CN107688073B - 一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其解决现有检测方法存在保留时间过长、峰形不佳的问题。其经过以下步骤：（I）绘制标准曲线：准确称取磷脂酰丝氨酸标样配成标准溶液，随后使用梯度洗脱条件进行高效液相色谱分离；（II）将待测样品制备成适合进行高效液相色谱进样的液体样品；（III）使用梯度洗脱高效液相色谱来分离待测样品，所述的梯度洗脱条件和步骤I的梯度洗脱条件相同；（IV）随后使用蒸发光散射检测器记录峰面积，并且按照步骤I得到的拟合方程来得到样品中的磷脂酰丝氨酸浓度。本发明采用高效液相色谱配合蒸发光检测器为该原料或成品的检测提供了一个准确快速、灵敏度高的检测方法。

Description

一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法

技术领域

本发明涉及利用吸附作用，例如色谱法将材料分离成各个组分来测试材料，尤其是一种在原料和成品中检测磷脂酰丝氨酸含量的检测方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸作为新食品原料，由于其独特的健脑益智功效，逐渐被应用到各类食品和保健品当中，但检测方法缺失，尚无国家、地方或行业等统一的标准对其含量的检测方法进行规定，这就导致在含磷脂酰丝氨酸的原料品质控制和成品质量控制方面无统一的依据。

目前，公开的磷脂酰丝氨酸的检测方法有两种，第一种是：2016年2月3日公开的申请号为：201510874442.3的中国发明专利申请说明书中公开的“一种磷脂酰丝氨酸的高效液相色谱分析方法”；第一种是：2014年6月25日公开的申请号为201410145181.7的中国发明专利申请说明书中公开的“一种食品中磷脂酰丝氨酸含量的检测方法”。这两种公开的专利文献中涉及的方法均是使用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器进行含量检测，上述公开文件中针对产品中的磷脂酰丝氨酸的含量不同，在样品前处理阶段存在差异，而在后续的检测阶段，仪器参数存在差异。但上述公开的检测方法仍存在保留时间过长、峰形不佳、理论板数低等问题。因此，关于食品中磷脂酰丝氨酸的含量的检测方法，尚不成熟，还需要建立一种色谱峰分离较好，具有准确快速、高灵敏度、重现性好、回收率高的磷脂酰丝氨酸的检测方法。

发明内容

为了克服现有检测方法存在保留时间过长、峰形不佳的不足，本发明的目的是提供一种磷色谱峰分离较好、准确快速、高灵敏度的脂酰丝氨酸含量的检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其特征在于：其经过以下步骤：

（I）绘制标准曲线：准确称取磷脂酰丝氨酸标样，并且溶于氯仿/甲醇溶液，配置成标准溶液，随后将4-10组梯度体积的标准溶液进行高效液相色谱分离，所述的梯度洗脱条件是：高效液相色谱柱为球形硅胶正相柱；柱温为30-40摄氏度；流动相A：正已烷、异丙醇、乙酸和三乙胺的体积比是810:160-200:8-12:0.6-0.10；流动相B：异丙醇、水、乙酸和三乙胺的体积比是860: 110-130:8-12:0.6-0.10；在0-10分钟，流动相A和B的流速比为100:0；在10-15分钟，流动相A和B的流速比为60:50-30；在15-20分钟，流动相A和B的流速比为0:100；随后使用蒸发光散射检测器记录峰面积，并且将峰面积对各组样品的浓度做出标准曲线，拟合出一元一次方程，所述的氯仿/甲醇溶液的氯仿体积分数为85-95%；

