－３－ホスファターゼ遺伝子を導入することによりグリセリン生成能を付与した遺伝子組換え大腸菌よりもグリセリン生成量が多いことから好ましい。
　（外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子）
　グリセリンデヒドラターゼ（ＧＤ）は、グリセリンを基質とし３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）を生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属に属する微生物に由来する遺伝子などが使用できる。より詳しくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ　ｖｉｔｅｒｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｂｌａｔｔａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ　ｉｎｎｏｃｕａに由来するグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子が挙げられる。上記グリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記グリセリンデヒドラターゼに点突然変異を加えて改変した改変グリセリンデヒドラターゼを利用してもよい。さらに上記以外に、ビタミンＢ１２非依存性のＧＤである、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来ＧＤも利用できる。
　（グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子）
　グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子（ＧＤＲ）は、グリセリンから３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換反応を触媒することにより不活性化したグリセリンデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素Ｂ１２を入れ替えて、再度活性を取り戻させる役割を有する。よって、ＧＤＲを導入していない場合、不活性化したグリセリンデヒドラターゼが再活性化されず、グリセリン脱水活性が維持できないことからグリセリンの脱水活性が非常に低くなる。場合によっては、酵素活性が認められないこともありうる。したがって、グリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子とともに、グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を導入することにより、３ＨＰを発酵生産する際に好適な酵素活性が得られうる。これにより、グリセリン→３ＨＰＡの変換が好適に行われ、結果として３ＨＰの収率が向上しうる。よって、一実施形態において第２の遺伝子組換え微生物には、グリセリンデヒドラターゼとともにグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子を必須に含む。ビタミンＢ１２非依存性のＧＤであるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来ＧＤでも前記の同様に、グリセリン脱水活性の維持に重要な役割を果たすｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ（ＧＤ－ＡＥ）が、グリセリン→３ＨＰＡの変換を好適に行うためには実質的に必須となる。
　用いられうるグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、国際公開第９８／２１３４１号；Ｄａｎｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，２１５１（１９９５）；Ｔｏｒａｙａ　ａｎｄ　Ｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３３７２（１９９９）；およびＴｏｂｉｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，４１１０（１９９９）に記載のものなどが挙げられる。この他、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する微生物に由来するグリセリンデヒドラターゼ遺伝子、具体的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに由来するグリセリンデヒドラターゼ遺伝子を用いてもよい。上記グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子に点突然変異を加えて改変したグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子を利用してもよい。
　（外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子）
　ジオールデヒドラターゼ（ＤＤ）は、グリセリンを基質とし３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）を生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、およびＬｉｓｔｅｒｉａ属に属する微生物に由来するジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子が挙げられる。より詳しくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ　ｓｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ　ｖｉｔｅｒｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ　ｉｎｎｏｃｕａに由来するジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子などが挙げられる。上記ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記ジオールデヒドラターゼに点突然変異を加えて改変したジオールデヒドラターゼを利用してもよい。
　（ジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子）
　ジオールデヒドラターゼ再活性化因子（ＤＤＲ）は、グリセリンから３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換反応を触媒することにより不活性化したジオールデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素Ｂ１２を入れ替えて、再度活性を取り戻させる役割を有する。よって、ＤＤＲを導入していない場合、不活性化したジオールデヒドラターゼが再活性化されず、グリセリン脱水活性が維持できないことからグリセリンの脱水活性が非常に低くなる。場合によっては、酵素活性が認められないこともありうる。したがって、ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子とともに、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を導入することによって、３ＨＰを発酵生産する際に好適な酵素活性が得られうる。これにより、グリセリン→３ＨＰＡの変換が好適に行われ、結果として３ＨＰの収率が向上しうる。よって、一実施形態において第２の遺伝子組換え微生物には、ジオールデヒドラターゼとともにジオールデヒドラターゼ再活性化因子を必須に含む。
　用いられうるジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｋａｊｉｕｒａ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３６５１４（２００１）に記載のものなどが挙げられる。
　以上で例示したグリセリンの脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子うち、本形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する微生物に由来するＧＤ－ＧＤＲ遺伝子、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来するＤＤ－ＤＤＲ遺伝子を用いることが好ましく、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＧＤ－ＧＤＲ遺伝子、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ由来のＤＤ－ＤＤＲ遺伝子を用いることがより好ましい。
　（外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）
　アルデヒドデヒドロゲナーゼは、３ＨＰＡを基質とし３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　用いられうる外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓａｒｃｉｎａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来するアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。より詳しくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｖｉｓｃｏｌａｃｔｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｑｕｉ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｒｃｉｎａ　ｌｕｔｅａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒ　ｈｏｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅに由来するアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらのうち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の酵素遺伝子を用いることが好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のａｌｄＨ遺伝子を用いることがより好ましい。
　また、γ－グルタミル－γ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼやα－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（α-ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ　ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）なども使用できる。
　（耐酸性を有する微生物、酵素をコードする遺伝子の改変）
　第２の遺伝子組換え微生物による３ＨＰの発酵生産量を増加させるため、耐酸性を有する微生物、酵素をコードする遺伝子の改変を行ってもよい。具体的には、グルコース、グリセリン、３ＨＰＡ、および３ＨＰからなる群から選択される少なくとも１つに関連する遺伝子の改変が挙げられる。
　上記改変については、第１の遺伝子組換え微生物に記載した方法と同様の方法で行うことができる。
　以上述べた第２の遺伝子組換え微生物のうち、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＮＳＨ－１（Ｓ．Ｐｏｍｂｅ　ＯＢ１（ＧＤ，ＧＤＲ，ａｌｄＨ）用いることが特に好ましい。
　［遺伝子組換え微生物の構築法］
　第１および第２の遺伝子組換え微生物の構築法は、公知の手法を用いることができる。例えば、酵素をコードする遺伝子をゲノムに導入してもよく、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよく、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。
　宿主として利用する耐酸性を有する微生物への遺伝子の導入は、上記遺伝子またはその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することにより、または相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子またはその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる、または所望の酵素活性を有するタンパク質を発現させることができる各遺伝子の一部分を指す。本発明において遺伝子には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含され、好ましくはＤＮＡである。
　微生物のゲノムから所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。上述した酵素をコードする遺伝子は、既知の遺伝子以外にも、既知の遺伝子の塩基配列に基づいて適当に設計された合成プライマーを用いてハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法などによりＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに登録されていない遺伝子も取得することも可能である。
　遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，９．４７－９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
　遺伝子を連結するベクターは、宿主で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、外来遺伝子導入に利用されているプラスミド、ファージ、コスミドおよび大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）等が挙げられる。大腸菌に外来遺伝子を導入する際に利用するプラスミドとしては、例えば、ｐＨＳＧ３９８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＡＵＲ２２４、ｐＧＰＤ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ－１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が挙げられ、ファージとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ、ＥＭＢＬ－、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が例示できる。また、酵母に外来遺伝子を導入する際に利用するプラスミドとしては、酵母内で外来遺伝子を発現させる際に用いるプロモーター、ターミネーター、および酵母内でのプラスミドの複製を担う複製起点を含むものであれば利用可能である。加えて、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域を含んでもよく、また栄養要求性相補マーカーや抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含んでもよい。具体的には、ｐＡＲＴ、ｐＳＭ、ＲＥＰ３Ｘ、ｐＳＬＦ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＤＵＡＬ、ｐＤＵＡＬ２等が挙げられる。
　上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用する発現プロモーターは、特に制限されず、使用する宿主や３ＨＰ発酵生産に適した培養条件下で効率的に遺伝子発現が可能となるプロモーターを当業者が適宜選択すればよい。例えば、一般的に大腸菌において外来遺伝子発現に利用されているＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λ－ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター等に加えて、大腸菌由来の硝酸呼吸に関与する硝酸還元遺伝子ｎａｒＧＨＪＩオペロンのＮａｒプロモーター領域や、大腸菌の硝酸還元酵素遺伝子であるＦｒｄ遺伝子のプロモーター領域を利用することもできる。Ｎａｒプロモーター領域やＦｒｄプロモーターは嫌気条件において遺伝子発現誘導を受けるプロモーターである。さらに、グルコース代謝に関与するグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子や６－ホスホフルクトキナーゼ遺伝子等のプロモーター領域、および大腸菌において耐酸性機構に関与するグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子等のプロモーター領域も利用することができる。また、酵母での外来遺伝子発現に利用するプロモーターとしては、ｎｍｔ１プロモーター、ｎｍｔ４１プロモーター、ｎｍｔ８１プロモーター、ｆｂｐ１プロモーター、ｉｎｖ１プロモーター、ｃｔｒ４プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ａｄｈ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｕｒｇ１プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ｅｆａ１ａ－ｃプロモーター、ｔｉｆ５１プロモーター、ｃａｍ１プロモーター、グルコース代謝に関与するグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子や６－ホスホフルクトキナーゼ遺伝子等のプロモーター領域等が利用できる。
　遺伝子破壊の方法は公知の方法を使用できる。具体的には、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の当技術分野でノックアウト細胞、トランスジェニック動物（ノックアウト動物含む）等を作製する際に用いられる方法を用いることが出来る。また、破壊したい遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、破壊したい遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法も利用できる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，９．４７－９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い作製することができる。また、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。また、酵母の遺伝子破壊方法としては、Ｙｅａｓｔ，１９９９，１５，ｐ．１４１９－１４２７記載の方法やＮａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１（５），ｐ．２４５７－６４に従って遺伝子破壊を行うことで、所望の遺伝子破壊酵母を作成することができる。
　相同置換を起こす位置またはトラップベクターを挿入する位置は、破壊したい標的遺伝子の発現を消失させる変異を生じる位置であれば特に限定されない。
　また、Ｇｅｎｅ　Ｂｒｉｄｇｅ社より販売されている、リコンビネーションタンパク質を利用した相同組換えによる遺伝子破壊系（Ｒｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ）を利用すれば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の、破壊したい遺伝子のみを選択的に破壊した遺伝子破壊株を構築することが可能である。さらに、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているグループ２イントロンを利用した遺伝子破壊システムであるＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍを利用することで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の遺伝子破壊も可能である。
　ベクターの宿主への導入方法は、使用する宿主によって選定すれば良く、特に制限されない。例えば、ベクター導入に一般的に利用されているカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法等を利用することができる。
　相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、この核酸断片をエレクトロポレーションや酢酸リチウム法によって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子を連結した核酸断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的に機能する遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えにより導入することもできる。
　目的とする遺伝子が導入された組換え微生物を選択する方法は、特に制限されないが、目的とする遺伝子が導入された組換え微生物のみを、容易に選択できる手法が好ましい。
　［３ＨＰの製造方法］
　３ＨＰ溶液の製造方法は、第１の遺伝子組換え微生物または第２の遺伝子組換え微生物を、それぞれマロニルＣｏＡまたはグリセリンの存在下で培養し、当該微生物がマロニルＣｏＡまたはグリセリンを資化する過程で生成する３ＨＰを培養液中に蓄積させることにより実施できる。なお、前記第１の遺伝子組換え微生物および前記第２の遺伝子組換え微生物は併用してもよい。
　（マロニルＣｏＡおよびグリセリン）
　３ＨＰの原料となるマロニルＣｏＡまたはグリセリンは、別途調製したものを培地に添加してもよいし、微生物（第１の遺伝子組換え微生物、第２の遺伝子組換え微生物を含む）を用いて糖などから調製してもよい。
　微生物を用いてマロニルＣｏＡおよびグリセリンを調製する方法は特に制限されず、公知の方法が用いられうる。
　マロニルＣｏＡは、脂肪酸合成における重要な前駆体であり、多くの微生物が合成しうる。また、所要に応じて、上述したアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入して、アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを調製することができる。なお、アセチルＣｏＡは、生物が生きていく上で重要なＴＣＡサイクルの入口に位置し、様々な化合物の代謝において代謝中間体として多量に生成される重要な代謝中間体である。したがって、マロニルＣｏＡは、糖アルコール、アルコール、脂肪酸、カルボン酸を原料としうる。
　マロニルＣｏＡの調製に用いられうる微生物としては、特に制限されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属に属する微生物が挙げられる。
