CN106893747B - PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备PLA1型n‑3多不饱和脂肪酸磷脂的方法以及利用本发明的方法制备的PLA1型n‑3多不饱和脂肪酸磷脂。相比于现有技术中使用商品化的Lecitase Ultra、TL IM、SP435等酶所实现的PLA1位催化反应占比不超过66％的效果，本发明的方法大大提高了PLA1型功能性磷脂的产率。

Description

PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的制备方法
技术领域
本发明属于利用生物催化制备脂类的领域，具体涉及以生物酶制剂作为催化剂，以大豆磷脂、EPA或其酯化衍生物和/或DHA或其酯化衍生物为原料，制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸(PUFA)是指碳原子数不少于18且含有两个以上双键的一类脂肪酸；其中，第一个双键出现在碳链甲基端第3位的PUFA称为n-3多不饱和脂肪酸。n-3多不饱和脂肪酸的典型实例包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。大量药理及动物实验证明，DHA为视网膜正常发育和神经系统正常功能的行使所必需。在大脑和视网膜中，DHA分别占该处脂肪酸总量的约20％及约35％，并主要以磷脂形式存在。数据表明，DHA从妊娠26-40周开始在胎儿中枢神经系统的神经细胞中积累；与妊娠26周相比，妊娠最后3个月胎儿大脑和小脑中DHA含量增加了三至五倍。提高婴儿时期DHA的摄入量明显促进大脑内神经细胞的生长和树突的形成，因此有助于提高学习记忆能力。不仅如此，DHA还有利于预防老年痴呆的发生。研究表明，与健康老年人相比，老年痴呆患者大脑海马细胞的DHA含量降低近10％；给予DHA则有助于病症的减缓。此外，脂肪酸链长及不饱和度与视网膜中的光感受膜的液态性、流动性、屈折性、透过性密切相关。DHA供给不足时，眼睛的感光能力及视力都会出现明显的下降。另一方面，EPA作为一种多不饱和脂肪酸化学信使，在免疫和炎症反应中起到重要作用。具体而言，EPA可通过调控血小板和血管壁处磷脂酰甘油(PG)的产生而发挥抗血栓作用；还通过竞争性抑制使得经由花生四烯酸路径合成的PGE2降低，从而减轻急性炎症反应。动物实验表明，EPA能够显著降低血甘油三酯水平。
DHA及EPA的上述生理功效为全球研究人员及消费者公认。然而，制备商业化的DHA或EPA膳食补充剂仍存在许多问题。特别地，商业化的DHA及EPA主要以乙酯或甘油三酯形式存在，在吸收效率及氧化稳定性方面仍不合期望。小鼠实验表明，与磷脂形式的DHA或EPA相比，大脑、肝脏及肾脏等器官吸收乙酯或甘油三酯形式的DHA或EPA的速率降低了两倍以上。此外，甘油三酯作为能量源，通常经过体内消化吸收后直接进入能量代谢途径用于产生ATP，或者被输运至脂肪细胞作为能量储备。因此，甘油三酯形式的DHA或EPA仅被用作燃料，并未发挥其功能优势。与此相反地，磷脂形式的多不饱和脂肪酸天然存在于体内的膜结构中，磷脂形式的DHA或EPA更易发挥其生物活性。
磷脂是一类含有磷酸基的脂类，一般地具有亲水性的头部和疏水性的尾部；所述亲水性头部由磷酸基及与磷酸基相连的取代基(例如含氨碱或醇类)构成，所述疏水性尾部由脂肪酸链构成。机体内的磷脂主要分为两类，以甘油作为骨架的磷脂称为甘油磷脂，以神经鞘氨醇作为骨架的磷脂称为鞘磷脂。
Figure BDA0000881355330000021
甘油磷脂结构通式
甘油磷脂是甘油、磷脂和脂肪酸的衍生物。根据X基团的不同，可将甘油磷脂分为磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)等。如果甘油磷脂的甘油基1位与2位的两个羟基中仅有一个被脂肪酸酯化，则称为溶血磷脂(LPL)。相应地，根据X基团的不同，可将溶血磷脂分为溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)等。
如上所述，脂肪酸链残基可位于磷酸甘油基的1位或2位(分别如结构通式中的R1和R2所示)。特异性催化磷酸甘油基1位和2位酯键水解、生成游离脂肪酸的可逆反应的酶分别被称为PLA1酶和PLA2酶。人体小肠内存在的磷脂酶即属于PLA2酶。被摄入体内的磷脂分子在小肠内被水解为2-溶血甘油基磷脂(2-Lyso-PL)和对应于R2的游离脂肪酸。研究表明，经小肠消化吸收后，此类游离脂肪酸大部分将与单甘油酯结合生成甘油三酯，并以甘油三酯的形式参与体内代谢。因此，存在于脂甘油基2位的多不饱和脂肪酸(称为PLA2型多不饱和脂肪酸)在体内并不能完全发挥其调节生理功能的作用。基于这种考虑，近年来，越来越多的研究关注PLA1型多不饱和脂肪酸的代谢机理及生物活性。研究证明，PLA1型DHA或EPA磷脂使得DHA或EPA不但以高生物活性的磷脂形式进入体内，而且以该形式参与肝内的脂蛋白的合成，进而有可能最终进入大脑。可见，PLA1型多不饱和脂肪酸磷脂为具有生物活性的形式。
本领域已开发了多种将DHA和/或EPA接入磷脂PLA1位的方法。特别地，如参考文献1-9所示出的，随着酶工程的快速发展，已将具有PLA1位催化作用的磷脂酶用在催化n-3多不饱和脂肪酸接入的反应中。
[参考文献1]孙兆敏等，酶法制备n-3多不饱和脂肪酸型磷脂的工艺，《中国油脂》。
[参考文献2]Xiang Li等，Production of Structured Phosphatidylcholinewith High Content of DHA/EPA by Immobilized Phospholipase A1-CatalyzedTransesterification，Int.J.Mol.Sci.。
