CN109001337B - 一种凉粉草多糖含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种凉粉草多糖含量的检测方法，该方法包括以下步骤：配制浓度为10～166.67μg/mL的一系列混合标准品进样液；配制待测品进样液；将所配制的一系列浓度混合标准品进样液和待测品进样液分别用高效液相色谱与蒸发光散射检测器联用法进行检测，得到一系列浓度混合标准品进样液和待测品进样液的液相色谱图；将待测品进样液的液相图谱与每一浓度标准品进样液的液相图谱比较，与标准品进样液的液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰面积以随行标准曲线计算凉粉草中不同成分多糖的含量。

Description

一种凉粉草多糖含量的检测方法

技术领域

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及植物多糖类化学成分的检测方法。

背景技术

凉粉草是一种重要的药食两用植物资源，全草含有多糖，具有消暑、清热、凉血、解毒功能。凉粉草胶是从凉粉草中提取的凝胶性多糖，常被用于凉粉、凉茶、龟苓膏等消暑品中，但多糖作为功能性产品，若粘度过高，则会阻碍在体内的扩散与吸收，其生物功效难以充分发挥。由于多糖种类繁多，存在形式和含量多变，例如，真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物活性，已经被开发成多种药用和功能性食品添加剂，卡拉胶常作为胶凝剂、增稠剂和乳化剂添加于食品中，等等，因此，要将含有多糖成分的凉粉草投入到工业化生产，达到食品和药用含量标准，就必须对植物中多糖含量进行严格、准确的检测和监控。

目前，检测多糖含量的方法主要有化学法，色谱法，毛细管电泳法，红外光谱定量分析法等，其总的发展趋势是检测过程简便，快捷，准确，实现痕量检测和在线检测。现有研究表明，化学法检测多糖含量具有操作简单成本低的优点，但得到的是总的多糖含量，无法得出具体的单糖含量；色谱法可定性定量分析多糖的组分和含量，其中高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法，可对单糖和寡糖进行常量和微量分析，但由于糖类不具有紫外吸收和荧光吸收，需对其进行衍生化处理，对检测器具有高灵敏度要求，操作相对复杂且成本较高；毛细管电泳法具有仪器相对简单，样品消耗少的优点，但为改善分离效率，常使用表面活性剂，操作流程相对繁琐；红外光谱定量分析方法能够实现快速分析，但通过对特征吸收谱带强度的测量来计算多糖组分的含量，测定结果相对不够精准。采用高效液相色谱分别检凉粉草中的多糖成分的组成和含量，可以准确地检测出凉粉草中各单糖成分的含量，但是如果每种单糖成分都分别用高效液相色谱来检测，工作量将十分大。因此，亟待寻找一种简单、准确、高效、成本低廉、重复性好的方法来同时检测凉粉草中多糖成分及含量，用于凉粉草药材的质量评价，进而推动凉粉草药材产业化生产。目前尚未有能同时检测凉粉草中10种多糖成分含量的检测方法。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种凉粉草多糖含量的检测方法，该方法可同时定量检测凉粉草中10种多糖，具有简单、准确、高效的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种凉粉草多糖含量的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)分别取果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖，先加甲醇溶解，再加水稀释，得到浓度为10～166.67μg/mL的一系列标准品进样液；

取凉粉草干燥粉末，加入20倍量蒸馏水超声提取15min，微孔滤膜滤过，挥干溶剂并浓缩至每毫升浓缩液中含相当于每毫升浓缩中含0.1克凉粉草干燥粉末，得到待测品进样液；

将待测品进样液和每一标准品进样液分别按以下方法进行高效液相色谱检测：

按进样量为10μL，对规格为4.6mm×250mm，5μm，

的以亲水性液相色谱为填料的色谱柱进样，控制柱温度为25℃，接着用由体积配比为A相15～45％和B相55～85％组成的流动相以1.0mL/min的流速进行梯度洗脱，同时采用蒸发光散射检测洗脱液，控制蒸发光散射检测器的漂移管温度为60℃，氮气流速为1.8L/min，获得待检凉粉草的高效液相色谱图和一系列标准品的高效液相色谱图；其中，所述的流动相的A相为水；所述的流动相的B相为乙腈；

(2)将待测品进样液的液相图谱与每一浓度混合标准品进样液的高效液相图谱比较，与混合标准品进样液的高效液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰面积以随行标准曲线计算凉粉草中果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖的含量。

