CN114689704A

CN114689704A - 1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法

Info

Publication number: CN114689704A
Application number: CN202011569331.9A
Authority: CN
Inventors: 杨玉容; 李彬; 刘云龙; 胡和平; 丁兆
Original assignee: Sichuan Huiyu Haiyue Pharmaceutical Technology Co ltd; SICHUAN HUIYU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Sichuan Huiyu Haiyue Pharmaceutical Technology Co ltd; SICHUAN HUIYU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2020-12-26
Filing date: 2020-12-26
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-12-26
Also published as: CN114689704B

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及1,3‑二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。本发明采用HPLC法对1,3‑二羟基丙酮及相关杂质进行检测，所述HPLC的色谱条件包括：色谱柱：Carbomix Ca‑NP；检测器：RID检测器；流动相：水，等度洗脱。经验证，该方法检测的结果准确、可靠，具有良好的重复性。样品溶液也具有良好的稳定性。

Description

1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone)，通常指二羟基丙酮(Dihydroxyacetone)，简称DHA，结构式如下：

1,3-二羟基丙酮是最简单的三碳酮糖，也是一种重要的化工、生化原料，医药、农业合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。

根据1,3-二羟基丙酮的合成路线，其合成过程中产生的相关杂质主要包含甘油、甘油醛等，为了保证下游产品的质量，需严格控制1,3-二羟基丙酮的杂质水平。但由相关杂质甘油和甘油醛的结构与1,3-二羟基丙酮的结构十分相似，理化性质也十分接近，且都无紫外吸收基团，文献报道的1,3-二羟基丙酮有关物质检测方法极少。

目前，中国药典2020版二部中收载了甘油质量标准，其有关物质检测方法中提到可以检测甘油的相关杂质，但经测试发现，其方法对于检测甘油主成分是有效的，但对于1,3-二羟基丙酮和甘油醛的检测时却出现杂质无法分离，1,3-二羟基丙酮易于分解，检测结果不稳定的情况。另外，一些其他现有技术中二羟基丙酮及相关物质的检测方法，也无法同时有效分离二羟基丙酮、甘油和甘油醛。

因此，本领域需要开发针对一种1,3-二羟基丙酮的有效质控检测方法，保证甘油、甘油醛等杂质可以有效分离，同时保证主成分检测过程中不能被分解，解决结果不准确的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供准确、稳定的1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。

本发明提供的1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法，采用HPLC对待测样品进行检测，所述HPLC的色谱条件包括：

色谱柱：Carbomix Ca-NP；

检测器：RID检测器；

流动相：水，等度洗脱。

本发明对1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测采用HPLC法。实验表明，采用电喷雾检测器(CAD)虽然具有良好的分离度，但是甘油灵敏度低，达不到检测要求，因此，本发明的方案中，采用RID检测器进行检测。示差检测器也是一种通用型检测器，是连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的检测器，是根据折射原理设计的，属偏转式类型，当参比池和测量池流过相同的溶剂时，使照在双光敏电阻的光量相同，此时桥路平衡，输出为零。当测量池中流过被测样品时，引起折射率变化使照在双光电阻上的光束发生偏转，使双光敏电阻阻值发生变化，此时由电桥输出讯号，即反映了样品浓度的变化情况。本发明中，使用RID检测器配合适宜的色谱柱和洗脱条件，能够实现对甘油、甘油醛和1,3-二羟基丙酮的良好分离和较高的灵敏度。一些实施例中，所述检测器的温度为55℃。

本发明检测方法中，采用的色谱柱为Carbomix Ca-NP色谱柱，该色谱柱中的填料在低交联度聚苯乙烯/二乙烯苯(PS/DVB)颗粒的表面修饰磺酸基团(-SO₃H)。本发明中，所述色谱柱填料的交联度为8％。填料的粒径为10μm。极窄的粒径分布确保了高的分离效率，而较低的交联度保证其物质在流动相中发生溶胀，从而具有合适的比表面积和柱容量。一些实施例中，所述色谱柱尺寸为：7.8×300mm，10μm。具体实施例中，本发明所述的色谱柱为Carbomix Ca-NP 10(10μm，8％交联度，7.8×300mm)柱。本发明的检测方法中，所述色谱柱的柱温为60℃。

流动相对于色谱峰的峰形和分离度都存在显著的影响。因此，适宜流动相的选择对于获得良好分离效果是至关重要的。本发明中，以水作为流动相，采用等度洗脱。该方案能够使样品中的甘油、甘油醛和1,3-二羟基丙酮的良好分离，色谱图显示，甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮依次出峰，1,3-二羟基丙酮与甘油分离度为2.12，甘油与甘油醛峰的分离度为1.67。并且，该方法的洗脱程序非常简单，每个样品检测30min即可获得良好的检测效果。在一些实施例中，所述流动相的流速为0.5ml/min。所述流动相的洗脱时间为30min。

