CN101230365A

CN101230365A - 一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法

Info

Publication number: CN101230365A
Application number: CNA2008100172619A
Authority: CN
Inventors: 宋晚平; 任静; 王磊; 李强; 董少为
Original assignee: Xi'an Haotian Bioengineering Tech Co Ltd
Current assignee: Xi'an Haotian Bioengineering Tech. Co., Ltd.; Yangling Hao Tian Biological Engineering Technology Co., Ltd.
Priority date: 2008-01-08
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2008-07-30

Abstract

本发明涉及化合物的制备方法，具体涉及一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法。本发明要克服现有技术存在的设备投入大、成本高和反应转化率难以保证的问题。为克服现有技术存在的问题，本发明提供的技术方案是：一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，使用天然卵磷脂为反应基质，反应基质用水分散后，加入L－丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的无机体系，在磷脂酶D的作用下，生成粗品；对粗品进行溶剂萃取得到浓缩产物；浓缩产物经溶剂纯化得磷脂酰丝氨酸，其特征是：反应基质分散用水量是它的3～10倍量(w/v)，分散温度为20℃～60℃；该体系中L－丝氨酸的量是反应基质重量的2～10倍量，无机体系中的水量是反应基质的3～10倍量(w/v)，用缓冲溶液将无机体系的PH值调整为4.5～6.0。

Description

一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法

技术领域：

本发明涉及化合物的制备方法，具体涉及一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法。

背景技术：

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是磷脂家族中的一员，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂。通常PS指的是一组化合物，而并非单一成分，这是由于不同原料来源的的产品脂乙酰残基变化非常大。PS存在于所有的动物、高等植物以及微生物的生物膜中，是细胞膜磷脂的重要组分之一，它占哺乳类动物脑中全部磷脂的10％-20％，对许多细胞代谢过程有重要的调节作用。其主要功效可提高脑细胞的活力，对治疗脑萎缩，预防老年痴呆症，改善老年人的大脑功能有很好的疗效；同时延长青少年的注意力时段，增加学习时的集中力有效提高学习成绩；另外可以减少压力激素的分泌，对改善失眠、注意力分散、多动症等症状有显著作用；对于提高机体免疫力也有一定的功效。

有关磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的制备方法有很多，其中以提取法和酶转化法为主。提取法是从动物卵磷脂中提取PS，主要为动物的大脑及内脏。专利CN1583766A和CN1562081就是以动物脑为原料提取PS，专利CN1649988是以鱼内脏为原料提取PS。提取法工艺较为简单，但是由于疯牛病等原因，其产品的安全性遭到怀疑，已处于淘汰边缘；另外原料来源于动物，前处理较难。酶转化法是目前PS生产的主要方法，这一方法是使用天然卵磷脂为反应基质，加入L-丝氨酸，在磷脂酶D的作用下，生成磷脂酰丝氨酸，其反应原理是利用磷脂酶D催化转酰基反应，使多种含有伯、仲位羟基的分子与磷脂上的乙酰胺或胆碱基团进行交换形成新的磷脂。在此过程中，反应基质需要进行均质化处理，否则在其达不到理想的均质化水平的情况下，会导致反应转化率低。

日本公开专利2001-186898是两相反应，也就是将原料磷脂溶解于正己烷、乙酸乙酯等极性较小的有机溶剂中，L-丝氨酸、无机盐及磷脂酶D溶于水中，反应是在两相界面上进行的。原料磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)含量70％，得到50％PS，反应收率85.2％，转化率60.8％，有机溶剂倍量是原料的5～40倍，反应成本较高，同时转化率较低。

专利JP2002051794和专利DE102004002053都是单一水相反应，它们分别公布了下述信息，专利JP2002051794中水的用量是原料质量的10％～100％，专利DE102004002053中水的用量是原料质量的60％～95％，由于用水量小，因此这两个专利所说的制备过程中均要求有特殊的均质化设备，以达到理想的均质化水平，保证产品的反应转化率。其存在的问题是：设备投入大，成本高，对均质化设备依赖强，需要经常检测均质化结果，反应转化率难以保证。

发明内容：

本发明要提供一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，以克服现有技术存在的设备投入大、成本高和反应转化率难以保证的问题。

为克服现有技术存在的问题，本发明提供的技术方案是：一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，使用天然卵磷脂为反应基质，反应基质用水分散后，加入L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的无机体系，在磷脂酶D的作用下，生成粗品；对粗品进行溶剂萃取得到浓缩产物；浓缩产物经溶剂纯化得磷脂酰丝氨酸，其特征是：反应基质分散用水量是它的3～10倍量(w/v)，分散温度为20℃～60℃；该体系中L-丝氨酸的量是反应基质重量的2～10倍量，无机体系中的水量是反应基质的3～10倍量(w/v)，用缓冲溶液将无机体系的PH值调整为4.5～6.0。