[参考文献3]In-Hwan Kim等，Synthesis of Structured PhosphatidylcholineContaining n-3 PUFA Residues via Acidolysis Mediated by ImmobilizedPhospholipase A1，J.Am.Oil.Chem.Soc.。
[参考文献4]In-Hwan Kim等，Phospholipase A1-catalyzed synthesis ofphospholipids enriched in n-3 polyunsaturated fatty acid residues，Enzyme andMicrobial Technology。
[参考文献5]Hugo S.Garcia等，Enrichment of lecithin with n-3 fattyacids by acidolysis using immobilized phospholipase A1，GRASAS Y ACEITES。
[参考文献6]TingTing Zhao，Immobilized phospholipase A1-catalyzedmodification of phosphatidylcholine with n3 polyunsaturated fatty acid，FoodChemistry。
[参考文献7]Gudmundur G.Haraldsson等，Preparation of PhospholipidsHighly Enriched with n-3 Polyunsaturated Fatty Acids by Lipase，J.Am.Oil.Chem.Soc.。
[参考文献8]Masashi Hosokawa等，Application of Water Mimics onPreparation of Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids ContainingGlycerolipids，J.Am.Oil.Chem.Soc.。
[参考文献9]马彦庆等，固定化磷脂酶A1催化制备DHA型磷脂，《中国粮油学报》。
然而，上述文献报道的方法均存在缺陷。具体而言，参考文献1-6和9均采用由诺维信公司商业化的PLA1酶催化DHA和EPA与磷脂的酯交换反应。如本发明比较例所示出的，常用的多种PLA1酶对PLA1位的选择并不强，PLA1位DHA或EPA的最高接入率也仅有总接入率的66wt％左右，无法满足合成需求。此外，商业化上述酶制剂均为液态，目前尚无固定化产品，因此上述工艺并不具备工业实施性。
进而，参考文献1和2采用乙酯型n-3多不饱和脂肪酸在无溶剂条件下与磷脂进行酯交换反应，然而，由于脂肪酸乙酯和磷脂的互溶性和反应体系均一性的局限，仅在脂肪酸乙酯与磷脂的重量比高达6:1(重量比近14:1)以上时方能实现该反应，最佳总接入率也仅为25wt％左右。这样的设置不但使得制备成本提高，获得的PLA1型DHA和EPA磷脂的浓度也较低。参考文献3-8和10以游离型DHA和EPA为原料，与磷脂进行酯交换反应。这样的设置提高了DHA和EPA与磷脂的互溶性以及体系的均一性，因此大大降低了DHA和EPA的用量。然而，众所周知的是，相比酯类底物，游离型底物将大幅度降低固定化酶的使用寿命，从而提高了加工成本。更为重要的是，由于游离型脂肪酸不适宜人体直接服用，上述工艺均需进行进一步的纯化步骤以除去产物中大量的游离脂肪酸，再次提高了制备成本。
另外，参考文献9的工艺涉及乙二醇的添加，该物质尚不属于国家允许使用的食品添加剂，因此，工业可行性较差。
因此，还需探索位点选择性更高、适应性更好、工业可行性更好的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的制备方法。
发明内容
一方面，本发明提供了一种制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在室温下，将n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物与大豆磷脂混合，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至30℃-90℃，加入蒸馏水并混合，所述蒸馏水的加入量为步骤(3)中酶制剂加入量的0-6wt％；
(3)将固定化的RM IM脂肪酶加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在30℃-90℃的温度下进行反应，获得PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂。
另一方面，本发明提供了根据第一方面所述的方法制得的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂。
具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：
1.一种制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在室温下，将n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物与大豆磷脂混合，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至30℃-90℃，加入蒸馏水并混合，所述蒸馏水的加入量为步骤(3)中酶制剂加入量的0-6wt％；
