CN102439125B - 一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法。包括以下步骤：1)对现有南极磷虾油进行溶剂萃取得到磷脂酰胆碱和含有维生素A、维生素E和虾青素的油脂；2)配制酶催化反应体系，所述反应体系为水相反应体系；3)将反应体系加入到反应器中，投入磷脂梅D后持续机械搅拌；4)将所得反应液重复萃取，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸；5)将所得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸与步骤1获得的油脂混合得高品质南极磷虾油。本发明还提供从现有南极磷虾油制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的方法，以及制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法，尤其涉及到一种以南极磷虾中的磷脂酰胆碱为原料经酶法催化制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，并将其复配得到高品质南极磷虾油的方法。
背景技术：
现有技术中，有关磷脂酰丝氨酸的制备方法有多种，其中以提取法和酶转化法为主。提取法是从动物磷脂中提取磷脂酰丝氨酸，主要以动物的大脑为原料。专利CN1583766A就是以动物脑为原料提取磷脂酰丝氨酸。但由于疯牛病等原因，其产品安全性遭到怀疑，现已被淘汰。近年来用大豆卵磷脂为原料酶法制备磷脂酰丝氨酸已经被广泛使用，例如专利CN101230365A，但是这个专利形成的产品中并不含有多不饱和双键长链脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸。专利CN101818179A是以两步酶法从普通的卵磷脂合成含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，普通卵磷脂中的磷脂不含Omega-3多不饱和脂肪酰基，其第一步酶催化反应是采用磷脂酶A1、A2或脂肪酶催化含多不饱和双键的脂肪酸与卵磷脂中的磷脂酰胆碱生成含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱，继而采用磷脂酶D催化丝氨酸与含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的反应，最终生成含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，该发明的不足之处在于：原料卵磷脂和多不饱和脂肪酸均为复杂的混合物，其中的磷脂酰胆碱和多不饱和脂肪酸的有效含量均不高，在未经高度浓缩的情况下，这两种原料中的有效含量一般不超过50％，而在磷脂酶A2或特定于SN2位的脂肪酶的催化下生成目标产物SN2位为含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的概率很低，从而导致了最终生成的产物中含有的多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的浓度更低，这不利于最终产品的品质，如果要提高产品中多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的有效成份浓度，会严重增加生产成本。专利CN100402656C是以提取自鱼肝中的磷脂为原料，专利CN101157946A以提取自鱿鱼中的磷脂为原料，采用磷脂酶D酶法催化鱼肝中的磷脂酰胆碱或鱿鱼中的磷脂酰胆碱与L-丝氨酸反应制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，其中鱼肝磷脂和鱿鱼磷脂中的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱，是制备含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的优良原料，但这两种原料来源有限，不利于规模化生产。本发明人经多年研究探索，发现南极磷虾中或南极磷虾油中的磷脂类化合物含有极为丰富的二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA，是Omega-3多不饱和脂肪酸的丰富来源，这些Omega-3多不饱和脂肪酸主要是结合在磷脂化合物分子的Sn2位，形成Sn2位为富含多不饱和脂肪酰基的磷脂，其中富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱约占南极磷虾油总磷脂含量的30-40％，而南极磷虾总磷脂中的磷脂酰丝氨酸的含量却很低，约只占磷脂含量的1％到3％左右。因此将南极磷虾中的富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰胆碱转化为富含多不饱和脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸是一项非常有意义的课题。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术不足之处而提供一种将现有南极磷虾中的磷脂酰胆碱转化为磷脂酰丝氨酸的制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油方法。
本发明的目的还提供一种从现有南极磷虾油制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的方法。
本发明的目的还提供一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法。
