CN105296560A - 一种磷脂酰丝氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，所述方法是将天然卵磷脂和L-丝氨酸在磷脂酶D酶液的作用下进行酶催化反应，反应结束后经简单的纯化工艺，即可得到收率在60％以上磷脂酰丝氨酸。本发明的方法操作简便，高收率低成本，产品质量稳定，工艺绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的制备方法，具体涉及一种由天然卵磷脂经酶催化反应制备磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)又称丝氨酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜的内层，磷酯化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统，是大脑的细胞膜的重要组成成分之一，同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用，如它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。具有重要的功能与作用：延缓衰老、维持机体健康年轻、强化脑部功能、增强记忆力、运动员等的营养必需品、治疗多动症儿童、促进血液循环、分解过高的血脂和过高的胆固醇、清扫血管，使血管顺畅，从而减低脂肪肝的发病率，有“血管清道夫”的美誉。
磷脂酰丝氨酸的主要来源于动植物，在动物体中，大脑及肝脏中的细胞中磷脂酰丝氨酸的含量比较丰富，但是动物容易染病，例如欧洲的疯牛病影响了磷脂酰丝氨酸的提取，而在植物中，磷脂酰丝氨酸的含量仅仅不足8％，提取也相对困难。目前磷脂酰丝氨酸的制备方法主要是酶催化合成法，是将天然卵磷脂溶解于正己烷、乙酸乙酯、乙醚、甲苯、醋酸丁酯、氯仿等有机溶剂，再将L-丝氨酸，磷脂酶D、无机盐溶于水，最后将有机相和水相混合进行两相界面反应，待反应完成后，进行萃取、浓缩、柱层析等纯化步骤。生产设备要求高，工艺复杂，不易操作，成本高低收率，同时去除终产品中残留的有机溶剂仍是工艺难点之一，且有机溶剂的加入与当今社会绿色生产的原则相违背。尽管专利JP2002051794和专利DE102004002053都使用单一水相反应，但制备过程中均需要有特殊的均质化设备以保证反应转化率，仍存在设备投入大，成本高，对均质设备依赖强，反应转化率难以保证的问题。而专利CN101230365在以上方法的基础上做出了修正，也是单一水相反应，但转化反应中纯品磷脂酶D加入增加了生产成本，并且反应最后纯化工艺中使用乙酸乙酯萃取和乙腈处理增加了产品中有机溶剂的残留。
发明内容
本发明提供一种由天然卵磷脂经酶催化反应制备磷脂酰丝氨酸的制备方法，此方法特点在于简便、经济，制备的产品经高效液相色谱法测定含量不低于70wt％，并且产品收率在60wt％以上，从而克服现有技术存在的反应工序复杂、设备投入大、成本高、反应转化率低、有机溶剂残留和产品纯度难以保证的问题。本发明采用天然卵磷脂为反应基质，在磷脂酶D的催化下与L-丝氨酸进行生物转化从而得到相关规格磷脂酰丝氨酸产品。
其技术方案如下：
(1)将天然卵磷脂L-丝氨酸、氯化钙溶液与醋酸缓冲液一并加入合成酶酶液中，在温度为42～46℃条件下，搅拌反应18～24h。
(2)反应结束后，过滤，再将滤渣加入其质量为20倍的体积分数95％的乙醇溶液中，搅拌20分钟，再过滤，如此进行两次，最后将滤渣加入其质量为20倍的纯化水中，搅拌20分钟后进行过滤，滤渣经干燥后得到产率为60wt％、含量为70wt％以上(HPLC含量测定)的磷脂酰丝氨酸产品。
所述天然卵磷脂为优选大豆卵磷脂，其主要成分磷脂酰胆碱的含量为60wt％以上。
所述步骤(1)中的卵磷脂的浓度为50mg/mL。
所述步骤(1)中的L-丝氨酸的浓度为0.2g/mL。
所述步骤(1)中的氯化钙溶液与反应酶液的体积比为12∶1，氯化钙浓度为1mol/L。
所述步骤(1)中的醋酸缓冲溶液与反应酶液的体积比为3∶1，醋酸缓冲溶液的浓度为1mol/L，pH为5.5。
所述含量分析按高效液相色谱法测定。色谱条件为：采用MerckLiChrospher100DiolSi色谱柱(250mm*4mm，5μm)，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱(0～17min：17％B～80％B；17～25min：80％B～17％B；25～32min：17％B)。其中，所述A相为正己烷∶异丙醇∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为815∶170∶15∶0.8，B相为异丙醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为837∶140∶15∶0.8。所述检测器为蒸发光散射检测器(漂移管温度为80℃；雾化器温度为36℃；气体压力为40psi)。