　また、グリセリンを発酵生産する微生物としては、特に制限はなく、（１）糖からグリセリンを生成する能力を元来有する微生物、（２）糖からグリセリンを生成する能力を元来有する微生物のグリセリン生成能が遺伝学的手法により高められてなる微生物、（３）糖からグリセリンを生成する能力を有しない宿主微生物に、糖からグリセリンを生成するのに必要な酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種が導入されてなる微生物のいずれも使用可能である。
　上記（１）および（２）における糖からグリセリンを生成する能力を元来有する微生物は、特に制限はなく、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属などに属する酵母などを使用することができる。これらの微生物のうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅを用いることがより好ましく、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅを用いることがさらに好ましい。
　また、上記（２）において、微生物のグリセリン生成能を高める遺伝学的手法についても特に制限はなく、当該技術分野で使用されるあらゆる手法を適宜採用することができる。例えば、（２ａ）糖からグリセリンまでの反応のうちの少なくとも１種の反応を触媒する酵素の発現を高める方法；（２ｂ）グリセリンを代謝する反応を触媒する酵素遺伝子を破壊する方法；（２ｃ）高浸透圧条件下において培養するなどの手法が挙げられる。
　上記（２ａ）糖からグリセリンまでの反応のうちの少なくとも１種の反応を触媒する酵素の発現を高める方法としては、具体的には、酵素遺伝子の発現プロモーターを高発現プロモーター、例えば酵母の場合はＧＡＰプロモーター、ＣＭＶプロモーターやｎｍｔ１プロモーターに変更する方法、細胞内で複数コピーで存在可能なプラスミドにクローニングして導入することで細胞内の酵素遺伝子のコピー数を増加させる方法、酵素遺伝子を宿主の染色体上の複数の位置に挿入することで、酵素遺伝子のコピー数を増加させる方法などが挙げられる。
　上記（２ｂ）グリセリンを代謝する反応を触媒する酵素遺伝子を破壊する方法としては、具体的には、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはグリセロール―３－ホファターゼ遺伝子を破壊したり、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはグリセロール―３－ホスファターゼ遺伝子のプロモーターを発現量の低いプロモーターに置換する方法が挙げられる。また、ジヒドロキシアセトンキナーゼおよび／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊したり、ジヒドロキシアセトンキナーゼおよび／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを、発現量の低いプロモーターに置換する方法する方法等が挙げられる。
　上記（２ｃ）高浸透圧条件下において培養する方法としては、具体的には、糖濃度や塩濃度を高くした培地を用いて培養を行う方法などの方法が挙げられる。
　上記（３）における糖からグリセリンを生成する能力を有しない宿主微生物も特に制限はなく、上記マロニルＣｏＡの調製に用いられうる微生物が用いられうる。
　上記（３）において、糖からグリセリンを生成するのに必要な酵素としては、特に制限はない。例えば、解糖系で生じるジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸へと変換する反応を触媒するグリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＰ）、および、グリセロール－３－リン酸をグリセリンへと変換する反応を触媒するグリセロール－３－ホスファターゼ（ＧＰＰ）；解糖系で生じるジヒドロキシアセトンリン酸をジヒドロキシアセトンへと変換する反応を触媒するジヒドロキシアセトンホスファターゼ（dihydroxyacetone phosphatase）、および、グリセルアルデヒドをグリセリンへと変換する反応を触媒するグリセリンデヒドロゲナーゼ（glycerol dehydrogenase）などが挙げられる。
　上述の糖からグリセリンを生成するのに必要な酵素がコードされている遺伝子は、特に制限されないが、ＧＤＰをコードする遺伝子としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物に由来する遺伝子などが挙げられる。このうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する遺伝子を用いることが好ましい。
　ＧＰＰをコードする遺伝子としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物に由来する遺伝子などが挙げられる。このうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する遺伝子を用いることが好ましい。
　上記マロニルＣｏＡおよびグリセリンは、培地に直接添加しても、３ＨＰの発酵生産を行う第１の遺伝子組換え微生物および／または第２の遺伝子組換え微生物と接触させた１以上の微生物によって生成させてもよいが、第１の遺伝子組換え微生物および／または第２の遺伝子組換え微生物にマロニルＣｏＡおよび／またはグリセリン生成能を付与することが好ましい。なお、前記接触とは、原料として利用する化合物の存在下で微生物またはその処理物を培養すること、また、微生物の処理物を用いて反応を行うことを包含する。該処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌死体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることもできる。
　（糖）
　上述のように、マロニルＣｏＡおよびグリセリンは、糖を原料としうる。
　用いられうる糖としては、当該技術分野における培養で使用されうる一般的な糖を制限なく使用することができる。本形態における糖として、具体的には、バイオマス資源から誘導される糖などが挙げられ、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトースなどのヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロースなどのペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、デンプン、セルロースなどの２糖類や多糖類、マンニトール、キシリトール、リビトールなどの糖アルコール類（ただし、グリセリンを除く）、セルロースやリグノセルロース等のバイオマス糖化処理物由来の糖などが挙げられる。このうち、グルコースおよび／またはキシロースを用いることが好ましい。これらの糖は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよく、使用する微生物の生物種によって適宜選択される。
　（第１の遺伝子組換え微生物による３ＨＰの生産）
　マロニルＣｏＡから３ＨＰへの反応を、第１の遺伝子組換え微生物を用いてマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で行う場合には、当該反応を高いＮＡＤＰＨ量の条件下で行うことが好ましい。この際、前記第１の遺伝子組換え微生物は、その他の外来遺伝子、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよい。本条件は、特にＮＡＤＰＨ依存性のマロニルＣｏＡレダクターゼを利用する場合に好適に適用される。この際、ＮＡＤＰＨ依存性のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子としては、特に制限されないが、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｔｏｋｏｄａｉｉに由来するマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子が挙げられる。
　マロニルＣｏＡから３ＨＰへの反応を高いＮＡＤＰＨ量の条件下で行う方法としては、例えば、原料とする化合物（グルコース等）を資化する代謝経路上でより多くのＮＡＤＰＨが生成できる微生物や、より多くのＮＡＤＰＨを生成されるように代謝改変を行った遺伝子組換え生物を用いる方法が好ましい。より多くのＮＡＤＰＨが生成できる微生物としては、細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加させる効果を有する遺伝子を高発現する微生物が挙げられる。この際、前記細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加させる効果を有する遺伝子としては、特に制限されないが、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、EC.1.2.1.9、EC.1.2.1.13、EC.1.2.1.59等）遺伝子等が挙げられる。また、より多くのＮＡＤＰＨを生成されるように代謝改変を行った遺伝子組換え生物としては、上記３つの遺伝子を導入した遺伝子組換え生物を使用することもできる。
　グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子や６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ペントースリン酸経路においてＮＡＤＰ依存性の反応を触媒する酵素遺伝子である。また、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは解糖系や糖新生、炭素固定等において、ＮＡＤＰ依存性の反応を触媒する酵素遺伝子である。これらの遺伝子を導入または高発現させることで、糖代謝等におけるＮＡＤＰＨ生成量を増加させ３ＨＰをより効率的に発酵生産することができる。すなわち、マロニルＣｏＡから３ＨＰへの反応をマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で行う場合には、マロニルＣｏＡから３ＨＰへの反応を、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼを高発現する微生物を用いて行うことが好ましい。または、下記反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
を触媒するトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を導入または高発現させることで、細胞内の酸化還元バランスが制御でき、効率的な３ＨＰ発酵生産を行うこともできる。
　ここで、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは、下記反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。利用するグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現の容易さ、遺伝子が発現したことにより合成される酵素タンパク質の合成のし易さ等から宿主として利用する生物が元来保有するグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現させることが好ましい。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が好ましい。
　配列番号：１９にＥ．　ｃｏｌｉ由来グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質がグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：１９で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　また、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、下記反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。利用する６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現の容易さ、遺伝子が発現したことにより合成される酵素タンパク質の合成のし易さ等から宿主として利用する生物が元来保有する６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現させることが好ましい。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来の６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
　配列番号：２０にＥ．　ｃｏｌｉ由来６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質が６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：２０で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　さらに、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは、下記反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの具体例としては、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）が挙げられる。前記Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を外来遺伝子として、S. pombe等の微生物に導入してもよい。この際、発現するタンパク質がＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、前記遺伝子の塩基配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　上記グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれ、単独で使用してももしくは２種以上の混合物として使用してもよく、または、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの１以上と６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの１以上とＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ１以上とを組み合わせて使用してもよい。
　また、本発明の方法に用いられるグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの形態は、特に制限されず、公知のいずれの形態も適用できる。具体的には、細胞内より精製した酵素タンパク質そのものでもよいし、細胞内でグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現したことにより合成された酵素を包括した細胞、上記酵素の固定化酵素などが利用できる。また、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは、当該酵素活性を発揮する限り、そのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
　また、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する生物は、アセチルＣｏＡおよび／またはマロニルＣｏＡを生合成可能な生物であればどんな生物でもよいが、操作の容易さ、使用できる宿主の汎用性、生物の増殖速度などを考慮すると、微生物が好ましい。宿主の選定は３ＨＰの原料とする化合物の資化性を有しているかにより選定してよい。また、生育速度が速い、酸に対する耐性が高い等３ＨＰ発酵生産において有利な形質を有する生物に、原料として利用する化合物の資化性を付与して用いてもよい。加えて３ＨＰサイクルを保有する微生物を遺伝子組換えの宿主としてもよい。なお、マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子と、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼとは、同一の宿主（第１の遺伝子組換え微生物）に形質転換されても、あるいは異なる宿主に形質転換されてもよいが、同一の宿主に形質転換されることが好ましい。このように単一の宿主に形質転換することにより、アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰの反応が一の宿主（例えば、第１の遺伝子組換え微生物）中で行われるため、上記反応が効率よく進行し、また、宿主間の培養条件の違いを考慮する必要がないため、形質転換された宿主を最適の培養条件で培養することができる。上記に加えて、各酵素遺伝子による酵素反応を１つの細胞内で行うことで、各酵素反応で必要となる酸化力（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）や還元力（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）の授受を効率よく行うことが可能となり、３ＨＰ生産性を向上させることができる利点がある。
　このように、原料とする化合物を資化する代謝経路において、より多くのＮＡＤＰＨが生成するような代謝改変、または、細胞内の酸化還元バランスを制御するための遺伝子改変の具体的例を記載したが、同様の効果が得られる代謝改変または変異株であれば本発明の方法の遺伝子組換え宿主として利用可能である。
　本発明の一実施形態によれば、耐酸性を有する微生物が、S. Pombeであることが好ましい。したがって、本発明によれば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、および細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加させる効果を有する外来の遺伝子をコードする遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物が提供される。前記細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加する効果を有する外来の遺伝子は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることが好ましく、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることがより好ましく、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ由来のＮＡＤＰ依存性ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子であることがさらに好ましい。
　さらに、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加させる効果を有する外来の遺伝子をコードする遺伝子、および細胞内のアセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子をコードする遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物も利用可能である。具体的には、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、外来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、外来のフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子、および外来のホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子を導入した微生物であることがより好ましい。
　（培地および培養条件）
　培養に用いる培地および培養条件は、微生物の生育条件により選定すればよく、上述の糖に加えて、窒素源、無機イオン、および必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができ、特に限定されない。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合には、ＬＢ培地が例示でき、また宿主微生物として酵母を利用する場合は、ＹＰＤ培地、ＹＥＳ培地、ＥＭＭ培地等が例示できる。
　培養は、微生物の生育に好適な条件で行われればよく、特に限定されない。３ＨＰの生成効率を考慮すると、大腸菌を宿主微生物とした場合の好ましい実施形態としては、培養温度は、２０℃を超えて３７℃未満であり、より好ましくは２２～３５℃であり、さらに好ましくは２５～３０℃である。大腸菌を宿主微生物とした場合の遺伝子組換え微生物は、一般的な培養温度と比較して低い温度領域で培養した方が、３ＨＰの生成効率が向上しうる。後述の実施例に宿主微生物として大腸菌を使用している実験結果を示している。培養温度を大腸菌の至適温度（３７℃）とした場合と比較して、より低い２５℃の場合の方が、３ＨＰの生成効率が高いことが分かる。また、酵母を宿主とした場合、３ＨＰの生成効率を考慮すると、好ましい実施形態は２０℃～４２℃である。培養時間も特に制限はないが、好ましくは１０～１００時間、より好ましくは１５～６０時間である。
　微生物の培養におけるｐＨは、３ＨＰが効率的に発酵生産可能なｐＨであれば特に限定されない。本発明では、低ｐＨでも発酵産物の生成が継続するため、アルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に調整することなく培養することが可能である。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅを宿主として利用する場合、培養開始時は使用する培地のｐＨ（中性付近）から培養は開始するが、３ＨＰの生成に伴って次第に培地のｐＨは低下する。ｐＨ３付近まで培地のｐＨが低下すると宿主の生育は抑制されるが、ｐＨ３以下、例えばｐＨ１付近まで培地のｐＨが低下したとしても、培地中の炭素源は資化され、３ＨＰ生産は継続する。３ＨＰの培地中の濃度が１００ｇ／Ｌを超えた段階で培養を終了すると、培地のｐＨは４未満となる。このように、例えば、乳酸よりも約１．４倍高い微生物の生育阻害活性を有する３ＨＰについて、発酵工程においてアルカリ試薬を添加せずに培養を行い、ｐＨ４未満の３ＨＰ発酵液を得ることで、発酵工程以降の工程、例えば、発酵液からの３ＨＰ回収工程に用いる場合に、原材料の削減、工程の簡略化、およびユーティリティーの向上が期待できる。なお、微生物の生育、３ＨＰのｐＫａ（４．５）などを考慮して、ｐＨを適切な範囲に調整してもよい。ｐＨの調整方法としては、アルカリ性物質を発酵中に適時培養液に添加する方法や、緩衝作用を持った培地を使用する方法等がある。アルカリ性物質を適時培養液に添加する場合、アルカリ試薬として、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いることができる。また、緩衝作用を持った培地を使用する方法としては、発酵に使用する培地に予め水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム等を添加した培地を使用する方法が挙げられる。ｐＨ調整の方法として上記を記載したが、上記のようなｐＨ調整は実質的に行わずに３ＨＰ発酵を行う方法がより好ましい。