本发明的目的通过以下措施来实现：
一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油方法，其特殊之处在于，制备经过下列步骤：
步骤一，对现有南极磷虾油进行溶剂萃取得到磷脂酰胆碱和含有维生素A、维生素E和虾青素的油脂；
步骤二，配制酶催化反应体系，所述反应体系为水相反应体系；
步骤三，将步骤二的反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂梅D后持续机械搅拌，搅拌时间1～15小时；
步骤四，将步骤三所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸；
步骤五，将步骤四所得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸与步骤一获得的含维生素A、维生素E和虾青素的油脂混合得高品质南极磷虾油，完成制备。
步骤一所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱。
步骤一所述取得的磷脂酰胆碱是为富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱族，该磷脂酰胆碱族含有十几个磷脂酰胆碱分子系列，其中每一个分子系列的化学结构有以下相同和不同：(1)在甘油基的3位即Sn-3上都连接一个胆碱；(2)在甘油基的1位Sn-1和2位Sn-2上各自连接一个脂肪酰基，而在2位Sn-2上通常连接一个含多不饱和双键的长链脂肪酰基，所述的富含多不饱和双键脂肪酰基，其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于5％以上的脂肪酰基含有2个以上的不饱和双键，或其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于3％以上的脂肪酰基含有Omega-3不饱和双键；(3)含有的不饱和双键脂肪酰基含18至22个碳原子，而双键的数目通常为三至六个，所述不饱和双键脂肪酰基属Omega-3不饱和脂肪酸家族系指二十二碳六稀酸脂肪酰基和二十碳五稀酸脂肪酰基。
步骤二所述水相反应体系为富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱、L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的水溶液反应体系，所述水溶液反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升反应液中加入的重量百分比为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量百分比为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量百分比为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2个摩尔/升，水溶液的pH值在5.0～8.5内。
本发明的另一个目的一种从现有南极磷虾油制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的方法，制备步骤为：对现有南极磷虾油进行溶剂萃取；所述溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物；所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱。
本发明的第三个目的一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法，制备经过下列步骤：
步骤一，对现有南极磷虾油进行溶剂萃取或直接由市场购得磷脂酰胆碱；所述萃取按下列步骤：萃取溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物；所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱；
步骤二，配制酶催化反应体系，包括水相反应体系或水相与有机溶剂相组成的两相反应体系；
步骤三，将步骤二得水溶液反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂梅D后持续机械搅拌，继持时间1～15小时后，将所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，完成制备。
所述水相反应体系由现有南极磷虾油制备的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱配制酶催化反应体系，其由富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱、L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的水溶液反应体系，所述水溶液反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升反应液中加入的重量百分比为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量百分比为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量百分比为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2个摩尔/升，水溶液的pH值在5.0～8.5内。