（II）将待测样品制备成适合进行高效液相色谱进样的液体样品；

（III）使用梯度洗脱高效液相色谱来分离待测样品，所述的梯度洗脱条件和步骤I的梯度洗脱条件相同；

（IV）随后使用蒸发光散射检测器记录峰面积，并且按照步骤I得到的拟合方程来得到样品中的磷脂酰丝氨酸浓度。

在本发明优选的方面，在步骤I和III中，梯度洗脱条件为：高效液相色谱柱为球形硅胶正相柱；柱温为37摄氏度；流动相A：正已烷、异丙醇、乙酸和三乙胺的体积比是810:180:10:0.8；流动相B：异丙醇、水、乙酸和三乙胺的体积比是860: 130:10:0.8；在0-10分钟，流动相A和B的流速比为100:0；在10-15分钟，流动相A和B的流速比为60:40；在15-20分钟，流动相A和B的流速比为0:100；在30分钟以后，流动相A和B的流速比为100:0。

在本发明优选的方面，在步骤I中，准确称取120mg标样磷脂酰丝氨酸溶解于25mL的体积比为90/10的氯仿/甲醇的溶剂中配成标准溶液，超声使粉末充分溶解，置于4℃环境下保存，随后以 10、15、20、25ul和30ul标准溶液进样，做出标准曲线，并且拟合出一元一次方程。

在本发明优选的方面，在步骤I和III中，使用的色谱柱为4m×125mm的球形硅胶正相柱，流动相的流速为1.2mL/min。

在本发明优选的方面，在步骤II中，所述的待测样品选自含磷脂酰丝氨酸的食品和保健品。

本发明优选的方面，在步骤II中，所述的待测样品选自配方奶粉、压片糖果和磷脂酰丝氨酸粗制品。

在本发明优选的方面，在步骤II中，所述的待测样品按照以下的方法来制备成适合进行高效液相色谱进样的液体样品：准确的重复称取待测样品，研磨至细粉状态后加入到50ml的容量瓶中，加入10ml的体积比为90/10的氯仿/甲醇溶液，涡旋振荡分散均匀后，超声5min，冷却至室温,用氯仿/甲醇溶液补足至50mL，摇匀，经0.45um微孔滤膜过滤，得到适合进行高效液相色谱进样的液体样品。

在本发明优选的方面，在步骤IV中，所述的样品中的磷脂酰丝氨酸浓度按照公式：

来计算，其中：

X为样品中的磷脂酰丝氨酸的质量浓度，其单位为mg/100g；

C为步骤IV中按照标准曲线得到的样品溶液中磷脂酰丝氨酸的浓度，其单位为μg/mL；

V为步骤II中适合进行高效液相色谱进样的液体样品的总体积，其单位为mL；

W为步骤II中样品取样量，其单位为g；

F为样品中水分的质量分数。

在本发明优选的方面，在步骤IV中，蒸发光检测器的漂移管温度为90-100摄氏度，载气流速是2-4 mL/min。

在本发明优选的方面，在步骤IV中，蒸发光检测器在11.5-12.0分钟内选择最高值为峰值，记录该峰面积作为磷脂酰丝氨酸的峰面积。

在本发明的其他方面，还提供了以下的技术方案：

1、流动相组成与比例：

根据磷脂酰丝氨酸的性质，选用的二元流动相组成和配比分别为流动相A：正已烷-异丙醇-乙酸-三乙胺（810:180:10:0.8），流动相B：异丙醇-水-乙酸-三乙胺（860: 130:10:0.8），其流动相梯度洗脱条件如表1。选用上述流动相配比和梯度洗脱条件，各峰获得较好的分离，即不同组分的区分效果较好。

表1 流动相梯度洗脱条件

步骤	运行时间，min	流动相A，%	流动相B，%
				1	0	100	0
2	10	60	40
				3	15	0	100
4	20	100	0

在洗脱初期，将流动相A 保持高比例有利于在短时间内将磷脂酰丝氨酸从混合物中分离出来，同时避免其他成分的分离，减少杂质对测定结果的干扰。在梯度洗脱后期，迅速增加流动相B的比例，可以使其它饱和脂类尽快分离出来，缩短实验的检测时间。

2、色谱柱温度和流动相流速：

（1）适当提高柱温可增加柱效，将色谱柱温度控制在37℃，一方面较上述两个住专利中的30℃、35℃，可缩短磷脂酰丝氨酸的分离时间，另一方面，对营养素磷脂酰丝氨酸，37℃的检测温度，不会对其营养成分造成损失，与人体摄入、吸收与利用的温度相吻合，因此，在37℃条件下检测，可得到准确的检测结果。