　窒素源は、使用する微生物の生育に適した窒素源を選定すればよく特に限定されない。例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーなどの利用が挙げられる。また、無機物も同様に微生物の生育に適した窒素源を選定すればよく特に限定されない。例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
　培養中は、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、オーレオバシジンＡ、ストレプトスライシン、ブラストシジン、フレオマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、アラビノース、ラクトースなどを培地に添加することができる。
　あるいは、上記において得られた生物の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当なバッファーや培地に懸濁する。この菌体懸濁液を、マロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡを含むバッファーに懸濁し、菌体での反応を行うことによって、３－ヒドロキシプロピオン酸を製造することもできる。反応の条件は、例えば、反応温度は１０～８０℃、好ましくは１５～５０℃、反応時間は５分～９６時間、好ましくは１０分～７２時間、ｐＨは５．０以上、好ましくは５．５以上で、１０．０以下、好ましくは９．７以下が例示できるが、３ＨＰ生成に適した反応条件であれば特に限定されない。反応を連続的に行う場合には、反応を１週間～３ヶ月間実施する。
　３ＨＰの精製工程に供する３ＨＰ含有溶液は、３ＨＰ濃度が好ましくは９０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１００～３００ｇ／Ｌに達した段階で発光層から回収した発酵液を用いることが好ましい。
　３－ヒドロキシプロピオン酸の精製法は当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留およびカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、培地から３－ヒドロキシプロピオン酸を得ることができる（米国特許第５，３５６，８１２号）。また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼオライト分離膜などで発酵液の濃縮を行うのが好ましい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギーを低減することができる。培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、３－ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。
　以上のように、本発明に係る製造方法によれば、第１および／または第２の遺伝子組換え微生物を用いることにより、３－ヒドロキシプロピオン酸の生産量を向上させることができる。また、３－ヒドロキシプロピオン酸が、酸の形態で得られることから、３ＨＰ塩の形態で得られる従来のアルカリ試薬を添加する方法と対比して、より容易かつ高い収率で３－ヒドロキシプロピオン酸を精製することができる。
　［アクリル酸の製造方法］
　本発明の方法で製造される３－ヒドロキシプロピオン酸は様々な分野において使用できる。一実施形態においては、上記方法によって得られた３－ヒドロキシプロピオン酸を脱水することによりアクリル酸を製造することができる。すなわち、本発明は、本発明の方法により製造される３－ヒドロキシプロピオン酸を脱水することを有する、アクリル酸の製造方法をも提供する。ここで、３－ヒドロキシプロピオン酸の脱水は、公知の反応によって実施することができる。例えば、米国特許第２，４６９，７０１号にも記載されているように、３－ヒドロキシプロピオン酸は、触媒の存在下で減圧蒸留することにより容易にアクリル酸に変換することができる。
　また、本発明の方法で得られるアクリル酸を含む組成物は精製してもよく、精製を行う場合は、好ましくは、晶析工程を用いる。したがって本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸を、晶析等の精製工程により精製し、精製アクリル酸を得る製造方法をも提供する。
　晶析工程は、アクリル酸を含む組成物を晶析装置に供給して結晶化させることにより、精製アクリル酸を得る工程である。なお、結晶化の方法としては、従来公知の結晶化方法を採用すればよく、特に限定されるものではないが、結晶化は、例えば、連続式または回分式の晶析装置を用いて、１段または２段以上で実施することができる。得られたアクリル酸の結晶は、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行うことにより、さらに純度の高い精製アクリル酸を得ることができる。
　連続式の晶析装置としては、例えば、結晶化部、固液分離部および結晶精製部が一体になった晶析装置（例えば、新日鐵化学社製のＢＭＣ（Backmixing Column Crystallizer）装置、月島機械社製の連続溶融精製システム）や、結晶化部（例えば、GMF GOUDA社製のＣＤＣ（Cooling Disk Crystallizer）装置）、固液分離部（例えば、遠心分離器、ベルトフィルター）および結晶精製部（例えば、呉羽テクノエンジ社製のＫＣＰ（Kureha Crystal Purifier）精製装置）を組み合わせた晶析装置などを使用することができる。
　回分式の晶析装置としては、例えば、Sulzer Chemtech社製の層結晶化装置（動的結晶化装置）、BEFS PROKEM社製の静的結晶化装置などを使用することができる。
　動的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクと、結晶器に粗アクリル酸を供給する循環ポンプとを備え、結晶器の下部に設けた貯蔵器から循環ポンプにより粗アクリル酸を結晶器の管内上部に移送できる動的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。また、静的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器であり、下部に抜き出し弁を有する結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクとを備えた静的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。
　具体的には、粗アクリル酸を液相として結晶器に導入し、液相中のアクリル酸を冷却面（管壁面）に凝固・生成させる。冷却面に生成した固相の質量が、結晶器に導入した粗アクリル酸に対して、好ましくは１０～９０質量％、より好ましくは２０～８０質量％になったら、直ちに、液相を結晶器から排出し、固相と液相とを分離する。液相の排出は、ポンプで汲み出す方式（動的結晶化）、結晶器から流出させる方式（静的結晶化）のいずれであってもよい。他方、固相は、結晶器から取り出した後、さらに純度を向上させるために、洗浄や発汗などの精製を行ってもよい。
　動的結晶化や静的結晶化を多段で行う場合、向流の原理を採用すれば、有利に実施することができる。このとき、各段階で結晶化されたアクリル酸は、残留母液から分離され、より高い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。他方、残留母液は、より低い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。
　なお、動的結晶化では、アクリル酸の純度が低くなると、結晶化が困難になるが、静的結晶化では、動的結晶化に比べて、残留母液が冷却面に接触する時間が長く、また、温度の影響が伝わり易いので、アクリル酸の純度が低下しても、結晶化が容易である。それゆえ、アクリル酸の回収率を向上させるために、動的結晶化における最終的な残留母液を静的結晶化に付して、さらに結晶化を行ってもよい。
　必要となる結晶化段数は、どの程度の純度が要求されるかに依存するが、高純度のアクリル酸を得るために必要な段数は、精製段階（動的結晶化）が通常１～６回、好ましくは２～５回、より好ましくは２～４回であり、ストリッピング段階（動的結晶化および／または静的結晶化）が通常０～５回、好ましくは０～３回である。通常、供給される粗アクリル酸より高い純度を有するアクリル酸が得られる段階は、すべて精製段階であり、それ以外の段階は、すべてストリッピング段階である。ストリッピング段階は、精製段階から残留母液に含まれるアクリル酸を回収するために実施される。なお、ストリッピング段階は、必ずしも設ける必要はなく、例えば、蒸留塔を用いて、晶析装置の残留母液から低沸点成分を分離する場合には、ストリッピング段階は省略してもよい。
　動的結晶化および静的結晶化のいずれを採用する場合であっても、晶析工程で得られるアクリル酸の結晶は、そのまま製品としてもよいし、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行ってから製品としてもよい。他方、晶析工程で排出される残留母液は、系外に取り出してもよい。
　［吸水性樹脂の製造方法］
　上記方法で製造されるアクリル酸は、ポリアクリル酸等のアクリル酸誘導体の原料として使用可能であることは公知となっていることから、上記アクリル酸の製造方法を、アクリル酸誘導体の製造方法におけるアクリル酸製造工程にすることも可能である。すなわち、一実施形態においては、上記方法によって得られたアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、これを必要であれば他のモノマーと（共）重合することにより、吸水性樹脂を製造することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、前記部分中和アクリル酸を架橋性モノマーと共重合することを有する、吸水性樹脂の製造方法をも提供する。ここで、上記部分中和および（共）重合は、公知の反応によって実施することができ、例えば、本発明の製造方法により得られたアクリル酸および／またはその塩を単量体成分の主成分（好ましくは７０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上）とし、さらに０．００１～５モル％（アクリル酸に対する値）程度の架橋剤、０．００１～２モル％（単量体成分に対する値）程度のラジカル重合開始剤を用いて、架橋重合させた後、乾燥・粉砕することにより、吸水性樹脂が得られる。
　ここで、吸水性樹脂とは、架橋構造を有する水膨潤性水不溶性のポリアクリル酸であって、自重の３倍以上、好ましくは１０～１，０００倍の純水または生理食塩水を吸水し、また、水溶性成分（水可溶分）が好ましくは２５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である水不溶性ヒドロゲルを生成するポリアクリル酸を意味する。このような吸水性樹脂の具体例や物性測定法は、例えば、米国特許第６，１０７，３５８号、米国特許第６，１７４，９７８号、米国特許第６，２４１，９２８号などに記載されている。
　また、生産性向上の観点から好ましい製造方法は、例えば、米国特許第６，８６７，２６９号、米国特許第６，９０６，１５９号、米国特許第７，０９１，２５３号、国際公開第０１／０３８４０２号、国際公開第２００６／０３４８０６号などに記載されている。
　アクリル酸を出発原料として、中和、重合、乾燥などにより、吸水性樹脂を製造する一連の工程は、例えば、以下の通りである。
　本発明の製造方法により得られるアクリル酸の一部は、ラインを介して、吸水性樹脂の製造プロセスに供給される。吸収性樹脂の製造プロセスにおいては、アクリル酸を中和工程、重合工程、乾燥工程に導入して、所望の処理を施すことにより、吸水性樹脂を製造する。各種物性の改善を目的として所望の処理を施してもよく、例えば、重合中または重合後に架橋工程を介在させてもよい。
　中和工程は、任意の工程であり、例えば、所定量の塩基性物質の粉末または水溶液と、アクリル酸やポリアクリル酸（塩）とを混合する方法が例示されるが、従来公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。なお、中和工程は、重合前または重合後のいずれで行なってもよく、また、重合前後の両方で行なってもよい。アクリル酸やポリアクリル酸（塩）の中和に用いられる塩基性物質としては、例えば、炭酸（水素）塩、アルカリ金属の水酸化物、アンモニア、有機アミンなど、従来公知の塩基性物質を適宜用いればよい。また、ポリアクリル酸の中和率は、特に限定されるものではなく、任意の中和率（例えば、３０～１００モル％の範囲内における任意の値）となるように調整すればよい。
　重合工程における重合方法は、特に限定されるものではなく、ラジカル重合開始剤による重合、放射線重合、電子線や活性エネルギー線の照射による重合、光増感剤による紫外線重合など、従来公知の重合方法を用いればよい。また、重合開始剤、重合条件など各種条件については、任意に選択することができる。もちろん、必要に応じて、架橋剤や他の単量体、さらには水溶性連鎖移動剤や親水性高分子など、従来公知の添加剤を添加してもよい。
　重合後のアクリル酸塩系ポリマー（すなわち、吸水性樹脂）は、乾燥工程に付される。乾燥方法としては、特に限定されるものではなく、熱風乾燥機，流動層乾燥機，ナウター式乾燥機など、従来公知の乾燥手段を用いて、所望の乾燥温度、好ましくは７０～２３０℃で、適宜乾燥させればよい。
　乾燥工程を経て得られた吸水性樹脂は、そのまま用いてもよく、さらに所望の形状に造粒・粉砕、表面架橋をしてから用いてもよく、還元剤、香料、バインダーなど、従来公知の添加剤を添加するなど、用途に応じた後処理を施してから用いてもよい。
　［アクリル酸エステルおよびアクリル酸エステル樹脂の製造方法］
　本発明の一実施形態においては、上述の方法で製造されるアクリル酸をアルコールと反応させてエステル化することにより、アクリル酸エステルを製造することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸をエステル化することを有する、アクリル酸エステルの製造方法を提供する。
　前記エステル化は、アクリル酸のカルボキシ基をアルコールの水酸基と脱水縮合する反応である。当該エステル化反応は、特に制限されず、公知の技術を適宜採用することができるが、触媒存在下でエステル化反応を行うことが好ましい。
　前記アルコールとしては、所望とするアクリル酸エステルに応じて適宜選択されうる。具体的なアルコールとしては、例えば、炭素数１～４の低級脂肪族アルコールや炭素数３～６の脂環式アルコールが挙げられる。
　前記触媒としては、特に制限されないが、強酸性陽イオン交換樹脂等が挙げられる。この際、前記強酸性陽イオン交換樹脂の具体例としては、Ｃ－２６Ｃ（デュオライト社製）、ＰＫ－２０８、ＰＫ－２１６、ＰＫ－２２８（いずれも三菱化学株式会社製）、ＭＳＣ－１，８８（ダウ社製）、アンバーリストー１６（ロームアンドハース社製）、ＳＰＣ－１０８、ＳＰＣ－１１２（いずれもバイエル社製）等が挙げられる。
　また、前記エステル化反応においては、重合禁止剤等の添加剤を添加して行ってもよい。
　前記重合禁止剤としては、特に制限されないが、ハイドロキノン、メトキノン（ｐ－メトキシフェノール）等のキノン類；フェノチアジン、ビス－（α－メチルベンジル）フェノチアジン、３，７－ジオクチルフェノチアジン、ビス－（α－ジメチルベンジル）フェノチアジン等のフェノチアジン類；２，２，６，６－テトラメチルピペリジノオキシル、４－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジノオキシル、４，４’，４”－トリス－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジノオキシル）フォスファイト等のＮ－オキシル化合物；ジアルキルジチオカルバミン酸銅、酢酸銅、ナフテン酸銅、アクリル酸銅、硫酸銅、硝酸銅、塩化銅等の銅塩化合物；ジアルキルジチオカルバミン酸マンガン、ジフェニルジチオカルバミン酸マンガン、ギ酸マンガン、酢酸マンガン、オクタン酸マンガン、ナフテン酸マンガン、過マンガン酸マンガン、エチレンジアミン四酢酸のマンガン塩等のマンガン塩化合物；Ｎ－ニトロソフェニルヒドロキシルアミンやその塩、ｐ－ニトロソフェノール、Ｎ－ニトロソジフェニルアミンやその塩等のニトロソ化合物等が挙げられる。これらのうち、前記重合禁止剤として、ハイドロキノン、メトキノン等のキノン類を用いることが好ましい。なお、これらの重合禁止剤は単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　エステル化は通常液相にて行われうる。また、エステル化の反応温度としては、反応によっても異なるが、通常、５０℃～１１０℃の範囲である。
　具体的なエステル化によるアクリル酸エステルを製造する方法としては、例えば、特公平６－８６４０６号公報に開示されている方法を用いることができる。
　また、本発明の一実施形態においては、上記で製造されるアクリル酸エステルを単量体成分として使用する重合反応を行うことにより、アクリル酸エステル樹脂を製造することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸エステルを含む単量体成分を重合することを有する、アクリル酸エステル樹脂の製造方法をも提供する。
　アクリル酸エステル樹脂は、アクリル酸エステルおよび任意の他の単量体を含む単量体成分を公知の重合方法により重合することで製造することができる。
　前記他の単量体としては、（メタ）アクリル酸およびそのエステルやアミド等が挙げられる。これらの単量体を組み合せて重合することにより、所望の重合体を得ることができる。
　重合方法としては、特に制限されず、溶液重合、懸濁重合、乳化重合、バルク重合等の公知の方法を用いることができる。
　通常の（メタ）アクリル系重合体と同様に、各単量体成分のホモポリマーのガラス転移温度を指標に、ＦＯＸの式に基づき設計することにより、様々な性質を有するアクリル酸エステル樹脂を得ることができる。このようにして得られたアクリル酸エステル樹脂は、粘着剤、分散剤、接着剤、フィルム、シート、塗料等の様々な用途に用いることができる。
　本発明はまた、マロニルＣｏＡレダクターゼ活性および／またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を含む、マロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡから３－ヒドロキシプロピオン酸を製造するための組成物に関する。当該組成物は、これらの酵素を産生する生物またはその処理物から製造することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（例１：Schizosaccharomyces pombe OB2の耐酸性試験）
　３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含有する酸性培地（３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地）を用いて、S. pombe OB2が３ＨＰを含有し、酸性の条件で代謝産物の生産が可能か否かを検討した。
　はじめに、S. pombe OB2の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB2 (h＋ leu1-32 ura4-D18)（島根大学、生物資源科学部、川向誠教授より分譲）を、ＹＥＳ液体培地５ｍＬ（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝30g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ヒスチジン＝0.225g/L）に植菌し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　次に、３ＨＰを含有する酸性培地（３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地）を以下のように調製した。具体的には、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）試薬（東京化成工業株式会社製）を終濃度が１２０ｇ／ＬとなるようにＹＥＳ液体培地に添加して、ｐＨ２．６の３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地を得た（３ＨＰ試薬の３ＨＰ濃度は２００ｇ／Ｌとして換算）。
　そして、S. pombe OB2が３ＨＰを含有する酸性培地で代謝産物の生産が可能かを以下の方法で検討した。すなわち、上記で得た菌体ペレット全量を、３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地５ｍＬで懸濁し、３０℃で９６時間振盪培養を行った。得られた培養液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養液の上清を採取した。上清を５ｍＭ硫酸で１０倍希釈した後、０．４５μｍフィルターに通し、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：Aminex HPX-87H lon exclusion column 300mm×7.8mm (BIO-RAD社）
　移動相：5mM 硫酸
　流速：0.5mL/min
　カラム温度：20℃
　検出：RI
　インジェクション量：10μL。
　当該ＬＣ分析から、培養上清中のグルコース濃度およびエタノール濃度を算出した。分析結果を表１に示す。３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地を用いたS. pombe OB2株の培養液において、グルコースの消費、およびエタノールの生成が確認された。また、３ＨＰの減少も観察されなかった。このことから、S. pombe OB2は３ＨＰを含有する酸性培地においても十分に代謝産物の生産が可能であることが示唆された。つまり、S. pombe OB2は、中和を行うことなく代謝を継続することができることが示唆された。
　（例２：Kluyveromyces marxianus ATCC52486の耐酸性試験）
　３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含有する酸性培地（３ＨＰ添加ＹＭ液体培地）を用いて、K. marxianus ATCC52486が３ＨＰを含有し、酸性の条件で育成可能か否かを検討した。
　はじめに、K. marxianus ATCC52486の培養を行った。より詳細には、K. marxianus ATCC52486を、ＹＭ液体培５ｍＬ（酵母エキス＝3g/L、Malt extract＝3g/L、グルコース＝10g/L、ペプトン＝5g/L）に植菌し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　次に、３ＨＰを含有する酸性培地（３ＨＰ添加ＹＭ液体培地）を以下のように調製した。具体的には、３ＨＰ試薬（東京化成工業株式会社製）を終濃度が１２０ｇ／ＬとなるようにＹＭ液体培地に添加して、ｐＨ２．４の３ＨＰ添加ＹＭ液体培地を得た（３ＨＰ試薬の３ＨＰ濃度は２００ｇ／Ｌとして換算）。