所述水相与有机溶剂相组成的两相反应体系为步骤一中市购的磷脂酰胆碱配制酶催化反应体系，其为先把富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱溶入C5-C9烷烃有机溶剂，后再加入到含有L-丝氨酸、钙盐、短链烃醇或短链烃酮和缓冲溶液配制成的水溶液中，从而形成水相和有机溶剂两相混合的反应体系，所述水溶液和有机溶剂两相混合反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量百分比为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量百分比为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量百分比为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2摩尔/升，C5-C9烷烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为5％～95％，短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为1％～80％，水溶液和有机溶剂两相混合反应体系的pH值在5.0～8.5内。
所述C5-C8烷烃有机溶剂为从下列物品中任选：戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。
所述短链烃醇或短链烃酮为从下列物品中任选：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：1)本发明的第一个优势是利用来源于南极磷虾油的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱或南极磷虾油本身为反应物，利用磷脂酶D生物转化方法制备得到富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸。产品原料易得，反应简单实用。2)本发明的第二个优势，是将多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸与南极磷虾油或提取磷脂酰胆碱后的南极磷虾油混合，提高南极磷虾油产品中多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的含量。最终得到的产品可用于高级营养品和保健品，也可添加入食品、药品或化妆品中使用。
附图说明：
图1为南极磷虾磷脂酰胆碱与转化形成的磷脂酰丝氨酸分子结构式的异同点。
图2为在磷脂酶D的催化下由磷脂酰胆碱生成磷脂酰丝氨酸的反应示意图。
为更好地理解本发明的内容，先就图1作说明：图中，Sn-1、Sn-2和Sn-3分别指南极磷虾中的磷脂中甘油酯基团的1位、2位和3位；R1和R2为长碳链脂肪酰基，Sn-1位的-R1常见的有：-C15H31、-C17H35、-C17H33，若其为-C15H31，则说明R1来自十六碳酸或棕榈酸，-C15H31与其相连的羰基基团构成一个十六碳脂肪酰基，表示在Sn-1位是一个十六碳酸与甘油的Sn-1位醇形成的酯；若其为-C17H35，则说明R1来自十八碳酸或硬脂酸，-C17H35与其相连的羰基基团构成一个十八碳脂肪酰基，表示在Sn-1位是一个十八碳酸与甘油的Sn-1位醇形成的酯；若其为-C17H33，则说明R1来自十八碳酸或油酸，-C17H33与其相连的羰基基团构成一个十八碳脂肪酰基，表示在Sn-1位是一个十八碳酸与甘油的Sn-1位醇形成的酯。Sn-2位的-R2常见的有：-C17H31、-C19H29、-C19H31、-C21H31、-C17H33，若其为-C17H31，则说明R2来自十八碳二稀酸或亚油酸，-C17H31与其相连的羰基基团构成一个十八碳二稀脂肪酰基，表示在Sn-2位是一个十八碳二稀酸与甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其为-C19H29，则说明R2来自二十碳五稀酸或EPA，-C19H29与其相连的羰基基团构成一个二十碳五稀脂肪酰基，表示在Sn-2位是一个二十碳五稀酸与甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其为-C19H31，则说明R2来自二十碳四稀酸或花生四烯酸，-C19H31与其相连的羰基基团构成一个二十碳四稀脂肪酰基，表示在Sn-2位是一个二十碳四稀酸与甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其为-C21H31，则说明R2来自二十二碳六稀酸，-C21H31与其相连的羰基基团构成一个二十二碳六稀脂肪酰基，表示在Sn-2位是一个二十二碳六稀酸与甘油的Sn-2位醇形成的酯；若其为-C17H33，则说明R2来自十八碳稀酸或油酸，-C17H33与其相连的羰基基团构成一个十八碳稀脂肪酰基，表示在Sn-2位是一个十八碳稀酸与甘油的Sn-2位醇形成的酯。Sn-3位的-X为不同的连接基团，若其为-CH2CH2N(CH3)3，则表示该磷脂化合物为磷脂酰胆碱；若其为-CH2CH(NH2)COOH，则该磷脂化合物为磷脂酰丝氨酸。
图2给出了在磷脂酶D的催化下由磷脂酰胆碱生成磷脂酰丝氨酸的反应示意图。在本发明公开的反应条件下，磷脂酶D可以催化磷脂酰胆碱生成磷脂酰丝氨酸，分子式的意义是指，一个分子的磷脂酰胆碱可以和一个分子的L-丝氨酸发生反应，生成一个分子的磷脂酰丝氨酸同时生成一个分子的胆碱。
具体实施方式：
一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油方法，制备经过下列步骤：