磷脂酶D酶液为一种放线菌(穗产色链霉菌Streptomycesracemochromogenes)的含磷脂酶D的酶液(磷脂酶D的活力大于0.4u/mL)。
附图说明
图1：磷脂酰胆碱对照品色谱图；
图2：磷脂酰丝氨酸对照品色谱图；
图3：大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱的色谱图；
图4：本发明产品中磷脂酰丝氨酸色谱图。
其中，A-磷脂酰胆碱对照品；B-磷脂酰丝氨酸对照品；C-大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱；D-本发明产品中磷脂酰丝氨酸。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均购自SigmaBiochemicalandOrganicCompoundsforResearchandDiagnosticClinicalReagents公司。
实施例1：
称取80g醋酸钠溶于1L水，并加入醋酸调整pH值为5.5；再称取5.5gCaCl2溶于250mL水，最后将1L醋酸缓冲液、250mL氯化钙溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量62.35wt％)、500gL-丝氨酸和3L磷脂酶D酶液中搅拌，加热温度为45℃，反应24h后，过滤，滤渣使用1.6L浓度为体积分数95％的乙醇溶液洗2次，过滤后，将滤渣使用1.6L纯水清洗1次，最后过滤、干燥，使用高效液相色谱仪检测含量为72.01wt％，产率为62.56wt％。
实施例2：
称取80g醋酸钠溶于1L水，并加入醋酸调整pH值为5.5；再称取5.5gCaCl2溶于250mL水，最后将1L醋酸缓冲液、250mL氯化钙溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量78.22wt％)、500gL-丝氨酸和3L磷脂酶D酶液中搅拌，加热温度为45℃，反应24h后，过滤，滤渣使用1.6L浓度为体积分数95％的乙醇溶液洗2次，过滤后，将滤渣使用1.6L纯水清洗1次，最后过滤、干燥，使用高效液相色谱仪检测含量为76.02wt％，产率为68.44wt％。
实施例3：
称取80g醋酸钠溶于1L水，并加入醋酸调整pH值为5.5；再称取5.5gCaCl2溶于250mL水，最后将1L醋酸缓冲液、250mL氯化钙溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量88.51wt％)、500gL-丝氨酸和3L磷脂酶D酶液中搅拌，加热温度为45℃，反应24h后，过滤，滤渣使用1.6L浓度为体积分数95％的乙醇溶液洗2次，过滤后，将滤渣使用1.6L纯水清洗1次，最后过滤、干燥，使用高效液相色谱仪检测含量为79.83wt％，产率为74.31wt％。
实施例4：
按发明专利CN103421719A所述方法，取适量大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量88.51wt％)溶于色谱纯氯仿(终浓度5mg/mL)10mL为有机相；另取发酵粗酶液10mL，向其中加入L-丝氨酸(终浓度50mg/mL)，TritonX-100(v/v，2.4％)，CaCl2(终浓度80mmol/L)为水相；将有机相与水相1∶1混合于三角瓶，置于震荡摇床上45℃震荡10h后，静止分层，氯仿部分浓缩冷冻干燥后，最后使用高效液相色谱仪检测含量为32.77wt％，产率为41.12wt％。可见此方法会残留对人体有毒的有机溶剂(氯仿)，纯度和产率均大大低于本发明所述方法。
实施例5：
按发明专利CN104327114A所述方法，将1g丝氨酸和3g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量88.51wt％)加入到200mL二甲基乙酰胺溶剂中，加入0.08g咪唑催化剂，得到的混合体系于115℃搅拌反应6h，蒸发的水蒸汽从体系中去除。脱溶后用80mL正己烷和80mL水的混合物进行萃取，分离正己烷相，脱溶，残留物再用丙酮洗涤2次，每次20mL丙酮，最后冷冻干燥，最后使用高效液相色谱仪检测含量为测得含量为56.88wt％，产率为52.45wt％。虽然此方法使用了低毒的二甲基乙酰胺作为溶剂，但使用有毒的咪唑为催化剂，生产成本较高，仍然不是绿色环保的生产工序，其纯度和含量也低于本发明所述方法。
实施例6：