　そして、K. marxianus ATCC52486が３ＨＰを含有する酸性培地で育成可能かを以下の方法で検討した。すなわち、上記で得た菌体ペレット全量を、３ＨＰ添加ＹＭ液体培地５ｍＬで懸濁し、３０℃で９６時間振盪培養を行った。得られた培養液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養液の上清を採取した。上清を５ｍＭ硫酸で１０倍希釈した後、０．４５μｍフィルターに通し、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：Aminex HPX-87H lon exclusion column 300mm×7.8mm (BIO-RAD社）
　移動相：5mM 硫酸
　流速：0.5mL/min
　カラム温度：20℃
　検出：RI
　インジェクション量：10μL。
　当該ＬＣ分析から、培養上清中のグルコース濃度およびエタノール濃度を算出した。分析結果を表１に示す。３ＨＰ添加ＹＥＳ液体培地を用いたK. marxianus ATCC52486株の培養液において、グルコースの消費、およびエタノールの生成は確認されなかった。また、３ＨＰの減少も観察されなかった。このことから、K. marxianus ATCC52486は３ＨＰを含有する酸性培地において代謝を行うことができず、中和処理が必須となりうることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（例３：各種プラスミドの構築）
　（例３－１：ｐＡＤＨの構築）
　ａｄｈ１断片、Ｇ４１８Ｒ断片、およびｎｍｔ１断片をｐＵＣ１８に導入したプラスミドｐＡＤＨ（Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）の構築を行った。以下に詳細を示す。なお、ｐＡＤＨのプラスミドマップを図２に示す。
　S. pombe OB2のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Alchol dehydrogenase周辺領域断片（ａｄｈ１断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ａｄｈ１断片およびｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ａｄｈ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　ａｄｈ１／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ａｄｈ１／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ｐＭＫ３８（ナショナルバイオリソースプロジェクト・酵母より入手、NBRP ID：BYP6739）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８耐性遺伝子断片（Ｇ４１８Ｒ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ａｄｈ１／ｐＵＣ１８断片およびＧ４１８Ｒ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１／ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　前記のＰＣＲ増幅により得た、Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１／ｐＵＣ１８断片およびｎｍｔ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ａｄｈ１－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例３－２：ｐＧＰＤの構築）
　ｇｐｄ１断片、Ｇ４１８Ｒ断片、およびｎｍｔ１断片をｐＵＣ１８に導入したプラスミドｐＧＰＤ（Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）の構築を行った。以下に詳細を示す。なお、ｐＧＰＤのプラスミドマップを図３に示す。
　S. pombe OB2株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Glycerol-3-phophate dehydrogenase周辺領域断片（ｇｐｄ１断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｇｐｄ１断片およびｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡを以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ｐＭＫ３８（ナショナルバイオリソースプロジェクト・酵母より入手、NBRP ID：BYP6739）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８耐性遺伝子断片（Ｇ４１８Ｒ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８断片およびＧ４１８Ｒ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　前記のＰＣＲ増幅により得た、Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１／ｐＵＣ１８断片およびｎｍｔ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ｇｐｄ１－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例３－３：ｐＧ４１８の構築）
　Ｇ４１８Ｒ断片、ＨｙｇＲ断片（ＨｙｇＲ＿ＯＲＦ断片をｐＡＵＲ２２４に導入することにより構築）、およびｎｍｔ１断片をｐＵＣ１８に導入したプラスミドｐＧ４１８（Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）の構築を行った。以下に詳細を示す。なお、ｐＧ４１８のプラスミドマップを図４に示す。
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ｐＭＫ３８（ナショナルバイオリソースプロジェクト・酵母より入手、NBRP ID：BYP6739）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８耐性遺伝子断片（Ｇ４１８Ｒ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｐＵＣ１８断片およびＧ４１８Ｒ断片を用いて、Ｉｎ-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ／ｐＵＣ１８を構築した。
　Ｇ４１８Ｒ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ｐＡＵＲ２２４（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＵＲ２２４断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｈｙｇ（和光純薬工業）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ハイグロマイシンＢ耐性構造遺伝子断片（ＨｙｇＲ＿ＯＲＦ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｐＡＵＲ２２４断片およびＨｙｇＲ＿ＯＲＦ断片を用いて、Iｎ-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの下流にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入された、ＨｙｇＲ／ｐＡＵＲ２２４を構築した。
　ＨｙｇＲ／ｐＡＵＲ２２４のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子断片（ＨｙｇＲ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　前記のＰＣＲ増幅により得た、Ｇ４１８Ｒ／ｐＵＣ１８断片およびＨｙｇＲ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
　Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　前記のＰＣＲ増幅により得た、Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８断片およびｎｍｔ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｇ４１８Ｒ－ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例３－４：ｐＨＹＧの構築）
　ＨｙｇＲ断片、ＡｂＡＲ断片、およびｎｍｔ１断片をｐＵＣ１８に導入したプラスミドｐＨＹＧ（ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）の構築を行った。以下に詳細を示す。なお、ｐＨＹＧのプラスミドマップを図５に示す。
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　ＨｙｇＲ／ｐＡＵＲ２２４のプラスミドＤＡＮをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子断片（ＨｙｇＲ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｐＵＣ１８断片およびＨｙｇＲ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
　ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　ｐＡＵＲ２２４（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子断片（ＡｂＡＲ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＨｙｇＲ／ｐＵＣ１８断片およびＡｂＡＲ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
　ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片およびｎｍｔ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＨｙｇＲ－ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例３－５：ｐＡＵＲの構築）
　ＡｂＡＲ断片、ｌｅｕ２断片、およびｎｍｔ１断片をｐＵＣ１８に導入したプラスミドｐＡＵＲ（ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）の構築を行った。以下に詳細を示す。なお、ｐＡＵＲのプラスミドマップを図６に示す。
　ｐＡＵＲ２２４（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子断片（ＡｂＡＲ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＡｂＡＲ断片およびｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
　ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、beta-isopropyl-malate dehydrogenase断片（ｌｅｕ２断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片およびｌｅｕ２断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８を構築した。
　ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　ＲＥＰ３Ｘ（ＡＴＣＣ８７６０３）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ／ｐＵＣ１８断片およびｎｍｔ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例４：各種ベクターへの外来遺伝子のクローニング）
　（例４－１：ＣＰ＿ＧＤ＿α／ｐＡＤＨの構築）
　ｐＡＤＨにClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤ）のαサブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤ＿α／ｐＡＤＨを構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤのαサブユニット断片（ＣＰ＿ＧＤ＿α断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＤＨ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤ＿α断片およびｐＡＤＨ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１プロモーター下流にＣＰ＿ＧＤ＿α断片が挿入されたＣＰ＿ＧＤ＿α／ｐＡＤＨを構築した。
　（例４－２：ＣＰ＿ＧＤ＿β／ｐＡＤＨの構築）
　ｐＡＤＨにClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤ）のβサブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤ＿β／ｐＡＤＨを構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤのβサブユニット断片（ＣＰ＿ＧＤ＿β断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＤＨ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤ＿β断片およびｐＡＤＨ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い，ｎｍｔ１プロモーター下流にＣＰ＿ＧＤ＿β断片が挿入されたＣＰ＿ＧＤ＿β／ｐＡＤＨを構築した。
　（例４－３：ＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８の構築）
　ｐＧ４１８にClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤ）のγサブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８を構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤのγサブユニット断片（ＣＰ＿ＧＤ＿γ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　ｐＧ４１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＧ４１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤ＿γ断片およびｐＧ４１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１プロモーター下流にＣＰ＿ＧＤ＿γ断片が挿入されたＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８を構築した。
　（例４－４：ＣＰ＿ＧＤ＿βandγ／ｐＧ４１８の構築）
　ｐＧ４１８にClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤ）のβサブユニットおよびγサブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤ＿βandγ／ｐＧ４１８を構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ＿ＧＤ＿β／ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Glycerol dehydratase βサブユニット発現カセット断片（ＣＰ＿ＧＤ＿β発現カセット断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８必要領域断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤ＿β発現カセット断片およびＣＰ＿ＧＤ＿γ／ｐＧ４１８必要領域断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＣＰ＿ＧＤ＿βandγ／ｐＧ４１８を構築した。
　（例４－５：ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧの構築）
　ｐＨＹＧにClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ再活性化因子（ＧＤＲ）のＬ（Large）サブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧを構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤＲのＬサブユニット断片（ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　ｐＨＹＧのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＨＹＧ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ断片およびｐＨＹＧ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１プロモーター下流にＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ断片が挿入されたＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧを構築した。
　（例４－６：ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ／ｐＡＤＨの構築）
　ｐＨＹＧにClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ再活性化因子（ＧＤＲ）のＳ（Small）サブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ／ｐＡＤＨを構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤＲのＳサブユニット断片（ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＤＨ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤ＿Ｓ断片およびｐＡＤＨ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１プロモーター下流にＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ断片が挿入されたＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ／ｐＡＤＨを構築した。
　（例４－７：ＣＰ＿ＧＤＲ＿ＬandＳ／ｐＨＹＧの構築）
　ｐＨＹＧにClostridium perfiringens ATCC13124（ＣＰ）株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ再活性化因子（ＧＤＲ）のＬ（Large）サブユニットおよびＳ（Small）サブユニットを導入し、ＣＰ＿ＧＤＲ＿ＬandＳ／ｐＨＹＧを構築した。以下に詳細を示す。
　ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ／ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Glycerol dehydratase reactivating factor Smallサブユニット断片発現カセット断片（ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ発現カセット断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧ必要領域断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｓ発現カセット断片およびＣＰ＿ＧＤＲ＿Ｌ／ｐＨＹＧ必要領域断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＣＰ＿ＧＤＲ＿ＬａｎｄＳ／ｐＨＹＧを構築した。
　（例４－８：ａｌｄＨ／ｐＡＵＲの構築）
　ｐＡＵＲにEscherichia coli W3110（E.coli）株由来のγ－グルタミル－γ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）を導入し、ａｌｄＨ／ｐＡＵＲを構築した。以下に詳細を示す。
　E.coli株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ａｌｄＨ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　ｐＡＵＲのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＵＲ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ａｌｄＨ断片およびｐＡＵＲ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１プロモーター下流にａｌｄＨ断片が挿入されたａｌｄＨ／ｐＡＵＲを構築した。
　（例５：形質転換に用いるＤＮＡ断片の作製）
　（例５－１：Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）の作製）
　ＣＰ－ＧＤ＿α／ｐＡＤＨからＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーターを調製した。
　具体的には、ＣＰ－ＧＤ＿α／ｐＡＤＨのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High‐Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　（例５－２：ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）の作製）
　ＣＰ－ＧＤ＿βandγ／ｐＧ４１８からＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーターを調製した。
　具体的には、ＣＰ－ＧＤ＿βandγ／ｐＧ４１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High‐Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　（例５－３：ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿Ｓ）の作製）
　ＣＰ－ＧＤＲ＿ＬandＳ／ｐＨＹＧからＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーターを調製した。