步骤一，对现有南极磷虾油采用溶剂萃取得磷脂酰胆碱和过滤液去溶剂后的油脂。所述溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物。所述萃取为南极磷虾油与溶剂在反应器混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得磷脂酰胆碱。所述取得的磷脂酰胆碱是富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂族，该磷脂酰胆碱族含有十几个磷脂酰胆碱分子系列，其中每一个分子系列的化学结构有以下相同和不同：(1)在甘油基的3位即Sn-3上都连接一个胆碱；(2)在甘油基的1位Sn-1和2位Sn-2上各自连接一个脂肪酰基，而在2位Sn-2上通常连接一个含多不饱和双键的长链脂肪酰基，所述的富含多不饱和双键脂肪酰基，其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于5％以上的脂肪酰基含有2个以上的不饱和双键，或其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于3％以上的脂肪酰基含有Omega-3不饱和双键；(3)含有的不饱和双键脂肪酰基含18至22个碳原子，而双键的数目通常为三至六个，所述不饱和双键脂肪酰基属Omega-3不饱和脂肪酸家族系指二十二碳六稀酸脂肪酰基和二十碳五稀酸脂肪酰基。
步骤二，配制酶催化的反应体系。所述反应体系为水相反应体系，其由现有的南极磷虾油制取的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱来配制，其由富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱、L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的水溶液反应体系，所述水溶液反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升反应液中加入的重量百分比为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量百分比为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量百分比为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2个摩尔/升，水溶液的pH值在5.0～8.5内。
本步骤中，L-丝氨酸：商品化的生物产品；钙盐：为可溶性钙盐，本实施例采用的是氯化钙和硫酸钙，在水中的浓度可为0.1克每升至20克每升；缓冲液：为常规水缓冲液，例如磷酸盐水缓冲液或醋酸盐水缓冲液，一般为0至0.2摩尔每升盐浓度体系。
步骤三，将步骤二的反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂梅D后持续机械搅拌，搅拌转速为100rpm，搅拌时间为2～15小时。
本步骤中，磷脂酶D：是一种酶，是来源于链霉菌和/或植物的商品化酶制剂，如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO，U.S.A.)出售的磷脂酶D(phospholipase D)，该酶也可纯化自链霉菌的发酵液。
步骤四，将步骤三所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸。本步骤中萃取溶剂及萃取方法与步骤一中相同。
步骤五，将步骤四所得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸与步骤一过滤液去溶剂后的油脂混合得高品质南极磷虾油，完成制备。
按此方法制备的高品质南极磷虾油中的磷脂酰丝氨酸含量能高于40％。
本发明的另一个目的一种从现有南极磷虾油制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的方法，制备步骤为：对现有南极磷虾油进行溶剂萃取；所述溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正己烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物；所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱。
本发明的第三个目的一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法，制备经过下列步骤
步骤一，与从现有南极磷虾油制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的方法相同；
步骤二，配制酶催化反应体系，包括水相反应体系或水相与有机溶剂相组成的两相反应体系；所述水相反应体系为直接由由现有的南极磷虾油制取的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱来配制，该步骤与制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油方法的步骤二相同，所不同的是还可以采取如下措施：所述水相与有机溶剂相混合而成的两相反应体系由市购的磷脂酰胆碱配制，其先由磷脂酰胆碱溶入C5-C9烷烃有机溶剂，后加入到含有L-丝氨酸、钙盐、短链烃醇或短链烃酮和缓冲溶液配制成的水溶液和有机溶剂两相混合反应体系，所述水溶液和有机溶剂两相混合反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升混合反应液中加入的重量百分比为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量百分比为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量百分比为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2摩尔/升，C5-C9烷烃有机溶剂在混合反应液中占有的体积百分比为5％～95％，短链烃醇或短链烃酮在总混合反应液中占有体积百分比为1％～80％，水溶液和有机溶剂两相混合反应体系的pH值在5.0～8.5内。