（2）因柱效是柱中流动相线性流速的函数，采用不同的流速会获得不同的柱效，一般而言，当流速降低时，色谱峰的分离效果会更好，但同时也会延长待测组分的保留时间，同时伴随着峰高降低、峰宽变大，从而直接导致磷脂酰丝氨酸的检测灵敏度降低。因此依据所用色谱柱的内径和实验峰型，确定本发明的流速为1.2ml/min。

3、蒸发光检测器的漂移管温度和载气流速

漂移管温度越高，流动相就越趋于沸腾，则会逐渐降低信噪比，但温度过高，会使流动相沸腾，增加背景噪音。故本发明漂移管的温度的选择是在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温低，即漂移管温度为95℃。

载气流速是影响HPLC-ELSD检测性能的重要因素，一般来说，载气流速越小，形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，若载气流速过低，流动相就会挥发不完全，进而增加背景噪音。最佳载气流速是在可接受噪声的基础上，产生最高响应值的最低流速。综合二者，经试验，确定本发明-针对磷脂酰丝氨酸的检测，适用的蒸发光检测器的漂移管温度为95℃，最佳载气流速为3L/min。

本发明在现有技术的基础上，通过多次试验论证，改变了流动相的配比、色谱柱温度以及流动相流速，从而改变了磷脂酰丝氨酸的出峰时间，使得保留时间缩短，获得了磷脂酰丝氨酸含量测定的最佳液相色谱条件。同时优化了蒸发光检测器的漂移管温度和载气流速两个关键参数，该两个参数的改变对待测组分—磷脂酰丝氨酸的保留时间影响较小，但对信噪比的影响较大。本发明采用高效液相色谱配合蒸发光检测器，通过优化高效液相色谱条件中的流动相组成、比例和色谱柱温度和流动相流速；以及蒸发光检测器中的漂移管温度和载气流速等参数，使用外标峰面积法来测定含磷脂酰丝氨酸的原料或成品中的PS含量，为原料或成品的检测提供了一个准确快速、灵敏度高的检测方法。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

图1是本发明的实施例1的标准样的HPLC-ELSD图；

图2是本发明的实施例1的待测样品的HPLC-ELSD图；

图3是本发明的实施例2的待测样品的HPLC-ELSD图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

试验条件和设置

一、试剂。除非另外地说明，均购自北京化工厂，例如：

1.磷脂酰丝氨酸标准品，

2.正己烷（色谱纯），

3.2-丙醇（色谱纯），

4.乙酸（分析纯），

5.三乙胺（色谱纯），

6.氯仿-甲醇（90:10的分析纯），

7.超纯水；

二、仪器条件如下：

1．色谱柱：LiChrosphere 100 diol（Merck）：4mm×125mm（Merck）；

2．流动相：

流动相A为正已烷-异丙醇-乙酸-三乙胺（810:180:10:0.8），

流动相B为异丙醇-水-乙酸-三乙胺（860:130:10:0.8）；

3. 按表1的条件进行梯度洗脱；

4．流速：1.2mL/min；

5．柱温：37℃；

6．进样量：5μL；

7．检测器参数：ELSD (ELSD 2000, U.S.A；漂移管温度95℃；载气流速3.0L/min)。

实施例1

一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其经过以下步骤：

（I）标准溶液配制与绘制标准曲线：

准确称取120mg标样磷脂酰丝氨酸（PS）溶解于25mL的氯仿/甲醇（90/10）的溶剂中配成标准溶液，超声使粉末充分溶解，置于4℃环境下保存，随后以 10、15、20、25ul和30ul标准溶液进样，做出一个标准曲线；

（II）试样溶液配制：

准确的重复称取市售的一定量的含磷脂酰丝氨酸的样品(某厂家含磷脂酰丝氨酸配方奶粉), 加入到50ml的容量瓶中，加入10ml的氯仿/甲醇（90/10），涡旋振荡分散均匀后，超声5min，冷却至室温,用氯仿/甲醇溶液补足至50mL，摇匀，配制成样品液，经0.45um微孔滤膜过滤，进样；