本发明中，所述1,3-二羟基丙酮的相关杂质为甘油和甘油醛。

本发明中，所述待测样品为1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液，或为1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液。

本发明中，所述1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液中1,3-二羟基丙酮原料药的浓度为50mg/mL。

所述1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液中，1,3-二羟基丙酮标准品的浓度为50mg/mL，甘油标准品的浓度为0.125～0.375mg/mL，甘油醛标准品的浓度为0.125～0.5mg/mL。

一些具体实施例中，所述1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液中，1,3-二羟基丙酮标准品的浓度为50mg/mL，所述甘油标准品的浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL或0.375mg/mL；所述甘油醛标准品的浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL或0.5mg/mL。

本发明中，采用本发明所述色谱条件，进行检测，1,3-二羟基丙酮的保留时间为20.8±0.2min；甘油的保留时间为18.8±0.2min；甘油醛的保留时间为17.3±0.2min。

本发明中，根据保留时间对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定性。采用标准曲线法对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定量。所述标准曲线法包括内标法或外标法。作为优选，本发明采用外标法对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定量。经检测，甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮的定量限依次为4.7μg/ml、5.0μg/ml、4.9μg/ml。

本发明采用HPLC法对1,3-二羟基丙酮及相关杂质进行检测，所述HPLC的色谱条件包括：色谱柱：Carbomix Ca-NP；检测器：RID检测器；流动相：水，等度洗脱。经验证，该方法检测的结果准确、可靠，具有良好的重复性。样品溶液也具有良好的稳定性。

附图说明

图1示实施例1色谱图；

图2示对比例1色谱图；

图3示对比例2色谱图；

图4示对比例3色谱图；

图5示对比例4色谱图；

图6示对比例5色谱图；

图7示对比例6色谱图。

具体实施方式

本发明提供了1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。本发明中，所述1,3-二羟基丙酮样品来自北京科福瑞德有限公司。Carbomix Ca-NP色谱柱来自苏州赛分科技。本发明实施例中，用于配置样品或加标溶液的水，以及用作流动相的水是指超纯水。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1色谱方法构建

1、配制样品和加标溶液：

加标溶液：分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油0.25mg、甘油醛0.5mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。

2、以如下色谱参数对1中配制的溶液进行检测

色谱柱：Carbomix Ca-NP 10:8％7.8×300mm，10μm

以水为流动相；柱温为60℃；流速为每分钟0.5ml；检测器温度为55℃；进样体积为20μl。

3检测效果

色谱图(图1)显示，该色谱条件符合验证要求。甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮依次出峰，1,3-二羟基丙酮与甘油分离度为2.12，甘油与甘油醛峰的分离度为1.67。

实施例2色谱准确性验证

1以水为稀释剂配制溶液

混合对照品溶液：取甘油和甘油醛对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液，即得。

50％回收率溶液：取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.125mg、甘油醛0.125mg的混合溶液，即得。同法配制3份

100％回收率溶液：取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液，即得。同法配制3份

150％回收率溶液：取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.375mg、甘油醛0.375mg的混合溶液，即得。同法配制3份

2以如下色谱参数对1中配制的溶液进行检测

色谱柱：Carbomix Ca-NP 10:8％7.8×300mm，10μm；以水为流动相；柱温为60℃；流速为每分钟0.5ml；检测器温度为55℃；进样体积为20μl。

3、检测结果如下：

表1

表2

表1～2表明：不同浓度的甘油在1,3-二羟基丙酮中的回收率在91.9％～96.3％之间，平均回收率为93.6％，回收率RSD为2.0％；

不同浓度的甘油醛在1,3-二羟基丙酮中的回收率在94.8％～98.4％之间，平均回收率为96.6％，回收率RSD为1.3％，说明方法具有一定的准确度。

实施例3色谱重复性验证

1、以水为溶液，配制重复性溶液：

取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1，3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液，即得。同法配制6份

2、以实施例1记载的色谱条件进行检测，检测结果如表3～4：

表3

表4

由表3～4可知，6份重复性溶液中，甘油平均含量为0.49％，含量RSD为0.20％；甘油醛平均含量为0.54％，含量RSD为0.83％；说明该方法具有良好的重复性。

实施例4溶液稳定性验证

1、溶液配制：

稀释剂：水。

供试品溶液：取1,3-二羟基丙酮适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含50mg的溶液，即得。

样品加标溶液：取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液，即得。

2、以上溶液分别在25℃条件下，于0h、20h、46h进样测试。色谱参数为实施例1记载，结果图表5～6：

表5

表6

结果表明，供试品溶液和样品加标溶液在室温条件下，46h内稳定。

实施例5检测限测定

溶液配制：

稀释剂：水

取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含1，3-二羟基丙酮4.9μg、甘油5.0μg、甘油醛4.7μg的混合溶液，即得。