所述C5-C8烷烃有机溶剂为从下列物品中任选：戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。所述短链烃醇或短链烃酮为从下列物品中任选：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮或它们的同分异构体中的任何一种溶剂或这些溶剂以任何比例混合形成的混合溶剂。
步骤三，将步骤二得反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂梅D后持续机械搅拌，继持时间1～15小时后，将所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，完成制备。
本发明采用下述分析条件：
多不饱和脂肪酸相对含量分析方法参考专利CN101818178A所述方法，具体的如下：
样品经适量氯仿溶解，然后经6000rpm离心20min，将有机相层制备成20-100mg/mL的样品氯仿溶液，取有机相点于薄波层硅胶板上，然后经展开剂展开，展开剂为：氯仿∶水∶甲醇＝63.5∶3.5∶25(V∶V∶V)，经2’，7’-二氯荧光素显色，然后连同硅胶刮下磷脂酰丝氨酸所在位置的谱带，甲酯化后经气相色谱仪(GC)分析，利用面积归一法计算各种脂肪酸相对含量。
色谱条件为：
仪器：Agilent 6890气相色谱仪
检测器：氢火焰离子检测器(FID)
毛细管柱：FFAP30.0m×2.5mm×0.10μm
进样口温度：220℃；柱温：200℃；检测器温度：250℃；
进样量：1μL；进样分流比：20∶1；氮气流速：0.6mL/min
样品中磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸含量的分析方法如下：
磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸标准品购买于Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO，U.S.A.)，其余试剂均为液相色谱纯度级别。
磷脂酰胆碱标准曲线绘制：
取300mg磷脂酰胆碱标准品溶解于3mL氯仿溶剂中，制备出5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，80mg/mL，100mg/mL磷脂酰胆碱氯仿待测样品，将该上述系列样品经高相液相色谱仪(HPLC)分析，绘制出磷脂酰胆碱质量-积分面积标准曲线。
待测样品中磷脂酰胆碱含量测定：
待测样品溶解于适量氯仿，然后与6000rpm下离心20min，将有机相层制备成20-40mg/mL的样品氯仿溶液，将该样品经高相液相色谱仪(HPLC)分析，根据待测样品中磷脂酰胆碱峰积分面积，利用上述磷脂酰胆碱质量-积分面积标准曲线计算待测样品中磷脂酰胆碱的绝对含量。具体计算方法为：
PC％＝PC质量/样品质量×100％
磷脂酰丝氨酸标准曲线绘制：
取300mg磷脂酰丝氨酸标准品溶解于3mL氯仿溶剂中，制备出5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，80mg/mL，100mg/mL磷脂酰丝氨酸氯仿待测样品，将该上述系列样品经高相液相色谱仪(HPLC)分析，绘制出磷脂酰丝氨酸质量-积分面积标准曲线。
待测样品中磷脂酰丝氨酸含量测定：
将待测样品溶解于适量氯仿中，然后在6000rpm下离心20min，将有机相层制备成20-40mg/mL的样品氯仿溶液，将该样品经高相液相色谱仪(HPLC)分析，根据待测样品中磷脂酰丝氨酸峰积分面积，利用上述磷脂酰丝氨酸质量-积分面积标准曲线计算待测样品中磷脂酰丝氨酸的绝对含量。具体计算方法为：
磷脂酰丝氨酸％＝磷脂酰丝氨酸质量/样品质量×100％
色谱条件为：
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；
检测器：G1314B紫外检测器；检测波长：205nm；
分析柱：Kromasil，KR100-5SIL，(250mm×4.6mm)；柱温：30℃；
流动相：乙腈∶甲醇∶85％磷酸＝900∶95∶5(V∶V∶V)；流速：1.0mL/min。
以下对本发明在具体应用中的最佳实施例进行详细说明，这些实施例并非对本发明的范围进行约束。
实施例1：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱的萃取。
称取20公斤南极磷虾油，其含：磷脂中EPA为19.3％，DHA为11.5％，PC含量为36.3％，磷脂酰丝氨酸含量为1.5％，40升丙酮，将上述两种原料加入到100升反应器中，向反应器中充入氮气，零摄氏度下，持续机械搅拌，80rpm，反应2至15小时，结束反应，过滤，将固体冷冻干燥得到富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱13公斤，其中：EPA为18.3％，DHA为8.1％，PC含量为47.8％，磷脂酰丝氨酸含量为2.4％，另将过滤液在20摄氏度下减压浓缩去除溶剂，得到7公斤红棕色油脂。
实施例2：富含有磷脂酰丝氨酸的精炼南极磷虾油