使用高效液相色谱法对本发明中的卵磷脂中的磷脂酰胆碱进行含量测定。色谱条件为：采用MerckLiChrospher100DiolSi色谱柱(250mm*4mm，5μm)，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱(0～17min：17％B～80％B；17～25min：80％B～17％B；25～32min：17％B)。其中，所述A相为正己烷∶异丙醇∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为815∶170∶15∶0.8，B相为异丙醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为837∶140∶15∶0.8。所述检测器为蒸发光散射检测器(漂移管温度为80℃；雾化器温度为36℃；气体压力为40psi)。精密称取10mg磷脂酰胆碱对照品(Sigma)使用氯仿溶解，定溶于20mL，摇匀，最后配制浓度为25、50、100、200、400、500μg/mL，过0.45μm有机滤膜，进样量为20μL，以峰面积的对数值为纵坐标，对照品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程为Y＝1.4377X+3.5492，r＝0.9996。再称取卵磷脂原料(三批)10mg，用氯仿溶解并定溶于20mL，摇匀，过0.45μm有机滤膜，进样量为20μL，根据线性回归方程计算，测得含量分别为62.35wt％、78.22wt％和88.51wt％。
实施例7：
使用高效液相色谱法对本发明产品中的磷脂酰丝氨酸进行含量测定。色谱条件为：采用MerckLiChrospher100DiolSi色谱柱(250mm*4mm，5μm)，流动相由A相和B相组成，进行梯度洗脱(0～17min：17％B～80％B；17～25min：80％B～17％B；25～32min：17％B)。其中，所述A相为正己烷∶异丙醇∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为815∶170∶15∶0.8，B相为异丙醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺，体积比为837∶140∶15∶0.8。所述检测器为蒸发光散射检测器(漂移管温度为80℃；雾化器温度为36℃；气体压力为40psi)。精密称取10mg磷脂酰丝氨酸对照品(Sigma)使用氯仿溶解，定溶于20mL，摇匀，最后配制浓度为25、50、100、200、400、500μg/mL，过0.45μm有机滤膜，进样量为20μL，以峰面积的对数值为纵坐标，对照品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程为Y＝1.4377X+3.5492，r＝0.9996。再称取磷脂酰丝氨酸(三批)10mg，用氯仿溶解开定溶于20mL，摇匀，过0.45μm有机滤膜，进样量为20μL，根据线性回归方程计算，测得含量分别为72.01wt％、76.02wt％和79.83wt％。
Claims (9)
1.一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于包括下述步骤：将卵磷脂和L-丝氨酸在含有磷脂酶D的酶液中反应，收率在60wt％以上，磷脂酰丝氨酸含量不低于70wt％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其包括下述步骤：
(1)将卵磷脂、L-丝氨酸、氯化钙溶液与醋酸缓冲液一并加入磷脂酶D酶液中，在温度为40～46℃搅拌反应12～24h。
(2)反应结束后，过滤，再将滤渣加入其质量为20倍的体积分数95％乙醇溶液中，搅拌20分钟，再过滤，如此进行两次，最后将滤渣加入其质量为20倍的纯化水中，搅拌20分钟，过滤，滤渣经干燥后，从而得到收率在60wt％以上的磷脂酰丝氨酸，同时经高效液相色谱法准确测定磷脂酰丝氨酸含量不低于70wt％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于卵磷脂是从大豆中提取得到的磷脂酰胆碱含量在60wt％以上的大豆卵磷脂，磷脂酰胆碱含量经正相高效液相色谱法进行准确测定。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于磷脂酶D酶液为放线菌的含磷脂酶D的酶液。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶4。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于氯化钙溶液与反应酶液的体积比为12∶1，氯化钙浓度为1mol/L；醋酸缓冲溶液与反应酶液的体积比为3∶1，醋酸缓冲溶液的浓度为1mol/L，pH为5.5。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于反应温度为42～46℃，反应时间为18～24h。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于反应结束后过滤，使用体积分数95％乙醇清洗2次，再使用纯化水清洗1次。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于磷脂酰丝氨酸产品经正相高效液相色谱仪进行准确测定。
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