(3)将固定化的RM IM脂肪酶加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在30℃-90℃的温度下进行反应，获得PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂。
2.如段落1所述的方法，其中，所述n-3多不饱和脂肪酸为DHA、EPA或二者的组合。
3.如段落2所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物中，DHA的含量不低于50wt％、优选不低于75wt％；所述EPA或其酯类衍生物中，EPA的含量不低于50wt％、优选不低于75wt％。
4.如段落3所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合；所述EPA或其酯类衍生物来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合。
5.如段落3-4中任一项所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物选自于DHA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游离型DHA，或者上述DHA或其酯类衍生物的任意组合；所述EPA或其酯类衍生物选自于EPA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游离型EPA，或者上述EPA或其酯类衍生物的任意组合；优选地，所述DHA或其酯类衍生物为DHA乙酯型衍生物；优选地，所述EPA或其酯类衍生物为EPA乙酯型衍生物。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述大豆磷脂中，磷脂的含量不低于75wt％、优选不低于85wt％。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述n-3多不饱和脂肪酸甘油酯与所述大豆磷脂的重量比为(2-10):1、优选(3-4):1。
8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合在无溶剂体系下进行。
9.如段落1-7中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自于由正己烷、异己烷、丙酮所组成的组中的任一种或任意组合；优选地，所述有机溶剂为正己烷。
10.如段落9所述的方法，其中，所述正己烷的加入量为：每100mg磷脂添加1ml正己烷。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中，将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至45℃-65℃。
12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中，所述蒸馏水的加入量为步骤(3)中酶制剂加入量的1.5-3.5wt％。
13.如段落1-11中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量为步骤(1)中所述油脂混合物的5wt％-35wt％，优选10wt％-30wt％。
14.如段落1-12中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述反应温度为45℃-65℃。
15.如段落1-14中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述反应进行1-48小时，优选4-24小时。
16.根据段落1-15中任一项所述的方法制得的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂。
17.如段落16所述的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂，其中，所述PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的接入率不低于20wt％、优选不低于25wt％。
18.如段落16或17所述的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂，其中，所述n-3多不饱和脂肪酸为DHA、EPA或二者的组合。
19.如段落16-18中任一项所述的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂，其中，所述PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂中，磷脂型与溶血磷脂型产物的重量比为70:30至30:70、优选80:20至40:60。
本发明所述的“室温”是指环境温度在16-26℃的温度范围。
有益效果