称取10公斤南极磷虾油，其含：磷脂中EPA为19.3％，DHA为11.5％，PC含量为36.3％，磷脂酰丝氨酸含量为1.5％，4至6公斤L-丝氨酸，0.1至0.8公斤氯化钙，20升至100升pH5.5至pH8.5范围内的水缓冲液，加入到150升反应器中，在氮气保护下，投入0.1至1升磷脂酶D(约2万至50万单位)，于45-53摄氏度范围内，持续机械搅拌，100rpm，反应2至15小时停止搅拌，结束反应，加入丙酮10到50公斤，再加入10到50公斤正庚烷，持续机械搅拌，30rpm，0.5小时后停止搅拌，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取2到3次，集合有机萃取液，在20摄氏度下减压浓缩，获得9.5公斤富含有磷脂酰丝氨酸的南极磷虾油，磷脂中不饱和脂肪酸含量经GC检测为26.7％，其中EPA为17.2％，DHA为9.5％，磷脂中PC含量经HPLC检测为2.7％，磷脂酰丝氨酸含量为31.8％。
实施例3：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸精品
称取10公斤实施例1制备得到的南极磷虾磷脂酰胆碱，其中，磷脂中EPA为18.3％，DHA为8.1％，PC含量为47.8％，磷脂酰丝氨酸含量为2.4％，12至20公斤L-丝氨酸，0.4-1.5公斤氯化钙，50升至120升pH5.5至pH8.5范围内的水缓冲液，加入到150升反应器中，在氮气保护下，投入0.1至2升磷脂酶D 100万单位，于45-53摄氏度范围内，持续机械搅拌，100rpm，反应2至15小时，结束反应，加入乙醇10到60公斤，正己烷10到60公斤，持续机械搅拌，30rpm，0.5小时后停止搅拌，静置分层，取有机相，依照前述方法重复进行2到4次萃取，汇集有机萃取液，在20摄氏度下减压浓缩，获得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸粗品，再加入丙酮10到50公斤，持续机械搅拌，80rpm，0.5小时后停止搅拌，过滤，将固体冷冻干燥得到8.6公斤富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸精品，其PC含量经HPLC检测为5.5％，磷脂酰丝氨酸含量经HPLC检测为43.9％，磷脂中EPA经GC检测为17.5％，DHA为7.9％。
实施例4：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸
将实施例1制备得到的磷脂酰胆碱3公斤，其中含：磷脂中EPA为18.3％，DHA为8.1％，PC含量为47.8％，磷脂酰丝氨酸含量为2.4％，4至10公斤L-丝氨酸，0.2至0.8公斤氯化钙，20升至40升pH5.5至pH8.5范围内的水缓冲液，加入到100升反应器中，向反应器中充入氮气，投入0.1至1升磷脂酶D约2万至50万单位，于45-53摄氏度范围内，持续机械搅拌，100rpm，反应2至15小时，结束反应，加入丙酮5到25公斤，搅拌，再加入5到25公斤正庚烷，持续机械搅拌，30rpm，0.5小时后停止搅拌，静置分层，取有机相，依照前述方法重复萃取2到3次，集合有机萃取液，在20摄氏度下减压浓缩，获得2.8公斤油状黄色富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，其PC含量经HPLC检测为8.5％，磷脂酰丝氨酸含量经HPLC检测为36.4％，磷脂中EPA经GC检测为17.1％，DHA为7.3％。
实施例5：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸南极磷虾油
将实施例4制备得到的2.8公斤磷脂酰丝氨酸和实施例1制备得到的7公斤红棕色油脂，加入20升反应器中，向反应器中充入氮气，0到10摄氏度下，持续机械搅拌，100rpm，，反应2至15小时，结束反应，得到富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸南极磷虾油9.8公斤，其PC含量经HPLC检测为10.5％，磷脂酰丝氨酸含量经HPLC检测为10.8％，磷脂酰丝氨酸中的EPA经GC检测为17.1％，DHA为7.3％。
实施例6：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸精炼南极磷虾油
称取10公斤南极磷虾油，其中含：磷脂中EPA含量为19.3％，DHA含量为11.5％，PC含量为36.3％，磷脂酰丝氨酸含量为1.5％；由实施例3制得5公斤磷脂酰丝氨酸，其中磷脂酰丝氨酸含量为43.9％，EPA含量为17.5％，DHA含量为7.9％；加入20升反应器中，向反应器中充入氮气，零摄氏度下，持续机械搅拌，100rpm，，反应2至15小时，结束反应，得到富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸南极磷虾油15公斤，磷脂酰丝氨酸含量经HPLC检测为18.6％，磷脂中EPA经GC检测为17.6％，DHA为7.8％。
实施例7：富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸精品
称取10公斤实施例1制备得到的南极磷虾磷脂酰胆碱，其中EPA为18.3％，DHA为8.1％，PC含量为47.8％，磷脂酰丝氨酸含量为2.4％，溶入15至40升的正己烷，加入12至20公斤L-丝氨酸、0.4-1.5公斤氯化钙，5至20升的丙酮或丙醇，50升至100升pH5.5至pH8.5范围内的水缓冲液，加入到150升反应器中，在氮气保护下，投入0.1至2升磷脂酶D 100万单位，于45-53摄氏度范围内，持续机械搅拌，100rpm，反应2至15小时，结束反应，再加入正己烷0到50升，持续机械搅拌，30rpm，0.5小时后停止搅拌，静置分层，取有机相，依照前述方法重复进行2到4次萃取，汇集有机萃取液，在20摄氏度下减压浓缩，获得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸粗品，再加入乙醇10到30升，持续机械搅拌，80rpm，0.5小时后停止搅拌，过滤，将固体冷冻干燥得到8.6公斤富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸精品，其PC含量经HPLC检测为5.5％，磷脂酰丝氨酸含量经HPLC检测为43.5％，磷脂中EPA经GC检测为17.3％，DHA为7.6％。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围，一个有本专业知识的普通技术人员，仍可以根据本专利所传授的技术，在本发明的范围内产生其它的实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法，其特征在于：