　具体的には、ＣＰ－ＧＤＲ＿ＬandＳ／ｐＨＹＧのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（FinnzymeFinnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬａｎｄＳ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　（例５－４：Ｌｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）の作製）
　ａｌｄＨ／ｐＡＵＲからＬｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーターを調製した。
　具体的には、ａｌｄＨ／ｐＡＵＲのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｌｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　（例６：形質転換）
　（例６－１：S. pombe OB1(GD_α)の作製）
　上記例５－１で作製したＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）をSchizosaccharomyces pombe OB1に形質転換し、S. pombe OB1(GD_α)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe OB1の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB１(h-leu1-32 ura4-D18)（島根大学、生物資源科学部、川向誠教授より分譲）をＹＥＳ液体培地（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝30g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L）に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB1にＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、ｐＨ４．９に調整された０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液（１００ｍＭ　Litium Acetate、１０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、酢酸を含む）を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）２μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコール３３４５＝５００ｇ／Ｌ）２９０μＬを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水３００μＬで菌体ペレットを懸濁し、次いで、ＹＥＳ寒天培地（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝30g/L、寒天＝２0g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン=0.225g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L）に塗扶して３０℃で２４時間インキュベートを行った。レプリカプレート法にて、終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８を添加したＹＥＳ寒天培地に接種して、３０℃で７２時間インキュベートを行った。得られたシングルコロニーを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。次いで、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを用いて、Puregene Yeast／Bact kit B（Qiagen社）のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、Ｇ４１８耐性S. pombeのゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーセット（１）およびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
　S. pombeにＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）が導入されているか確認したところ、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）が挿入された場合にのみ観察される、約３．８ｋｂのＰＣＲ増幅断片が確認されたことから、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿α）がS.pombeの染色体に挿入されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　（例６－２：S. pombe OB1(GD)の作製）
　上記例５－２で作製したＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）を上記例６－１で作製したS. pombe OB1(GD_α)に形質転換し、S. pombe OB1(GD)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe OB1(GD_α)の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB1(GD_α)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB1(GD_α)にＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）２μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μＬを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水３００μＬで菌体ペレットを懸濁し、次いで、ＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で２４時間インキュベートを行った。レプリカプレート法にて、終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにHygromycin B（Hyg）を添加したＹＥＳ寒天培地に接種して、３０℃で７２時間インキュベートを行った。得られたシングルコロニーを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。次いで、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを用いて、Puregene Yeast/Bact kit B（Qiagen社）のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、Hyg耐性S. pombeのゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーセット（２）、プライマーセット（３）、およびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
　S. pombe OB1(GD_α)にＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）が導入されているか確認したところ、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）が挿入された場合にのみ観察される、約３．７ｋｂと約３．２ｋｂのＰＣＲ増幅断片が確認されたことから、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤ＿βandγ）がS. pombe OB1(GD_α)の染色体に挿入されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　（例６－３：S. pombe OB1(GD,GDR)の作製）
　上記例５－３で作製したＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）を上記例６－２で作製したS. pombe OB1(GD)に形質転換し、S. pombe OB1(GD,GDR)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe OB1(GD)の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB１(GD)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB1(GD)にＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）２μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μＬを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水３００μＬで菌体ペレットを懸濁し、次いで、ＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で２４時間インキュベートを行った。レプリカプレート法にて、終濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるようにAureobasidin A（AbA）を添加したＹＥＳ寒天培地に接種して、３０℃で７２時間インキュベートを行った。得られたシングルコロニーを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。次いで、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを用いて、Puregene Yeast/Bact kit B（Qiagen社）のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、AbA耐性S. pombeのゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーセット（４）、プライマーセット（５）、およびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
　S. pombe OB1(GD)にＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）が導入されているか確認したところ、ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）が挿入された場合にのみ観察される、約１．６ｋｂと約１．５ｋｂのＰＣＲ増幅断片が確認されたことから、ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１プロモーター（ＧＤＲ＿ＬandＳ）がS. pombe OB１(GD)の染色体に挿入されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　（例６－４：S.pombe OB1 (GD,GDR)の培養菌体粗酵素溶液の調製）
　S. pombe OB1(GD,GDR)のコロニーを、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回実施し、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液をＥＭＭ液体培地に、２．２１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう植菌し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。得られた培養液を１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を実施後、上清を廃棄し、培養菌体を得た。得られた培養菌体をYeastBuster Protein Extraction Reacgent（Novagen社）によって処理し、粗酵素溶液を得た。
　（例６－５：S.pombe (GD,GDR）培養菌体粗酵素溶液のグリセリン脱水活性測定）
　１００ｍＭのＧｌｙｃｅｒｏｌ，１５μＭのＡｄｏ－Ｃｂｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＡＴＰ、前記粗酵素０．５６ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ７．０）を混合し、暗所において３７℃でインキュベートした。反応液と同量の０．１Ｍクエン酸Ｋバッファー（ｐＨ３．５）にサンプリングした反応液を加え、反応を停止した。得られた反応液を蒸留水で１０倍希釈した溶液に、０．１％の３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを１／４倍量添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。これを１０倍希釈し、ＯＤ３０５の値を測定した。反応開始６０分後の反応を停止した反応液中にグリセリンが脱水することで生じたと考えられる０．１ｍＭのアルデヒドが含まれることを確認した。よって、前記結果からS.pombe (GD,GDR)がグリセリン脱水活性を有することが明らかとなった。
　（例６－６：S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)の作製）
　上記例５－４で作製したＬｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）を上記例６－３で作製したS. pombe OB1(GD,GDR)に形質転換し、S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe OB1(GD,GDR)の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB１(GD,GDR)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB1(GD,GDR)にＬｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、Ｌｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）２μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μＬを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水３００μＬで菌体ペレットを懸濁し、次いで、ロイシン無添加ＥＭＭ寒天培地（MP Biomedicals社試薬に、寒天＝20g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/Lを添加したもの）に塗扶して３０℃で９６時間インキュベートを行った。得られたシングルコロニーを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。次いで、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを用いて、Puregene Yeast/Bact kit B（Qiagen社）のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、ロイシン要求性相補S. pombeのゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーセット（６）およびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
　S. pombe OB１(GD,GDR)にＬｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）が導入されているか確認したところ、Ｌｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）が挿入された場合にのみ観察される、約４．７ｋｂのＰＣＲ増幅断片が確認されたことから、Ｌｅｕ２－ｎｍｔ１プロモーター（ａｌｄＨ）がS. pombe OB１(GD,GDR)の染色体に挿入されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　このようにして得られた外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、および外来のアルデヒドデヒドオキシダーゼをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物、すなわち、Schizosaccharomyces pombe OB01(GD,GDR,aldH)を、Schizosaccharomyces pombe NSH-1と命名した。
　（実施例１：S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)による３ＨＰ産生）
　上記例６－３で作製したS. pombe OB1(GD,GDR,aldH)：Schizosaccharomyces pombe NSH-1を用いて、３ＨＰが産生されるか検討した。
　はじめに、S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)の培養を行った。具体的には、S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)のコロニーを、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回行い、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。
　そして、３ＨＰが産生されるかの検討を行った。具体的には、菌体懸濁液を１０ｇ／Ｌグリセリンおよび０．８ｍＭアデノシルコバラミン添加ＥＭＭ液体培地に、１．５６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を実施し、培養上清を得た。得られた上清を、０．２５Ｍ硫酸で１０倍希釈した希釈溶液１００μＬに、内部標準液２００μＬを加えた。次いで、ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、および試薬Ｂ液２００μＬを加えてよく混合した後、６０℃で２０分間処理した。室温まで冷却した後、０．４５ｍｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：YMC－pACK FA（YMC社）
　流量：0.2ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55(V/V/V)
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl-n-butyric acid
　検出：UV 400nm。
　その結果、培養開始１１２時間後のＬＣ分析サンプルでは、インジェクション後３９分の位置に３ＨＰのピークと一致するピークを確認した。
　また、上記上清を用いて、酢酸の生成を確認した。具体的には、上記上清を５ｍＭ硫酸溶液で１０倍希釈した後、０．４５　ｍｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：　Aminex HPX-87Ｈ lon exclusion column 300ｍμ×7.8ｍμ (Bio－Rad)
　流量：0.5ml/min
　インジェクション量：10μl
　移動相：5ｍM硫酸溶液
　検出：RI。
　その結果、培養開始６４時間後の酢酸生成量０．４ｇ／Ｌが最大であった。なお、S. pombe OB1(GD,GDR,aldH)の酢酸生成量を、後述するE. coli fusion blue（TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LR_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18）の酢酸生成量と対比すると、S. pombeを宿主として利用した方が酢酸の生成量が低いことが確認された（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
　（例７：各種プラスミドの構築）
　（例７－１：ＴａｃＰ－ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦの構築）
　ＧＤＰ－ＧＰＰ断片（ＧＤＰ断片およびＧＰＰ断片をｐＵＣ１８に導入することにより構築）、およびＴａｃＰ断片をｐＣＤＦに導入したプラスミドＴａｃＰ－ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦの構築を行った。
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　Saccharomyces cerevisiae ATCC204508のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片（ＧＤＰ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　Saccharomyces cerevisiae ATCC204508のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、グリセロール－３－３ホスファターゼ遺伝子断片（ＧＰＰ断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　前述のＰＣＲ増幅により得た、ｐＵＣ１８断片、ＧＤＰ断片、ＧＰＰ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、S. cerevisiae由来のＧＤＰ遺伝子およびＧＰＰ遺伝子が、Ｌａｃプロモーター下流にクローニングされたＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＵＣ１８を構築した。
　ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＵＣ１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤＰ－ＧＰＰ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１(Novagen社)のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＣＤＦ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　ＰＣＲ増幅により得た、ｐＣＤＦ断片、ＧＤＰ－ＧＰＰ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦを構築した。
　ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１（Invitrogen社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High－Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＴａｃＰ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　ＰＣＲ増幅により得た、ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦ断片、ＴａｃＰ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、S. cerevisiae由来ＧＤＰ遺伝子およびＧＰＰ遺伝子がＴａｃプロモーター下流にクローニングされたＴａｃＰ－ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦを構築した。
　（例７－２：ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ｐＡＣＹＣの構築）
　ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片（ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片をＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１に導入することにより構築）をｐＡＣＹＣに導入したプラスミドＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ｐＡＣＹＣの構築を行った。
　Lactobacillus reuteri JCM1112株　のゲノムＤＮＡをテンプテレ－トとしてジオールデヒドラターゼ遺伝子（ＤＤ遺伝子）およびジオールデヒドラターゼ再活性化因子（ＤＤＲ遺伝子）を含む領域を、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１（Invitrogen社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　ＰＣＲ増幅により得た、ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片、ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｔａｃプロモーター下流にL. reuteri由来のＤＤ－ＤＤＲ遺伝子が挿入された、ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１を構築した。
　ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Novagen社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＣＹＣ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　ＰＣＲ増幅により得た、ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ断片、ｐＡＣＹＣ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ｐＡＣＹＣを構築した。
　（例７－３：ＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８の構築）
　ＴａｃＰ－ａｌｄＨ断片（ａｌｄＨ断片をＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１に導入することにより構築）をｐＵＣ１８に導入したプラスミドＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８の構築を行った。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、γ－グルタミル－γ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１（Invitrogen社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
　ＰＣＲ増幅により得た、ａｌｄＨ断片、ｐｉｎｐｏｉｎｔ　Ｘａ－１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Ｔａｃプロモーター下流にE. coli由来のａｌｄＨ遺伝子が挿入された、ＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐｉｎｐｏｉｎｔ　Ｘａ－１を構築した。
　ＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐｉｎｐｏｉｎｔ　Ｘａ－１のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＴａｃＰ－ａｌｄＨ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　ｐＵＣ１８（Takara社）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzyme社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　ＰＣＲ増幅により得た、ＴａｃＰ－ａｌｄＨ断片およびｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８を構築した。
　（例８：形質転換）
　上記例７－１～例７－３で作製したＴａｃＰ－ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦ、ＴａｃＰ－ＬＲ－ＤＤ－ＤＤＲ／ｐＡＣＹＣ、およびＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８を、大腸菌に導入した。以下に詳細を示す。
　Fusion－Blue Competent Cells（Takara社）を用いて、ヒートショック法でＴａｃＰ－ＧＤＰ－ＧＰＰ／ｐＣＤＦ、ＴａｃＰ－ＬＰ＿ＤＤ－ＤＤＲ／ｐＡＣＹＣ、およびＴａｃＰ－ａｌｄＨ／ｐＵＣ１８を導入し、E. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)を取得した。なお、ヒートショック法はFusion-Blue Competent Cells（Takara社）添付のプロトコールに従って実施し、形質転換体の選抜は、クロラムフェニコールを終濃度１００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシンを終濃度５０μｇ／ｍＬ、アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにＬＢ培地（Bacto-tryptone=10 g、Bacto－yeast extract=5 g、NaCl=5 g）に添加して作成した寒天培地を用いて行った。
　（例９：E. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)によるグルコースからグリセリンへの変換）
　以上のように作製された、遺伝子組換え微生物であるE. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)を用いて、グルコースのグリセリンへの変換について検討した。
　E. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)のコロニーを、それぞれ終濃度が１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、および１００μｇ／ｍＬとなるようにクロラムフェニコール、ストレプトマイシン、およびアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で２４ｈ振盪培養を行った。得られた培養液を、培養開始時のＯＤ６６０の値が０．０１８になるように植菌し、グルコースからグリセリンを生成するのに適した温度である２５℃で振盪培養を開始した。培養開始後、ＯＤ６６０の値が１を越えた時点で、それぞれ終濃度が０．１Ｍ、および０．８ｍＭとなるようにＩＰＴＧおよびＡｄｏ－Ｃｂｌを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。得られた培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清１ｍＬを５ｍＭ硫酸溶液で１０倍希釈した後、０．４５ｍｍフィルターに通して、ＬＣ分析サンプルとした。当該ＬＣ分析サンプルを用いて、以下に示す条件で高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析を行った。
　使用カラム：Aminex HPX-87Ｈ lon exclusion column 300ｍｍ×7.8ｍｍ（Bio-Rad）
　流量：0.5ml/min
　インジェクション量：10μl
　移動相：５ｍＭ硫酸溶液
　検出：RI
　その結果、培養開始１４４時間後のグリセリン生成量５．８ｇ／Ｌが最大の蓄積量であり、その後は３ｇ／Ｌ以下に減少した。なお、E. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)のグリセリン生成量と、後述するS.pombe ATCC26189、およびS. pombe OB１のグリセリン生成量との比較については下記表３に示す。
　また、酢酸生成量についても定量した。その結果、培養開始１４４時間後の酢酸生成量は２．６ｇ／Ｌであり、培養開始２１６時間後の酢酸生成量は４．３ｇ／Ｌであった。なお、S. pombe OB１(GD,GDR,aldH)との酢酸生成量の対比については、上記表２に示す通りである。
　（例１０：S. pombeによるグルコースからグリセリンへの変換）
　S. pombeを用いて、グルコースのグリセリンへの変換について検討した。なお、S. pombeとしては、S.pombe ATCC26189(972h－)およびS. pombe OB1を用いた。
　S.pombe ATCC26189(972h－)およびS. pombe OB1のコロニーを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、ＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、グルコース添加ＹＥＳ液体培地（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝255g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L）に３．１３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清１ｍＬを５ｍＭ硫酸溶液で１０倍希釈した後、０．４５ｍｍフィルターに通して、ＬＣ分析サンプルとした。当該ＬＣサンプルを用いて、以下に示す条件で高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析を行った。
　使用カラム：Aminex HPX-87Ｈ lon exclusion column 300ｍｍ×7.8ｍｍ（Bio－Rad）
　流量：0.5ml/min
　インジェクション量：10μl
　移動相：５ｍＭ硫酸溶液
　検出：RI
　その結果、培養開始後７２時間のグリセリンの生成量は、S. pombe ATCC26189については１０．３ｇ／Ｌに達し、S. pombe OB1については１１．３ｇ／Ｌに達した。表３には、上記S. pombe ATCC26189およびS. pombe OB1のグリセリン生成量と、E. coli fusion blue(TacP-GDP-GPP/pCDF,TacP-LP_DD-DDR/pACYC,TacP-aldH/pUC18)のグリセリン生成量との比較を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
　表３によれば、S. pombeを宿主として利用した場合、遺伝子改変を行うことなくグリセリンが生成可能であり、多量のグリセリンが得られることが確認された。
　（例１１：ｍｃｒ／ｐＧＰＤプラスミドの構築）
　ｍｃｒ断片をｐＧＰＤに導入したプラスミドｍｃｒ／ｐＧＰＤの構築を行った。
　Chloroflexus aurantiacus ATCC29365株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、マロニルＣｏＡレダクターゼ（ｍｃｒ）遺伝子断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
　ｐＧＰＤのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＧＰＤ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｍｃｒ断片およびｐＧＰＤ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、C. aurantiacus由来ｍｃｒ遺伝子がｎｍｔ１プロモーター下流にクローニングされた、ｍｃｒ／ｐＧＰＤを構築した。
　（例１２：Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片の作製）
　ｍｃｒ／ｐＧＰＤからＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター断片を調製した。
　具体的には、ｍｃｒ／ｐＧＰＤのプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、以下の２つのプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　（例１３：形質転換）
　上記例１２で作製したＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片をSchizosaccharomyces pombe OB2に形質転換し、S. pombe OB2(mcr)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe OB2の培養を行った。より詳細には、S. pombe OB2をＹＥＳ液体培地（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝30g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L）に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB2にＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、ｐＨ４．９に調整された０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液（１００ｍM　Litium Acetate、１０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、酢酸を含む）を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片１μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコール３３４５＝５００ｇ／Ｌ)２９０μLを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水４００μＬで菌体ペレットを懸濁し、次いで、ＹＥＳ寒天培地（酵母エキス＝5g/L、グルコース＝30g/L、寒天＝20g/L、ヒスチジン＝0.225g/L、アデニン＝0.225g/L、ロイシン＝0.225g/L、ウラシル＝0.225g/L）に塗扶して３０℃で２０時間インキュベートを行った。培養２０時間後に、終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８を添加したＹＥＳ寒天培地に植菌し、３０℃で７２時間インキュベートを行った。得られたシングルコロニーをＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。次いで、３,０００rpmで５分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを用いて、Puregene Yeast/Bact kit B（Qiagen社）のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、Ｇ４１８耐性S. pombeのゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のプライマーセット（７）およびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
　S. pombeにＧ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）が導入されているか確認したところ、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）が挿入された場合にのみ観察される、約７．３ｋｂのＰＣＲ増幅断片が確認されたことから、Ｇ４１８Ｒ－ｎｍｔ１プロモーター（ｍｃｒ）断片がS.pombeに挿入されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
　このようにして得られた外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物、すなわち、Schizosaccharomyces pombe (mcr)を、Schizosaccharomyces pombe NSH-2と命名し、平成２４年３月９日付で、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１　つくばセンター　中央第６）に、受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ－２２２７にて寄託し、平成２５年２月２７日付で、国際寄託に移管した。なお、受領番号は、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１５２７である。
　（実施例２：S. pombe (mcr)による３ＨＰ産生）
　上記例１３で作製したS. pombe (mcr)：Schizosaccharomyces pombe NSH-2（受領番号：FERM ABP-11527）を用いて、３ＨＰが産生されるか検討した。
　S. pombe (mcr)を、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回行い、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液をＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間培養し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの培養液を得た。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、ＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液を用いて、ＥＭＭ液体培地に細胞濃度が１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、３０℃で７０時間振盪培養を行った。得られた培養液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清を０．２５Ｍ硫酸で１０倍希釈した希釈溶液１００μＬに、内部標準液２００μＬを加えた。次いで、ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、および試薬Ｂ液２００μＬを加えてよく混合した後、６０℃で２０分間処理した。さらにヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加してよく混合し、６０℃で１５分間処理した。室温まで冷却した後、０．４５μｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：YMC-pACK FA（YMC社）
　流量：0.2 ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55（V/V/V）
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl-n-butyric acid
　検出：UV 400nm
　その結果、インジェクション後３９分の位置に３ＨＰのピークと一致するピークを確認した。
　また、前記培養により得た培養上清を用いて、以下の条件でＬＣ－ＭＳ分析を行った。
　使用カラム：TSKgel Amide-80
　カラムオーブン温度：40℃
　溶離液：0.1％ギ酸
　流速：0.1 mL/min
　Mass spectrometry：3200 Q TRAP LC/MS/MS system（Applied Biosystems社）
　Mode：MRM
　Polarity：Positive
　Ion source：Turbo V source（ESI）
　温度：350 ℃
　Ion Spray voltave：5000V。
　その結果、３ＨＰと一致するｍ／ｚ＝８９が検出された。なお、図７には３ＨＰのマススペクトルおよびS. pombe (mcr)の培養上清のマススペクトルを示す。
　よって、S. pombeにｍｃｒ遺伝子を導入することで、３ＨＰ生成能を付与できることが明らかとなった。
　（例１４：プラスミドｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１－ｂｐｌ１／ｐＧ４１８の構築）
　ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１断片、およびｎｍｔ１Ｐ－ｂｐｌ１断片（ｂｐｌ１断片をｐＨＹＧに導入することにより構築）をｐＧ４１８に導入したプラスミドｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１－ｂｐｌ１／ｐＧ４１８の構築を行った。
　Saccharomyces cerevisiae ATCC204508のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ断片（ａｃｃ１断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　ｐＧ４１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＧ４１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ａｃｃ１断片およびｐＧ４１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、S. cerevisiae由来のａｃｃ１遺伝子がｎｍｔ１プロモーター下流にクローニングされた、ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１／ｐＧ４１８を構築した。
　Saccharomyces cerevisiae ATCC204508のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ビオチンアポプロテインリガーゼ断片(ｂｐｌ１断片)を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
　ｐＨＹＧのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＨＹＧ断片を得た。
　前記のＰＣＲ増幅により得た、Ｂｐｌ１断片およびｐＨＹＧ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、S. cerevisiae由来のｂｐｌ１遺伝子がｎｍｔ１プロモーター下流にクローニングされた、ｎｍｔ１Ｐ－ｂｐｌ１／ｐＨＹＧを構築した。
　ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１／ｐＧ４１８のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１／ｐＧ４１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　ｎｍｔ１Ｐ－ｂｐｌ１／ｐＨＹＧのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎｍｔ１Ｐ－ｂｐｌ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１／ｐＧ４１８断片およびｎｍｔ１Ｐ－ｂｐｌ１断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１－ｂｐｌ１／ｐＧ４１８を構築した。
　（例１５：ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐ（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片の作製）
　ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１－ｂｐｌ１／ｐＧ４１８からＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐ（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片を調製した。
　具体的には、ｎｍｔ１Ｐ－ａｃｃ１－ｂｐｌ１／ｐＧ４１８プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐプロモーター（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
　（例１６：形質転換）
　上記１５で作製したＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐプロモーター（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片をS. pombe OB2(mcr)に形質転換し、S. pombe OB2(mcr,acc1)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe (mcr)の培養を行った。より詳細には、S. pombe (mcr)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB2(mcr)にＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐプロモーター（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、ＨｙｇＲ－ｎｍｔ１Ｐプロモーター（ａｃｃ１－ｂｐｌ１）断片１μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μLを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水４００μＬで菌体ペレットを懸濁し、ＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で２０時間インキュベートを行った。終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにHygromycin Bを添加したＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で７２時間インキュベートを行い、S. pombe (mcr,acc)を得た。
　このようにして得られた外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物、すなわち、Schizosaccharomyces pombe (mcr,acc)を、Schizosaccharomyces pombe NSH-3と命名し、平成２４年３月９日付で、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１　つくばセンター　中央第６）に、受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ－２２２８にて寄託し、平成２５年２月２７日付で、国際寄託に移管した。なお、受領番号は、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１５２８である。
　（実施例３：S. pombe (mcr,acc)による３ＨＰ産生）
　上記例１６で作製したS. pombe (mcr,acc)：Schizosaccharomyces pombe NSH-3（受領番号：FERM ABP-11528）を用いて、３ＨＰが産生されるか検討した。
　S. pombe (mcr-acc)のコロニーを、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回行い、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液をＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間培養し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの培養液を得た。得られた培養液を用いて３,０００rpmで１分間 遠心分離を実施、ＥＭＭ液体培地で懸濁し、菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液を用いて、ＥＭＭ液体培地に細胞濃度が１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、３０℃で１２０時間振盪培養を行った。得られた培養液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清を０．２５Ｍ硫酸で１０倍希釈希釈溶液１００μＬに内部標準液２００μＬを加えた。次いで、ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、試薬Ｂ液２００μＬを加えてよく混合した後、６０℃で２０分間処理した。さらにヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加してよく混合しし、６０℃で１５分間処理した。室温まで冷却した後、０．４５μｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。
　使用カラム：YMC-pACK FA（YMC社）
　流量：0.2 ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55（V/V/V）
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl-n-butyric acid
　検出：UV 400nm。
　その結果、０．０５ｇ／Ｌの３ＨＰの生成を確認した。この際、培養液のｐＨは２．８であった。なお、実施例２におけるS. pombe (mcr)の３ＨＰの生成量は０．０１ｇ／Ｌ以下であったため、S. pombe (mcr)にS. cerevisiae由来acc1遺伝子およびbpl1遺伝子を導入することで、３ＨＰの生成量が向上することが明らかとなった。
　（例１７：ＣＭＶ－ｇｐｄ１/ｐＡＵＲ２２４の構築）
　ｇｐｄ１断片をｐＡＵＲ２２４（プロモーターとしてＣＭＶを有する）に導入したＣＭＶ－ｇｐｄ１／ｐＡＵＲ２２４の構築を行った。
　Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen社)を用いてKluyveromyces lactis NBRC1267（Biological Resource Center、NITEより購入）のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、NADP依存性glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（ｇｐｄ１断片）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　pAUR224(タカラバイオ社)のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＵＲ２２４断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｇｐｄ１断片およびｐＡＵＲ２２４断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、Kluyveromyces lactis由来のｇｐｄ１がＣＭＶプロモーター下流にクローニングされた、ＣＭＶ－ｇｐｄ１／ｐＡＵＲ２２４を構築した。
　（例１８：ＣＭＶ－ｇｐｄ１/ｐＡＵＲ２２４断片の作製）
　ＣＭＶ－ｇｐｄ１／ｐＡＵＲ２２４からＡｂａＲ－ＣＭＶ－ｇｐｄ１断片を調製した。
　具体的には、ＣＭＶ－ｇｐｄ１／ｐＡＵＲ２２４のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＡｂａＲ－ＣＭＶ－ｇｐｄ１断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
　（例１９：形質転換）
　上記例１８で作製したＡｂａＲ－ＣＭＶ－ｇｐｄ１断片を、上記例１６で作製したS. pombe OB2(mcr,acc)：Schizosaccharomyces pombe NSH-3（受領番号：FERM ABP-11528）に形質転換し、S. pombe OB2(mcr,acc,gpd1)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe (mcr,acc)の培養を行った。より詳細には、S. pombe (mcr,acc)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB2(mcr,acc)にＡｂａＲ－ＣＭＶ－ｇｐｄ１断片を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、ＡｂａＲ－ＣＭＶ－ｇｐｄ１断片１μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μLを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水４００μＬで菌体ペレットを懸濁し、ＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で２０時間インキュベートを行った。終濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるようにAureobasidin A（タカラバイオ社）を添加したＹＥＳ寒天培地に塗扶して３０℃で９６時間インキュベートを行い、S. pombe (mcr,acc,gpd1)を得た。
　（実施例４：S. pombe (mcr,acc,gpd1)による３ＨＰ産生）
　上記例１９で作製したS. pombe (mcr,acc,gpd1)を用いて、３ＨＰの生成試験を実施した。
　S. pombe (mcr,acc,gpd1)のコロニーを、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回行い、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液を、３．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、下記表４に示す組成のＡＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で培養を行い、２４時間毎に培養液をサンプリングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　サンプリングした培養液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清を０．２５Ｍの硫酸で１０倍希釈し、希釈溶液１００μＬを得た。希釈溶液に内部標準液２００μＬを加え、ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、および試薬Ｂ液２００μＬを加えてよく混合した後、６０℃で２０分間処理した。次いでヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加してよく混合し、６０℃で１５分間処理した。室温まで冷却した後、０．４５μｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。得られた結果を図８および下記表５に示す。
　使用カラム：YMC-pACK FA（YMC社）
　流量：0.2 ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55（V/V/V）
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl-n-butyric acid
　検出：UV 400nm。
　図８からも明らかなように、S.pombe (mcr,acc)と対比して、S.pombe (mcr,acc,gpd1)は、３ＨＰ生成量が高いことが確認された。また、表５からも明らかなように、S.pombe (mcr,acc)と対比して、S.pombe (mcr,acc,gpd1)によれば、３ＨＰを選択的に生成させることができることが確認された。よって、細胞内のＮＡＤＰＨ生成量を向上させる遺伝子改変により、３ＨＰ生成量を向上させることができることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
　（例２０：ＣＭＶ－ｐｋｔ・ｐｔａ／ｐＡＵＲの構築）
　ｐｋｔ断片およびｐｔａ断片をｐＡＵＲ２２４（プロモーターとしてＣＭＶを有する）に導入したＣＭＶ－ｐｋｔ・ｐｔａ／ｐＡＵＲ２２４の構築を行った。
　はじめに、Bifidobacterium animalis由来のFructose-6-phosphate phosphoketolase(pkt)(EC 4.1.2.22)の遺伝子配列（GenBank accession number: AB264557.1）、Methanosarcina thermophila由来のphosphotransacetylaseの遺伝子配列(pta)(GenBank accession number: L23147.1)、およびCodon Usage Databaseに記載のSchizosaccharomyces pombeのコドンテーブル（ホームページアドレス：http://www.kazusa.or.jp/codon/）を元にして、S.pombeに適したコドンにｐｋｔ遺伝子およびｐｔａ遺伝子の最適化を行った。その結果、配列番号：２１５のｐｋｔ遺伝子断片、および配列番号：２１６のｐｔａ遺伝子断片を、S.pombeに適するコドンとして選別した。上記配列のＤＮＡ断片は、遺伝子合成を行うことで合成した（和光純薬工業株式会社に依頼した）。
　配列番号：２１５のｐｋｔ遺伝子断片をＤＮＡテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐｋｔ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
　また、配列番号：２１６のｐｋａ遺伝子断片をＤＮＡテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐｔａ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
　次に、ｐＡＵＲ２２４(タカラバイオ社)のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＡＵＲ２２４断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ｐｋｔ断片およびｐＡＵＲ２２４断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｐｋｔがＣＭＶプロモーター下流にクローニングされた、ＣＭＶ－ｐｋｔ／ｐＡＵＲ２２４を構築した。
　同様に、ｐｔａ断片およびｐＡＵＲ２２４断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ｐｔａがＣＭＶプロモーター下流にクローニングされた、ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲ２２４を構築した。
　ＣＭＶ－ｐｋｔ／ｐＡＵＲ２２４のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＣＭＶ－ｐｋｔ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
　同様に、ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲ２２４のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、上記配列番号：２２３および２２４のプライマー並びにPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＣＭＶ－ｐｋａ断片を得た。
　上記例３－５で構築したプラスミドｐＡＵＲ（ｌｅｕ２－ＡｂＡＲ－ｎｍｔ１／ｐＵＣ１８）のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＡｂａＲ＿ａｒｍ＿ｌｅｕ２／ｐＵＣ１８断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
　次に、前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＭＶ－ｐｋｔ断片およびＡｂａＲ＿ａｒｍ＿ｌｅｕ２／ｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＣＭＶ－ｐｋｔ／ｐＡＵＲを構築した。
　同様に、前記のＣＭＶ－ｐｋａ断片およびＡｂａＲ＿ａｒｍ＿ｌｅｕ２／ｐＵＣ１８断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲを構築した。
　ＣＭＶ－ｐｋｔ／ｐＡＵＲのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＣＭＶ－ｐｋｔ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
　また、ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
　前記のＰＣＲ増幅により得た、ＣＭＶ－ｐｋｔ断片およびｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ／ｐＡＵＲ断片を用いて、In-Fusion PCRクローニングキット（Takara社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、ＣＭＶ－ｐｋｔ・ｐｔａ／ｐＡＵＲを構築した。
　（例２１：ｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片の作製）
　ＣＭＶ－ｐｋｔ・ｐｔａ／ｐＡＵＲからｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片を調製した。
　具体的には、ＣＭＶ－ｐｋｔ・ｐｔａ／ｐＡＵＲのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、上述の配列番号：９３および９４のプライマー並びにKOD-FX（Toyobo社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片を得た。
　（例２２：形質転換）
　上記例２１で作製したｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片を、上記例１６で作製したS. pombe OB2(mcr,acc)：Schizosaccharomyces pombe NSH-3（受領番号：FERM ABP-11528）に形質転換し、S. pombe OB2(mcr,acc,pkt・pta)を作製した。以下に詳細を示す。
　はじめに、S. pombe (mcr,acc)の培養を行った。より詳細には、S. pombe (mcr,acc)をＹＥＳ液体培地に植菌し、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を用いて、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。
　そして、培養したS. pombe OB2(mcr,acc)にｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片を導入した。より詳細には、上記で得られた菌体ペレットに、０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットを０．１Ｍ　ＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁した。菌体懸濁液１００μＬに、ｌｅｕ＿ＣＭＶ－ｐｔａ・ｐｔａ断片１μｇおよび５０％ＰＥＧ溶液２９０μLを加えて混合し、３０℃で１時間インキュベートを行った。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた菌体ペレットに滅菌水を５００μＬ添加して、菌体ペレットを懸濁した。３０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、滅菌水４００μＬで菌体ペレットを懸濁し、ロイシン無添加ＥＭＭ培地に塗扶して３０℃で９６時間インキュベート行い、S. pombe (mcr,acc,pkt・pta)を得た。
　（実施例５：S. pombe (mcr,acc,pkt・pta)による３ＨＰ産生）
　上記で作製したS. pombe (mcr,acc,pkt・pta)を用いて、３ＨＰ生成試験を実施した。
　S. pombe (mcr,acc,pkt・pta)のコロニーを、終濃度が１５μＭとなるようにチアミンを添加したＥＭＭ液体培地（MP Biomedicals社）に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液１００μＬを、チアミン１５μＭ添加ＥＭＭ液体培地に植菌、３０℃で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。ＥＭＭ液体培地で菌体洗浄を３回行い、得られた菌体ペレットをＥＭＭ液体培地で懸濁して菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液を、３．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、上記表４に示す組成のＡＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で培養を行い、２４時間毎に培養液をサンプリングした。