本发明首次提出在制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的反应中使用固定化的RMIM脂肪酶，实现产物中PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂占总n-3多不饱和脂肪酸磷脂的85wt％以上、甚至90wt％以上。相比于现有技术中使用商品化的Lecitase Ultra、TL IM、SP435等酶所实现的PLA1位催化反应占比不超过66％的效果，本发明的方法大大提高了PLA1型功能性磷脂的产率。如上所述，对人体而言，与甘油三酯型及乙酯型n-3多不饱和脂肪酸相比，磷脂型、特别是PLA1磷脂型n-3多不饱和脂肪酸具有显著更高的吸收利用率，因此更适于有促进大脑发育、改善心血管健康需求的消费者服用。另一方面，由于吸收利用率高，以本发明的产品作为膳食补充剂可在实现与现有技术等同的生物活性的同时减少脂类摄入总量，更符合健康理念。
RM IM脂肪酶为来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶。现有技术大多将其用于催化甘油三酯的定向酯交换反应。这是首次将固定化的RM IM脂肪酶用于制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的反应中。由于使用此类商购的固定化酶制剂，在大规模制备时不需要经过复杂的固定过程。
在优选的实施方式中，在步骤(1)的油脂混合物中加入正己烷(《GB2760—2014》中加工助剂)，增加了大豆磷脂与含EPA或DHA的酯类混溶，实现了DHA和EPA用量的大幅度降低。在其它优选的实施方式中，采用DHA或EPA的乙酯型衍生物作为原料，产率较高且无需在反应结束后分离游离脂肪酸。然而，RM IM脂肪酶催化EPA或DHA酯化反应的效率受到EPA或DHA自身存在多个双键所造成的空间位阻的影响。特别是当使用乙酯型的EPA或DHA时，该空间位阻的影响更加明显，从而造成接入率的降低。本发明的发明人发现，正己烷的加入使得反应体系的粘度降低，因此提高反应物的流动性，并使得乙酯型底物与脂肪酶的反应更易进行，从而降低了反应时间。因此，在使用乙酯型EPA或DHA的同时在体系中加入正己烷，不但节约了原料，降低了反应时间，还提高了产率，具有更高的工业可行性。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本文所使用的术语“PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂”指的是甘油基1位接入有n-3多不饱和脂肪酸的甘油磷脂，包括PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酸、PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酰、PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酰胆碱、PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酰乙醇胺、PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酰甘油、PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂酰肌醇等。该类型的磷脂能够被PLA1型磷脂酶或者PLA1型脂肪酶水解。本文中也将“PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂”简称为PLA1型功能性磷脂。需要注意的是，PLA1型功能性磷酸甘油基2位的脂肪酸残基没有限制，可为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。类似地，术语“PLA2型n-3多不饱和脂肪酸磷脂”指的是甘油基2位接入有n-3多不饱和脂肪酸的甘油磷脂，该类型的磷脂不能被PLA1型磷脂酶或者PLA1型脂肪酶水解。
本文使用的术语“n-3多不饱和脂肪酸”具有本领域所公认的含义，即第一个双键出现在碳链甲基端第3位的PUFA。本文所述的n-3多不饱和脂肪酸优选为二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或者DHA和EPA的组合。
在第一方面，本发明涉及制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法。
在一些实施方式中，本发明方法的步骤(1)所使用的n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物可为DHA或其酯类衍生物、EPA或其酯类衍生物或者二者的组合。优选地，所述DHA或其酯类衍生物中，DHA的含量不低于50wt％、优选不低于75wt％；所述EPA或其酯类衍生物中，EPA的含量不低于50wt％、优选不低于75wt％。DHA或其酯类衍生物以及EPA或其酯类衍生物可为任何来源，例如自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合。所述DHA或其酯类衍生物可为DHA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物，或者游离型DHA，或者上述DHA或其酯类衍生物的任意组合。所述EPA或其酯类衍生物可选自于EPA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物，或者游离型EPA，或者上述EPA或其酯类衍生物的任意组合。优选地，所述DHA或其酯类衍生物为DHA乙酯型衍生物。优选地，所述EPA或其酯类衍生物为EPA乙酯型衍生物。