（III）进样检测：

将标准溶液、样品溶液于上述特定色谱条件下进行测定，在洗脱过程中样品的保留时间跟标准样品相比作定性分析；

（IV）以标准溶液峰面积做对数后为纵坐标，标准溶液浓度做对数后为横坐标，绘制双对数标准曲线，根据峰面积从双对数标准曲线查得样品溶液浓度，进行定量分析。通过测出的样品的响应值从标准曲线上计算出最终PS的含量。其色谱图见附图1、附图2。

在步骤IV中，所述的样品中的磷脂酰丝氨酸浓度按照公式：

来计算，其中：

X为样品中的磷脂酰丝氨酸的质量浓度，其单位为mg/100g；

C为步骤IV中按照标准曲线得到的样品溶液中磷脂酰丝氨酸的浓度，其单位为μg/mL；

V为步骤II中适合进行高效液相色谱进样的液体样品的总体积，其单位为mL；

W为步骤II中样品取样量，其单位为g；

样品溶液进行高效液相色谱测定，以保留时间定性，得到磷脂酰丝氨酸的色谱峰峰面积,结合样品称样量，定量。经计算得到磷脂酰丝氨酸配方奶粉的含量为5.88g/100g。

实施例2：

一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其经过以下步骤：

（I） 标准溶液配制与绘制标准曲线：同实施例1；

（II）试样溶液配制：

准确的重复称取市售的一定量的含磷脂酰丝氨酸的样品(某厂家磷脂酰丝氨酸压片糖果), 将压片糖果先研磨至细粉状态后加入到50ml的容量瓶中，加入10ml的氯仿/甲醇（90/10），涡旋振荡分散均匀后，超声5min，冷却至室温,用氯仿/甲醇溶液补足至50mL，摇匀，配制成样品液，经0.45um微孔滤膜过滤，进样；

（III）进样检测：

将标准溶液、样品溶液于上述特定色谱条件下进行测定，在洗脱过程中样品的保留时间跟标准样品相比作定性分析；

（IV）以标准溶液峰面积做对数后为纵坐标，标准溶液浓度做对数后为横坐标，绘制双对数标准曲线，根据峰面积从双对数标准曲线查得样品溶液浓度，进行定量分析。通过测出的样品的响应值从标准曲线上计算出最终PS的含量。其色谱图见附图3。

在步骤IV中，所述的样品中的磷脂酰丝氨酸浓度按照公式：

来计算，其中：

X为样品中的磷脂酰丝氨酸的质量浓度，其单位为mg/100g；

C为步骤IV中按照标准曲线得到的样品溶液中磷脂酰丝氨酸的浓度，其单位为μg/mL；

V为步骤II中适合进行高效液相色谱进样的液体样品的总体积，其单位为mL；

W为步骤II中样品取样量，其单位为g；

样品溶液进行高效液相色谱测定，以保留时间定性，得到磷脂酰丝氨酸的色谱峰峰面积,结合样品称样量，定量。经计算得到磷脂酰丝氨酸压片糖果的含量为9.95g/100g。

实验一：精密度实验

本实验选用实例1和实例2中的两种添加了磷脂酰丝氨酸的产品为实验样品，按照本发明的实验条件和文中所述公开专利文献中条件进行检测，每个样品平行测定6次。其测定结果如表2所示。其中，专利申请ZL201510874442.3采用其实施例1的色谱条件，ZL201410145181.7采用其实施例的色谱条件。

表2 不同测定条件下，精密度实验结果

从不同色谱条件下的测定值的相对标准偏差可以看出，上述三个条件下，本发明检测方法的精密度都较高，但本发明的精密度检测结果明显高于另外两个检测方法。

实验二：回收率实验

选用某公司的磷脂酰丝氨原料（PS：50%），以大豆油为软胶囊内容物辅料，配制不同含量的内容物的软胶囊半成品，控制纯品PS的含量为：5g/100g、10g/100g、15g/100g、20g/100g和25g/100g。按照本发明、上述两个专利申请中的方法进行检测，每组6个平行，进行回收率试验，结果如表3所示。取一个未添加ps原料的奶粉产品，分别向其中添加ps 原料，制成ps 含量为表3所列的样品进行测定。