　サンプリングした培養液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、培養上清を得た。得られた培養上清を０．２５Ｍの硫酸で１０倍に希釈し、希釈溶液１００μＬを得た。希釈溶液に内部標準液２００μＬを加え、ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、および試薬Ｂ液２００μＬを加えてよく混合した後、６０℃で２０分間処理した。次いでヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加してよく混合し、６０℃で１５分間処理した。室温まで冷却した後、０．４５μｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件でＬＣ分析を行った。得られた結果を下記表６に示す。
　使用カラム：YMC-pACK FA（YMC社）
　流量：0.2 ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55（V/V/V）
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl-n-butyric acid
　検出：UV 400nm。
　表６からも明らかなように、S.pombe (mcr,acc)と対比して、S. pombe (mcr,acc,pkt・pta)は、３ＨＰ生成量が高いことが確認された。よって、アセチルＣｏＡ生成量を向上させる遺伝子改変により、３ＨＰ生成性を向上させることができることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
　（例２３：外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入した大腸菌による３ＨＰの産生）
　Chloroflexus aurantiacus（ATCC29365）株のマロニルＣｏＡレダクターゼ（ｍｃｒ）遺伝子の塩基配列（配列番号２）を元に、マロニルＣｏＡレダクターゼの構造遺伝子領域を増幅するプライマー（Chloroflexus aurantiacus由来ｍｃｒ増幅用プライマー；配列番号１１、１２）を設計した。設計したプライマーを用いて、Chloroflexus aurantiacus ATCC29365株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、Chloroflexus aurantiacus ATCC29365のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を取得した。
　取得したマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を、PinPoint Xa-1ベクター（Promega社）のＴａｃプロモーター下流にクローニングし、ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１を構築した。Escherichia coli fusion blue（Takara社）のプロトコールに従って、構築したｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１をヒートショック法により導入し、E． coli（mcr/PinPoint Xa-1）を取得した。
　E． coli(mcr/PinPoint Xa-1)をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。培養上清１００μＬに内部標準液２００μＬを加えた。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液２００μＬ、試薬Ｂ液２００μＬを加え、よく混合した後、６０℃、２０分間処理した。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液２００μＬを添加し、よく混合した。６０℃、１５分間処理後、室温まで冷えたら０．４５μｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとした。当該サンプルを用いて、以下に示す条件で高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析を行った。
　使用カラム：YMC-pACK FA（YMC社）
　流量：1 ml/min
　インジェクション量：10μl
　溶離液：メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝40/5/55（V/V/V）
　内部標準：2-Hydroxy-2-methyl－n－butyric acid
　検出：UV 400nm。
　その結果、３－ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークを確認した。したがって、E． coli（mcr/PinPoint Xa-1）を用いた発酵によりグルコースから３ＨＰが生成することを確認した。
　また、E． coli（mcr/PinPoint Xa-1）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）４ｗｔ／ｖｏｌ％グリセリン添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を前述と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、３－ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークを確認した。したがって、E． coli（mcr/PinPoint Xa-1）を用いた発酵により、グリセリンから３ＨＰが生成することを確認した。
　（例２４：外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入した大腸菌による３ＨＰの産生）
　Corynebacterium glutamicum ATCC13032株のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）をコードするａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子の塩基配列（配列番号１３、１４）を元に、ａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を増幅するプライマー（Corynebacterium glutamicum由来ａｃｃＢＣ増幅用プライマー；配列番号：１５、１６、ならびにCorynebacterium glutamicum由来ｄｔｓＲ１増幅用プライマー；配列番号：１７、１８）を設計した。設計したプライマーを用いてCorynebacterium glutamicum ATCC13032株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅を行い、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株のａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を取得した。
　取得したａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を、例２３に記載のｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１のｍｃｒ遺伝子の下流にクローニングし、ｍｃｒ－ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１を構築した。Escherichia coli fusion blue（Takara社）のプロトコールに従って、構築したｍｃｒ－ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ　Ｘａ－１をヒートショック法により導入し、E． coli（mcr－acc/PinPoint Xa-１）を取得した。
　E． coli（mcr－acc/PinPoint Xa-１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を例２３と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、例２３と比較して、３－ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する７．９分の位置のピークが優位に増加した。したがって、マロニルＣｏＡレダクターゼと、宿主として利用する生物とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを併用することで、マロニルＣｏＡレダクターゼを単独で使用する場合よりも効率的に３ＨＰ生産が可能となることが確認された。なお、グリセリンを炭素源とした培養においても同様に例２３に記載の３ＨＰピークよりも有意に増加した３ＨＰピークを確認した。
　（例２５：細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行った、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入した大腸菌による３ＨＰの産生）
　E． coliのグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子および６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子の塩基配列（配列番号：１９、２０）を元に、ｚｗｆおよびｇｎｄ遺伝子を増幅するプライマー（E． coli由来グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ増幅用プライマー；配列番号：２１、２２、ならびにE． coli由来６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ増幅用プライマー；配列番号：２３、２４）を設計した。設計したプライマーを用いて、E． coli K12株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅を行い、E． coli由来ｚｗｆ遺伝子およびｇｎｄ遺伝子を取得した。取得したｚｗｆ遺伝子およびｇｎｄ遺伝子を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Takara社）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ｚｗｆ－ｇｎｄ／ｐＣＤＦを構築した。
　例２３記載のE． coli(mcr/PinPoint)にｚｗｆ－ｇｎｄ／ｐＣＤＦを導入し、E． coli(mcr/PinPoint Xa-１,zwf－gnd/pCDF)を取得した。E. coli (mcr/PinPoint Xa-1,zwf－gnd/pCDF)をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Difco社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を例２３と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、例２３と比較して、３－ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークが優位に増加した。したがって、細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行い、高いＮＡＤＰＨ条件下でマロニルＣｏＡレダクターゼを反応させることで、３ＨＰ生産性を向上させることができることを確認した。
　（例２６：細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行った、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入した大腸菌よる３ＨＰの産生）
　例２４に記載のE. coli(mcr－acc/PinPoint Xa-１)に、例２５に記載のｚｗｆ－ｇｎｄ／ｐＣＤＦを導入し、E. coli(mcr-acc/PinPoint Xa-1,zwf-gnd/pCDF)を取得した。E. coli(mcr-acc/PinPoint Xa-1,zwf-gnd/pCDF)をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を例２３と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、例２３および例２４、２５と比較して、３ＨＰのピークと一致する７．９分の位置のピークが優位に増加した。したがって、マロニルＣｏＡレダクターゼと、使用するホストとは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの併用に加えて、細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行うことで、マロニルＣｏＡレダクターゼ単独またはマロニルＣｏＡレダクターゼおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを併用した場合よりも、より効率的に３ＨＰ生産が可能となることが確認された。
　（例２７：糖から発酵生産した３ＨＰを用いたアクリル酸および高吸水性樹脂の合成）
　実施例１、２、および３、並びに例２４、２５、および２６で得られた３ＨＰを含む発酵液１００ｇを、それぞれ、６０００ｒｐｍで２０分遠心後、培養液上清を回収した。回収した培養液上清にトリ－ｎ－オクチルアミン１００ｇを加え、撹拌子を用いて穏やかに２４時間室温（２５℃）で混合した。
　次に、所定時間混合後、混合液を静置して、二相に分離し、有機相を回収した。反応混合物を含む有機相に酸化アルミニウムを５０ｇ添加し、１７０℃で１時間加熱・留出した。得られた留出液を回収し、室温まで冷却した後、１００℃から１３０℃まで徐々に加熱していき、留出液を除去した。その後、減圧して、系内の圧力を２０ｋＰａに保ちながら２００℃まで徐々に加熱していき、留出液を回収することで、アクリル酸を含む溶液（アクリル酸溶液）を得た。
　得られたアクリル酸溶液に、重合禁止剤としてハイドロキノンを６０質量ｐｐｍ（対アクリル酸）添加した。別途、鉄を０．２質量ｐｐｍ含有する苛性ソーダから得られたＮａＯＨ水溶液に対して、上記重合禁止剤添加アクリル酸溶液を冷却下（液温３５℃）で添加することにより、アクリル酸７５モル％中和を行った。得られた中和率７５モル％、濃度３５質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液に、内部架橋剤としてポリエチレングリコールジアクリレート０．０５モル％（アクリル酸ナトリウムに対する値）を溶解することにより、単量体成分を得た。この単量体成分３５０ｇを容積１Ｌの円筒容器に入れ、２Ｌ／ｍｉｎの割合で窒素を吹き込んで、２０分間脱気した。次いで、過硫酸ナトリウム０．１２ｇ／モル（単量体成分に対する値）およびＬ－アスコルビン酸０．００５ｇ／モル（単量体成分に対する値）の水溶液をスターラー撹拌下で添加して、重合を開始させた。重合開始後に撹拌を停止し、静置水溶液重合を行った。単量体成分の温度が約１５分（重合ピーク時間）後にピーク重合温度１０８℃を示した後、３０分間重合を進行させた。その後、重合物を円筒容器から取り出し、含水ゲル状架橋重合体を得た。
　得られた含水ゲル状架橋重合体は、４５℃でミートチョッパー（孔径：８ｍｍ）により細分化した後、１７０℃の熱風乾燥機で、２０分間加熱乾燥させた。さらに、乾燥重合体（固形分：約９５％）をロールミルで粉砕し、ＪＩＳ標準篩で粒径６００～３００μｍに分級することにより、ポリアクリル酸系吸水性樹脂（中和率：７５％）を得た。
　本発明の製造方法により得られたアクリル酸の重合性は、プロピレンを原料とするアクリル酸の製造方法により得られたアクリル酸の重合性と同等であった。
　また、本発明の製造方法により得られた吸水性樹脂は、臭気がなく、プロピレンを原料として製造された吸水性樹脂と物性も同等であった。
　（例２８：例２７で合成したアクリル酸を用いたアクリル酸エステルの合成）
　例２７で得られたアクリル酸溶液を晶析により精製した。得られた精製アクリル酸２質量部に対して、ｎ－ブタノール３質量部を原料として用い、強酸性の陽イオン交換樹脂を触媒として６５℃でエステル交換反応を行った。得られた反応液を水で抽出することにより、反応液中に含まれる未反応のアクリル酸および反応で生成した水を除去した。次いで、抽出液を蒸留塔に導入し、蒸留することで、塔底から純度９９．８質量％以上のアクリル酸ｎ－ブチルを得た。なお、塔頂から留出したアクリル酸ｎ－ブチルを含むｎ－ブタノールは、エステル交換反応に再使用した。
　（例２９：例２８で合成したアクリル酸エステルを用いたアクリル酸エステル樹脂の合成および粘着剤への適用）
　例２８で得られた精製アクリル酸３質量部と、例２８で合成したアクリル酸ｎ－ブチル９６質量部と、２－ヒドロキシエチルアクリレート１質量部とを、含む単量体成分を、重合開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル０．２質量部を用いて、トルエンおよび酢酸エチルの混合溶液（トルエン／酢酸エチル（質量比）＝１／１）中で、還流下で溶液重合を行った。８時間後、不揮発分５０質量％、重量平均分子量５００，０００のアクリル酸エステル樹脂溶液を得た。
　得られたアクリル酸エステル樹脂溶液１００質量部に、イソシアネート系架橋剤であるコロネートＬ－５５Ｅ（日本ポリウレタン工業社製）１質量部を加えて、均一になるように撹拌して混合することにより、粘着剤を調製した。
　次に、得られた粘着剤についての性能評価を行った。具体的には、粘着剤をポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（東レ株式会社製、厚さ２５μｍ）上に、乾燥後の厚さが３０μｍとなるように塗布した後、８０℃で５分間乾燥させた。その後、粘着剤表面に離型紙Ｋ－８０ＨＳ（サンエー化研株式会社製）を貼着して保護した後、２３℃、相対湿度６５％の雰囲気下で７日間養生した。養生した粘着フィルムを所定の大きさに切断して、試験片を作製した。
　得られた試験片について保持力試験を行った。具体的には、離型紙を剥がした試験片をＳＵＳ３０４ステンレス鋼板に貼着し、２３℃、相対湿度６５％の雰囲気下で、２ｋｇのゴムローラを２往復させて試験片をステンレス鋼板に圧着した。この際、貼り付け面積は、２５ｍｍ×２５ｍｍであった。２５分間放置した後、８０℃に設定した保持力試験機の中に鉛直に吊り下げ、２０分放置した。その後、試料に質量１ｋｇの重りを掛けた。このときの負荷は、１．５６８Ｎ／ｃｍ２であった。重りを掛けてから試験片がステンレス鋼板から落下するまでの時間を測定したところ、２４時間経過しても貼着した試験片は落下せず、上記で得られたアクリル酸エステル樹脂は、粘着剤として十分な性能を示すことが確認された。

Claims (12)

  1. 　耐酸性を有する微生物に、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、もしくは外来のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および外来の３－ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した第１の遺伝子組換え微生物；または
    　耐酸性を有する微生物に、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子およびグリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子または外来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子およびジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子と、外来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、を導入した第２の遺伝子組換え微生物
    を用いることを有する、３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
  2. 　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物。
  3. 　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物。
  4. 　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、および細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加させる効果を有する外来の遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物。
  5. 　前記細胞内のＮＡＤＰＨ量を増加する効果を有する外来の遺伝子が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、請求項４に記載の遺伝子組換え微生物。
  6. 　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、およびアセチルＣｏＡ生成量を増加させる効果を有する外来の遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物。
  7. 　前記アセチルＣｏＡ量を増加させる効果を有する外来の遺伝子が、フルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子およびホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子である、請求項６に記載の遺伝子組換え微生物。
  8. 　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅに、外来のグリセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセリンデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子、および外来のアルデヒドデヒドオキシダーゼをコードする遺伝子を導入した、遺伝子組換え微生物。
  9. 　請求項１に記載の方法により製造される３－ヒドロキシプロピオン酸を脱水することを有する、アクリル酸の製造方法。
  10. 　請求項９に記載の方法により製造されるアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、前記部分中和アクリル酸を架橋性モノマーと共重合することを有する、吸水性樹脂の製造方法。
  11. 　請求項９に記載の方法により製造されるアクリル酸をエステル化することを有する、アクリル酸エステルの製造方法。
  12. 　請求項１１に記載の方法により製造されるアクリル酸エステルを含む単量体成分を重合することを有する、アクリル酸エステル樹脂の製造方法。
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