本检测方法在分离鉴定了凉粉草中10个糖类成分的基础上选定标准品进样液，并选取最优检测参数，确保检测出的凉粉草中的多糖含量的数据精准可靠。本发明检测方法具有简单、快速、准确，灵敏度高、精密度、稳定性好等优势，可同时测定凉粉草样品中果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖的含量。本方法可用于凉粉草药材的质量评价，推动凉粉草药材产业化发展，且较现有技术具有简单、准确、高效、成本低廉和灵敏度高的优点。

附图说明

图1为本发明实施例中凉粉草药材高效液相色谱图，图中A表示待测样品的液相图谱；B表示混合标准品进样液的液相图谱；A图和B图中，1号峰为果糖、2号峰为a-D-葡萄糖、3号峰为β-D-葡萄糖、4号峰为D-核糖、5号峰为蔗糖、6号峰为2-甲基-α-D-呋喃果糖、7号峰为2-甲基-β-D-呋喃果糖、8号峰为β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、9号峰为1-乙基-β-D-葡萄糖、10号峰为2-甲基-β-D-吡喃果糖；横坐标为保留时间，纵坐标为峰高。

具体实施方式

实施例1

采用高效液相色谱与蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)联用检测凉粉草中10种多糖成分的含量。

1.仪器、试剂与样品

1.1.仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Alltech ELSD3300蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)；Sartorius CP225D分析天平(d＝0.01mg)(德国Sartorius公司)；Millipore超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2.试剂：甲醇(色谱纯，美国Honeywell公司)；乙腈(色谱纯，美国Honeywell公司)；甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)。

1.3.样品

待测样品：凉粉草样品(由广州王老吉药业股份有限公司提供)，选取16个批次的样品做检测，批次号依次是A131201、A131204、A131205、A131210、A131213、A131214、A131215、A131217、A131218、A131219、A131220、A131221、A131222、A131223、A131224、A131232；

对照品：果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖均由广州中医药大学临床药理研究所自制，经面积归一法检查，纯度均达98％以上。为便于后续描述，将上述10种糖类成分依次记为：C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7、C-8、C-9和C-10。

2.方法

2.1.配制混合标准品进样液

分别精密称定果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖各10mg，分别用少量蒸馏水溶，定容至2mL，摇匀，即得标准品进样液。

精密吸取上述标准品进样液各10μL，共同置于10mL容量瓶中，加水定容至0.30、0.50、0.80、1.00、1.25、5.00mL，得到一系列混合标准品进样液。

2.2.配制待测品进样液

取凉粉草药材干燥粉末1.0g，过80目筛，精密称定，置三角瓶中，加入20mL蒸馏水，超声提取(200W，40kHz)15min，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液挥干溶剂并定容至10mL即得。

2.3.高效液相色谱与蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)联用检测

分别将一系列浓度混合标准品进样液和待测品进样液10μL注入高效液相色谱仪，由蒸发光散射检测洗脱液，获得高效液相色谱图。

色谱条件如下：

色谱仪：安捷伦1260高效液相色谱仪

色谱柱：MERCK ZIC-HILIC柱(4.6mm×250mm，5μm，

)；色谱柱以亲水性液相色谱(Hilic)为填料

流动相：体积百分比浓度为水(A)—乙腈(B)梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1。

表1流动相的梯度洗脱

时间(min)	0	10	20	40
					B％	85	85	70	55
A％	15	15	30	45

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃；

检测器：Alltech ELSD3300蒸发光散射检测器，氮气流速为1.8L/min，漂移管温度60℃，增益为1；

本发明所述的混合标准品进样液图谱中的各峰的归属是通过以下方法确定的：分别配制果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖的标准品溶液，然后在同一色谱条件下分别制备各单独标准品和所述混合标准品进样液的高效液相图谱，根据各单独标准品图谱中相应成分的峰的保留时间确定混合标准品进样液图谱中各峰的归属。本发明人经过多次重复试验，发现在本发明所述流动相中混合标准品进样液中各成分有固定的出峰顺序，即左起1号峰为果糖、2号峰为a-D-葡萄糖、3号峰为β-D-葡萄糖、4号峰为D-核糖、5号峰为蔗糖、6号峰为2-甲基-α-D-呋喃果糖、7号峰为2-甲基-β-D-呋喃果糖、8号峰为β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、9号峰为1-乙基-β-D-葡萄糖、10号峰为2-甲基-β-D-吡喃果糖(见图1中的A图)。因此，在使用本发明方法时，可根据此规律确定混合标准品进样液图谱中各峰的归属，不需要再制备各标准品的图谱，有利于节省时间和试剂。

2.4标准曲线与线性关系考察

以各混合标准品进样液相应多糖成分所测峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，分别作出一系列浓度标准品进样液中10种多糖成分的散点图，然后对所得到的散点图以峰面积的对数(