表4不同测定条件下，精密度实验结果

从实验结果可以看出，采用本发明的色谱条件可以获得较高的回收率，即含磷脂酰丝氨酸的产品经该方法检测，损耗小，可获得较为精准的层结果。

对比例1

本对比例的实验方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤I和III中的洗脱方法和实施例1相比，区别在于始终使用流动相B来进行洗脱。结果显示原本在图2中11.532分钟所出的峰在7.242分钟时出现，并且分离效果很差（图未显示），很难用于后续的峰面积计算。

对比例2

本对比例的实验方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤I和III中的洗脱方法和实施例1相比，区别在于始终使用流动相A来进行洗脱。结果显示原本在图2中11.532分钟所出的峰在21.049分钟时出现，完全分离需要35分钟以上，浪费了大量的洗脱液和时间。

Claims (3)

1.一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其特征在于：其经过以下步骤：

（I） 标准溶液配制与绘制标准曲线

准确称取120mg标样磷脂酰丝氨酸，溶解于25mL的体积比为90/10的氯仿/甲醇的溶剂中配成标准溶液，超声使粉末充分溶解，置于4℃环境下保存，随后以 10、15、20、25ul和30ul标准溶液进样，做出标准曲线；

（II）试样溶液配制

准确的重复称取市售的一定量的含磷脂酰丝氨酸的压片糖果, 将压片糖果先研磨至细粉状态后加入到50ml的容量瓶中，加入10ml的体积比为90/10的氯仿/甲醇溶液，涡旋振荡分散均匀后，超声5min，冷却至室温,用氯仿/甲醇溶液补足至50mL，摇匀，配制成样品液，经0.45um微孔滤膜过滤，进样；

（III）进样检测

将标准溶液、样品溶液在如下特定色谱条件下进行测定：色谱柱：LiChrosphere 100diol：4mm×125mm；流动相：流动相A为正已烷-异丙醇-乙酸-三乙胺的体积比是810:180:10:0.8，流动相B为异丙醇-水-乙酸-三乙胺的体积比是860:130:10:0.8；梯度洗脱条件如下表：

步骤 运行时间，min 流动相A，% 流动相B，% 1 0 100 0 2 10 60 40 3 15 0 100 4 20 100 0

流速：1.2mL/min；柱温：37℃；进样量：5μL；检测器参数：2000型蒸发光散射检测器，漂移管温度95℃，载气流速3.0L/min；在洗脱过程中样品的保留时间跟标准样品相比作定性分析；

（IV）磷脂酰丝氨酸的含量计算

以标准溶液峰面积做对数后为纵坐标，标准溶液浓度做对数后为横坐标，绘制双对数标准曲线，根据峰面积从双对数标准曲线查得样品溶液浓度，进行定量分析，通过测出的样品的响应值从标准曲线上计算出最终磷脂酰丝氨酸的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其特征在于：在步骤IV中，所述的样品中的磷脂酰丝氨酸的浓度按照公式：

来计算，其中：

X为样品中的磷脂酰丝氨酸的质量浓度，其单位为mg/100g；

C为步骤IV中按照标准曲线得到的样品溶液中磷脂酰丝氨酸的浓度，其单位为μg/mL；

V为步骤II中适合进行高效液相色谱进样的液体样品的总体积，其单位为mL；

W为步骤II中样品取样量，其单位为g；

F为样品中水分的质量分数。

3.根据权利要求1所述的一种磷脂酰丝氨酸含量的检测方法，其特征在于：在步骤III中，蒸发光散射检测器在11.5-12.0分钟内选择最高值为峰值，记录该峰面积作为磷脂酰丝氨酸的峰面积。

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