步骤一，对现有南极磷虾油进行溶剂萃取得到磷脂酰胆碱和含有维生素A、维生素E和虾青素的油脂；
步骤二，配制酶催化反应体系，所述反应体系为水相反应体系，水相反应体系为富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱、L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的水溶液反应体系，所述水溶液反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升反应液中加入的重量份数为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量份数为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量份数为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2个摩尔/升，水溶液的pH值在5.0～8.5内；
步骤三，将步骤二的反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂酶D后持续机械搅拌，搅拌时间1～15小时；
步骤四，将步骤三所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸；
步骤五，将步骤四所得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸与步骤一获得的含维生素A、维生素E和虾青素的油脂混合得高品质南极磷虾油，完成制备。
2.根据权利要求1所述的制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法，其特征在于，步骤一所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱。
3.根据权利要求1所述的制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的高品质南极磷虾油的方法，其特征在于，步骤一所述取得的磷脂酰胆碱是为富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱族，该磷脂酰胆碱族含有十几个磷脂酰胆碱分子系列，其中每一个分子系列的化学结构有以下相同和不同：(1)在甘油基的3位即Sn-3上都连接一个胆碱；(2)在甘油基的1位Sn-1和2位Sn-2上各自连接一个脂肪酰基，而在2位Sn-2上通常连接一个含多不饱和双键的长链脂肪酰基，所述的富含多不饱和双键脂肪酰基，其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于5％的脂肪酰基含有2个以上的不饱和双键，或其含义为Sn-2位连接的脂肪酰基中有高于3％的脂肪酰基含有Omega-3不饱和双键；(3)含有的不饱和双键脂肪酰基含18至22个碳原子，而双键的数目通常为三至六个，所述不饱和双键脂肪酰基属Omega-3不饱和脂肪酸家族系指二十二碳六稀酸脂肪酰基和二十碳五稀酸脂肪酰基。
4.一种制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，采取如下步骤：
步骤一，对现有南极磷虾油进行溶剂萃取：所述萃取按下列步骤：萃取溶剂可在下列物品中任选：食品安全级的正庚烷或正已烷、食用乙醇或丙酮、或者是它们的混合物；所述萃取为现有南极磷虾油与溶剂在反应器中混合后在氮气环境中、0～30摄氏度下，经机械搅拌，反应0.5～15小时，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱；
步骤二，配制酶催化反应体系，包括水相反应体系或水相与有机溶剂相组成的两相反应体系；
步骤三，将步骤二得水溶液反应体系加入到反应器中，在氮气环境中、温度为35～55摄氏度，投入磷脂酶D后持续机械搅拌，继持时间1～15小时后，将所得反应液重复萃取2～3次，过滤后将固体冷冻干燥得富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸，完成制备。
5.根据权利要求4所述的制备富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤二所述水相反应体系由现有磷虾油制备的富含多不饱和双键脂肪酰基的磷脂酰胆碱、L-丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制成的水溶液反应体系，所述水溶液反应体系中各物质的配比关系如下：磷脂酰胆碱在每升反应液中加入的重量份数为100，L-丝氨酸在每升反应液中加入的重量份数为60～300，钙盐在每升反应液中加入的重量份数为0.05～10，缓冲溶液中缓冲盐的浓度则为0～2个摩尔/升，水溶液的pH值在5.0～8.5内。
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