)对质量浓度的对数(X)进行两变量线性回归，得到回归方程

其中，x为质量浓度的对数(mg/ml)，y为峰面积的对数(mAU)，a和b为常数；根据混合标准品进样液出峰的保留时间确认待测品进样液的出峰位置，将待测品进样液所测峰面积代入上述相关方程中进行计算，得出样品溶液中10种多糖成分的含量。

结果表明，取果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、蔗糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖在0.14～4.48、0.14～4.42、0.24～7.54、0.06～2.08、0.07～2.12、0.18～5.12、0.16～6.34、0.07～2.12、0.21～6.64、0.17～4.83mg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系，见表2。

表2线性回归方程与线性范围

2.5最低检测限与最低定量限

加水稀释混合标准品进样液，依据检测限信噪比N＝3，检测限信噪比N＝10进行检测，结果见表3。

表3最低检测限与最低定量限

2.6精密度试验

精密吸取同一混合标准品进样液，重复进样6次，进行检测，记录C-1～C-10的峰面积并计算其RSD，分别为0.94％、0.64％、1.72％、1.23％、1.48％、1.34％、0.69％、0.86％、0.49％、0.75％，表明仪器精密度良好，结果见表4。

表4精密度试验结果

2.7稳定性试验

精密称取凉粉草药材干燥粉末1.0g，过80目筛，按“2.2”项下标示的方法配制待测品进样液，分别在0h、2h、4h、8h、16h、24h依次进样，测定C-1～C-10的峰面积并计算含量的RSD，分别为1.53％、1.22％、0.54％、1.74％、1.68％、1.76％、1.60％、1.27％、1.47％、0.82％，表明供试品在24h内稳定，结果见表5。

表5稳定性试验结果

2.8重复性试验

精密称取编号为A131201凉粉草药材干燥粉末1.0g，6份，过80目筛，按“2.2”项下方法配制待测品进样液，精密吸取10μL进行分析，测定C-1～C-10的峰面积并计算其含量的RSD，分别是：2.70％、2.13％、1.61％、1.25％、3.67％、3.38％、2.23％、2.11％、1.68％、1.93％，表明该方法的重复性良好，结果见表6。

表6重复性试验结果

2.9加样回收试验

精密称取编号为A131201凉粉草药材干燥粉末0.5g，6份，过80目筛，依次加入10个对照品适量，按“2.2”项下方法配制待测品进样液，进样分析，结果见表7。

表7加样回收试验结果

2.10凉粉草中10种多糖成分含量的测定结果

精密称取16批凉粉草药材干燥粉末1.0g，过80目筛，按“2.2”项下标示的方法平行制备待测品进样液3份，精密吸取10μL进行分析，记录C-1～C-10的峰面积并计算含量，结果见表8。

表8凉粉草中10个糖类成分的含量测定结果(n＝3)

Claims (1)

1.一种凉粉草多糖含量的检测方法，该方法由以下步骤组成：

（1）分别取果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖，先加甲醇溶解，再加水稀释，得到浓度为10～166.67μg/mL的一系列标准品进样液；

取凉粉草干燥粉末，加入20倍量蒸馏水超声提取15 min，微孔滤膜滤过，挥干溶剂并浓缩至每毫升浓缩液中含相当于每毫升浓缩中含0.1克凉粉草干燥粉末，得到待测品进样液；

将待测品进样液和每一标准品进样液分别按以下方法进行高效液相色谱检测：

按进样量为10µL，对规格为4.6mm×250mm，5µm，200 Å的以亲水性液相色谱为填料的色谱柱进样，控制柱温度为25℃，接着用由体积配比为A相15～45%和B相55～85%组成的流动相以1.0 mL/min的流速进行梯度洗脱，同时采用蒸发光散射检测洗脱液，控制蒸发光散射检测器的漂移管温度为60℃，氮气流速为1.8L/min，获得待检凉粉草的高效液相色谱图和一系列标准品的高效液相色谱图；其中，所述的流动相的A相为水；所述的流动相的B相为乙腈；

其中所述流动相的梯度洗脱程序如下表所示：

；

（2）将待测品进样液的液相图谱与每一浓度混合标准品进样液的高效液相图谱比较，与混合标准品进样液的高效液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰面积以随行标准曲线计算凉粉草中果糖、a-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-核糖、蔗糖、2-甲基-α-D-呋喃果糖、2-甲基-β-D-呋喃果糖、β-D-半乳糖(1→6)-α-L-葡萄糖(1→2)-β-D-果糖、1-乙基-β-D-葡萄糖和2-甲基-β-D-吡喃果糖的含量。

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