反应基质分散用水量是它的6～8倍量(w/v)，无机体系中的水量是反应基质的6～8倍量(w/v)。

无机体系中L-丝氨酸的量是反应基质重量的4～6倍量。

浓缩产物中加入反应基质的0.001％～0.02％(W/W)的抗氧化剂，所述抗氧化剂可以是天然的VE、VC、合成的VC酯、D-α-琥珀酸生育酚或BHT。

上述钙盐优选氯化钙，添加量为0.01～0.1mol/L；磷脂酶D的添加量为每1g反应基质中添加10～100个单位的磷脂酶D。配比合适的氯化钙可以有效促进磷脂酶D的转化活性；磷脂酶D加的过量，产品中会残留有酶活性，进一步影响到产品稳定性，如果量加的少了，会影响反应的转化率。

上述制备方法还包括丝氨酸的回收步骤，即将含有丝氨酸的反应母液，浓缩到一定程度，加入乙醇，要求乙醇浓度10％～90％，加入乙醇后有大量沉淀析出，此沉淀主要为L-丝氨酸，然后再用同浓度的乙醇洗3-4遍，最后将洗好的L-丝氨酸烘干。即可以重复利用，节约成本。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、设备投资小、成本低：本发明提供了一种工序简单，更适合工业化生产PS的方法。本发明是单水相反应，反应体系中无有机溶剂，其最大特点是：反应基质的分散中添加了大量的水，与对比文件相比较可以看到，我们所用的水量大幅增加，这样在工业化的生产中就不需要特殊的均质化设备，使用一般的搅拌设备即可以使反应基质完全分散于水中成胶状，无颗粒状而到达理想的分散效果，该过程仅需1小时左右。

2、产物不但收率高，而且纯度高：由本发明所得到的磷脂浓缩产物，其目的磷脂是磷脂酰丝氨酸，主要副产物为磷脂酸(Phosphatidicacid，PA)，它是磷脂在PLD作用下的水解产物。除此之外产品中还含有与原料磷脂相同的磷脂成分，如PC、PE(磷脂酰乙醇胺)、PI(磷脂酰肌醇)等。本发明在对反应的水量进行调整的同时，对其它的反应参数也进行了大的调整，例如在对比文件中无机体系中L-丝氨酸的添加量是磷脂基质的20％～100％，而在本发明中L-丝氨酸的添加量是磷脂基质的2～10倍量，在这种过量的条件下可以有效的竞争羟基受体，抑制磷脂的水解，在保证获得比较高的收率的同时，还可减少了附产物的生成，转化率高，纯度高，更适用于工业化生产。以PC含量相同的原料为反应基质，其得到的PS含量和反应转化率均高于现有技术。

3、本发明中的原料来源广泛：本发明方法中的反应基质为天然卵磷脂，可以是从大豆、菜籽、棉籽中提取，本发明的方法优选大豆卵磷脂作为反应基质，大豆卵磷脂的主要成分磷脂酰胆碱的含量在10％～90％都可以发生该反应此外，大豆卵磷脂中还富含其它卵磷脂成分，如PE，PI等，大量实验表明，本发明的方法尤其适用于原料为40％～60％PC含量的大豆卵磷脂。卵磷脂侧链2位上连接的常为亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等至少一种或多种不饱和脂肪酸，其侧链1位上含有较多的饱和脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、花生酸等至少一种或多种饱和脂肪酸。反应产物PS上的侧链基团保留有和反应基质一致的侧链基团。此外，原料磷脂也可以是米糠油脱酸副产物的提取物或是提取物的精制物，其主要成分也是作为反应基质的磷脂酰胆碱(PC)，含量在10％～90％。另外利用鱿鱼加工的副产物，主要为鱿鱼油的磷脂提取物或是这些提取物的精制物，有效成分磷脂酰胆碱含量10％～90％，其中不饱和脂肪酸主要是二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)分别占侧链不饱和脂肪酸的12％，24％。

作为反应的转化酶即磷脂酶D(PLD)，具有磷脂酰基转移活性，它来源放线菌的链霉菌属，放线菌属，马拉杜放线菌属，诺卡氏菌属，高温放线菌属的至少一种菌株，优选反应产物收率高的菌株如链霉菌属。磷脂酶D还可以来源于植物提取，这些植物包括甘蓝，蓖麻豆，胡萝卜，草莓等。

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明作详细地说明。

实施例1：

称取50g大豆卵磷脂，磷脂酰胆碱(PC)含量25.32％(粉末状，市售)。加入400ml水搅拌，加热温度50℃，半小时后分散均匀。另外称取L-丝氨酸100g，CaCL₂3.2g，醋酸钠12g，醋酸1.4ml，加入400ml水搅拌溶解，测得PH5.0，将二种体系混合后，加入PLD0.18g，活力单位1000units/g。开始计时，反应温度40℃～50℃，反应18hr后，检测转化率。转化完全后，加入乙酸乙酯萃取，然后浓缩萃取液，加入0.5mgVE做抗氧化剂，最后用乙腈处理混合磷脂，得到26.3g粉末PS，PS含量43.78％。见附表。