色谱参数以实施例1记载，结果见表7：

表7

实施例6原料药检测

以实施例1建立的方法对3个不同批次的1,3-二羟基丙酮原料药进行检测，结果如表8：

表8

样品名称	甘油％	甘油醛％	未知杂质％	总杂％
					样品1	0.06	0.16	ND	0.32
样品2	0.05	0.16	0.03	0.25
					样品3	0.20	0.17	0.04	0.41

说明本发明提供的方法可以对原料药进行检测，准确分离并对甘油醛、甘油进行定量。

对比例1

参照中国药典2020年版甘油质量标准有关物质检测方法测定

1、配制样品和加标溶液：

溶剂：30％乙腈溶液

样品溶液：称取1,3-二羟基丙酮10.1g，置10ml量瓶中，溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

甘油贮备液：称取甘油对照品0.1g，加溶剂溶解并稀释至每1ml中含甘油1mg的溶液。

加标溶液：称取1,3-二羟基丙酮0.1g，置10ml量瓶中，加甘油贮备液0.2ml，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

2、采用GC方法对加标溶液进行检测，色谱参数如下：

色谱柱：Agilent DB-624 30m×0.53mm×3μm

进样量：1μl分流模式：分流分流比：10:1柱流量：8ml/min

进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；

柱温箱升温程序：起始温度为100℃，维持4分钟，以每分钟50℃速率升至120℃，维持10分钟，再以每分钟50℃的速率升至220℃，维持10分钟。

进样加标溶液，色谱图(图2)显示，甘油醛峰与主峰重合。

对比例2

1、配制样品溶液：同对比例1

2、采用GC方法对加标溶液进行检测，色谱参数如下：

色谱柱：Agilent DB-624 75m×0.53mm×3μm

柱温箱升温程序：起始温度为100℃，以每分钟20℃速率升至240℃，维持5分钟。

其他色谱参数均同对比例1中所述色谱参数。进样样品溶液，色谱图(图3)显示甘油醛与主峰分离度为6.02，甘油醛含量为0.826％，未检测出甘油杂质。甘油醛杂质含量偏高，远超出常规分析检测中一般样品的浓度。分析样品在高温下分解。

对比例3

1、配制样品溶液：同对比例1

2、采用GC方法对加标溶液进行检测，色谱参数如下：

色谱柱：Agilent DB-624 75m×0.53mm×3μm

柱温箱升温程序：进样口温度为130℃，柱温箱升温程序为：起始温度为70℃，以8℃每分钟的速率升至220℃，维持10分钟。

其他色谱参数均同对比例1中所述色谱参数，进样样品溶液。色谱图(图4)显示，甘油醛含量为0.086％。

1,3-二羟基丙酮在接近最低限的气化温度下，仍然有甘油醛降解出，说明用GC方法监控1,3-二羟基丙酮的杂质水平不可行。

对比例4

1、配制加标溶液

加标溶液：分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油10mg、甘油醛1mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。

2、采用HPLC配置CAD检测器方法对加标溶液进行检测，色谱参数如下：

色谱柱：

5μmSCX 4.6×250mm

以水为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为40℃；进样体积为20μl；

雾化器温度为低(40℃)

进样加标溶液，色谱图(图5)显示，甘油醛和甘油峰重合，1,3-二羟基丙酮峰与2峰的分离度为0.9。

对比例5

1、配制加标溶液

2、采用HPLC方法配置CAD检测器对加标溶液进行检测，色谱参数如下：

色谱柱为Carbomix Ca-NP 10:8％7.8×300mm，10μm

以水为流动相等度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为40℃；进样加标溶液，进样体积为20μl；色谱图(图6)显示，甘油醛、甘油、1，3-二羟基丙酮依次出峰，分离度均大于2。但甘油响应低，峰高仅为1.79PA。

对比例6

1、配制加标溶液

2、采用HPLC方法配置RID检测器，检测器温度为55℃，色谱柱为Carbomix Ca-NP10:8％7.8×300mm，10μm

流动相为：乙腈-水(5:95)等度洗脱，

流速为每分钟0.5ml；柱温为50℃；

进样加标溶液，进样体积为20μl。

结果显示，甘油与1,3-二羟基丙酮的分离度小于1.0。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法，其特征在于，采用HPLC对待测样品进行检测，所述HPLC的色谱条件包括：

色谱柱：Carbomix Ca-NP；

检测器：RID检测器；

流动相：水，等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的填料的交联度为8％。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱尺寸为：7.8×300mm，10μm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为60℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.5mL/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测器的温度为55℃。

7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述1,3-二羟基丙酮的相关杂质为甘油和甘油醛。

8.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液，或为1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

所述1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液中1,3-二羟基丙酮原料药的浓度为50mg/mL；

10.根据权利要求7～9任一项所述的检测方法，其特征在于，

1,3-二羟基丙酮的保留时间为20.8±0.2min；

甘油的保留时间为18.8±0.2min；

甘油醛的保留时间为17.3±0.2min。