实施例2：

称取50g大豆卵磷脂，磷脂酰胆碱(PC)含量48.73％(粒状，市售)，加入300ml水搅拌，加热温度20℃，半小时后分散均匀。另外称取L-丝氨酸200g，CaCL₂6.4g，醋酸钠22.2g，醋酸2.8ml，加入300ml水搅拌溶解，测得PH5.0，将二种体系混合后，加入PLD0.80g，活力单位1500units/g。开始计时，反应温度40℃～50℃，反应20hr后，检测转化率。转化完全后，加入正己烷萃取，然后浓缩萃取液，加入2.5mg VC做抗氧化剂，最后用乙醇处理混合磷脂，得到43.0g粉末PS，PS含量53.68％。

实施例3：

称取50g大豆卵磷脂，磷脂酰胆碱(PC)含量60.30％(块状，市售)，加入400ml水搅拌，加热温度50℃，半小时后分散均匀。另外称取L-丝氨酸300g，CaCL₂7.9g，醋酸钠27.4g，醋酸3.5ml，加入400ml水搅拌溶解，测得PH5.2，将二种体系混合后，加入PLD1.10g，活力单位1500units/g。开始计时，反应温度40℃～50℃，反应20hr后，检测转化率。转化完全后，加入正己烷萃取，然后浓缩萃取液，加入2.5mg VC做抗氧化剂，最后用乙醇处理混合磷脂，得到44.5g粉末PS，PS含量62.86％。

实施例4：

称取50g大豆卵磷脂，磷脂酰胆碱(PC)含量78.27％(块状，市售)，先将原料切成片状，加入500ml水搅拌，加热温度60℃，1小时后分散均匀。另外称取L-丝氨酸300g，CaCL₂8.6g，醋酸钠21.5g，醋酸3.6ml，加入400ml水搅拌溶解，测得PH4.8，将二种体系混合后，加入PLD2.0g，活力单位1500units/g。开始计时，反应温度40℃，反应12hr后，检测转化率。转化完全后，加入正己烷萃取，然后浓缩萃取液，加入5mgVE做抗氧化剂，最后用乙醇处理混合磷脂，得到42.0g粉末PS，PS含量79.08％。

实施例5：

以米糠油脱酸副产物为原料，醇提丙酮去油后得到磷脂的粗提物，PC含量30.26％，取36g粗提物，加入200ml水搅拌，加热温度30℃，半小时后分散均匀。另外称取L-丝氨酸100g，CaCL₂3.6g，醋酸钠20.5g，醋酸2.0ml，加入100ml水搅拌溶解，测得PH4.5，将二种体系混合后，加入PLD1.80g，活力单位2000units/g。加入PLD后开始计时，反应温度40℃～45℃，16hr后，检测转化率。转化完全后，加入乙酸乙酯萃取，然后浓缩萃取液，加入7.2mgBHT做抗氧化剂，最后用乙醇处理混合磷脂，得到23.6g粉末PS，PS含量28.45％。

实施例中各成分含量见下表。

实施例2和实施例3为优选实施例。

Claims

1.一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，使用天然卵磷脂为反应基质，反应基质用水分散后，加入L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的无机体系，在磷脂酶D的作用下，生成粗品；对粗品进行溶剂萃取得到浓缩产物；浓缩产物经溶剂纯化得磷脂酰丝氨酸，其特征是：反应基质分散用水量是它的3～10倍量(w/v)，分散温度为20℃～60℃；该体系中L-丝氨酸的量是反应基质重量的2～10倍量，无机体系中的水量是反应基质的3～10倍量(w/v)，用缓冲溶液将无机体系的PH值调整为4.5～6.0。

2.如权利要求1所述的一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于：所述反应基质分散用水量是它的6～8倍量(w/v)，无机体系中的水量是反应基质的6～8倍量(w/v)。

3.如权利要求1或2所述的一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于：所述无机体系中L-丝氨酸的量是反应基质重量的4～6倍量。

4.如权利要求3所述的一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于：所述浓缩产物中加入反应基质的0.001％～0.02％(W/W)的抗氧化剂，所述抗氧化剂是天然的VE、VC、合成的VC酯、D-α-琥珀酸生育酚或BHT。

5.如权利要求4所述的一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于：所述钙盐优选氯化钙，添加量为0.01～0.1mol/L；磷脂酶D的添加量为每1g反应基质中添加10～100个单位的磷脂酶D。

6.如权利要求1或2所述的一种粉末磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于：还包括丝氨酸的回收步骤，即将含有丝氨酸的反应母液，浓缩到一定程度，加入乙醇，要求乙醇浓度10％～90％，加入乙醇后有大量沉淀析出，此沉淀主要为L-丝氨酸，然后再用同浓度的乙醇洗3-4遍，最后将洗好的L-丝氨酸烘干。