大豆磷脂为本领域常用的工业原料，主要含有磷脂酸、磷脂酰胆碱(也称为卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺与磷脂酰肌醇，其中磷脂酰胆碱含量最高。本发明方法的步骤(1)所使用的大豆磷脂中磷脂的含量优选不低于75wt％、更优选不低于85wt％。
本发明方法步骤(1)中n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物原料与大豆磷脂原料的混合在室温(一般地为16-26℃)下进行。优选地，n-3多不饱和脂肪酸甘油酯与大豆磷脂的重量比为(2-10):1、优选(3-4):1。所述混合在无溶剂体系或存在有机溶剂的条件下进行。所述有机溶剂选自于由正己烷、异己烷、丙酮所组成的组中的任一种或任意组合；优选地，所述有机溶剂为正己烷。所述正己烷的加入量应根据反应混合物中磷脂的含量确定。优选地，所述正己烷的加入量为：每100mg磷脂添加1ml正己烷。
本发明方法步骤(2)中油脂混合物的预热温度为30℃-90℃，优选45℃-65℃。所加入的蒸馏水的量需要精确控制，优选为步骤(3)中酶制剂加入量的0-6wt％、更优选为1.5-3.5wt％。
本发明方法的步骤(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量为步骤(1)中所述油脂混合物的5wt％-35wt％，优选10wt％-30wt％。反应温度控制在30℃-90℃，优选45℃-65℃。所述反应进行1-48小时，优选4-24小时。
在第二方面，本发明涉及根据第一方面所述的方法制得的PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂。优选地，本发明产品中PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂占全部n-3多不饱和脂肪酸磷脂的不低于80wt％、优选不低于90wt％，该参数由核磁共振磷谱分析测得。优选地，所述PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂中n-3多不饱和脂肪酸的接入率不低于20wt％、优选不低于25wt％。所述接入率为最终产物的磷脂中n-3多不饱和脂肪酸(例如DHA或EPA)占总脂肪酸的峰面积百分含量，由气相色谱分析测得。优选地，所述PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂中，磷脂型(即，磷酸甘油基含有两个脂肪酸残基)与溶血磷脂型(即，磷酸甘油基含有一个脂肪酸残基)的重量比为70:30至30:70、优选80:20至40:60，该参数由核磁共振磷谱分析测得。
附图说明
图1为利用色谱法对油脂标准样品中全部脂肪酸的组成进行分析的气象色谱图。
图2为本发明实施例1获得的油脂组合物1的气相色谱图。
图3为本发明实施例1获得的油脂组合物1的核磁共振磷谱图。
图4为根据本发明的比较例3，利用液态PLA1酶催化获得的油脂组合物c3的气相色谱图。
图5为根据本发明的比较例3，利用液态PLA1酶催化获得的油脂组合物c3的核磁共振磷谱图。
实施例
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。这些实施例仅仅是说明性的，而不应该理解为是对本发明的范围的限制。凡是基于本发明上述内容所实现的技术方案及其变形均落入本发明的范围内。
实施例和比较例中使用的磷脂购自Sigma-Aldrich公司(产品号1001900076)，该大豆磷脂中磷脂的含量为86wt％，其中磷脂酰胆碱(PC)的含量为55wt％。由于大豆磷脂中大部分成分是磷脂酰胆碱(PC)，在计算时仅考虑磷脂酰胆碱形式。实施例中使用的固定化的RM IM脂肪酶购自诺维信公司(产品号CHE-20)。比较例中使用的PLA1酶(液态)、TL IM酶(固定化)及SP435(固定化)均购自诺维信(中国)生物技术有限公司(产品号分别为LYN05060、LA331342、LC200266)。DHA酯类衍生物以及EPA酯类衍生物分别购自巴斯夫(中国)有限公司(浓缩DHA(乙酯型)、50382353)及无锡市迅达海洋生物制品有限公司(浓缩EPA(乙酯型、EPE150818)。其中，DHA或其酯类衍生物中DHA的含量为79.7wt％，EPA酯类衍生物中EPA的含量为76.2wt％。正己烷为分析纯，购自国药集团。
实施例和比较例中，按照国家标准GB 28404—2012所述的气相色谱方法，对各样品中脂肪酸的分布和含量进行分析，进而得出DHA或EPA接入率。所采用的气相色谱仪的型号为Agilent 1890B。
首先，利用色谱法对油脂标准样品(脂肪酸甲酯混标，37种C4-C24，购自sigma公司，产品编号：18919-1AMP)中全部脂肪酸的组成进行分析(图1)。通过与标准谱的比较，得出测试样品中各脂肪酸的分布及含量。下表1和表2示出根据色谱法测得的本发明的原料，DHA酯类衍生物、EPA酯类衍生物及大豆磷脂中各脂肪酸的含量。
表1大豆磷脂中各脂肪酸的含量(wt％)
Figure BDA0000881355330000112
表2 DHA酯类衍生物、EPA酯类衍生物中各脂肪酸的含量
Figure BDA0000881355330000111
Figure BDA0000881355330000121
本发明中接入率的计算方法为：从色谱图直接得出最终产物的磷脂中DHA或EPA占总脂肪酸的峰面积百分含量。
实施例和比较例中，磷脂型、1-溶血甘油基磷脂型、2-溶血甘油基磷脂型以及溶血磷脂型(即1-溶血甘油基磷脂型、2-溶血甘油基磷脂型之和)的n-3多不饱和脂肪酸均以卵磷脂形式计算。具体而言，由最终产物的核磁共振磷谱谱图中各自的峰面积，得出卵磷脂型(PCs)DHA或EPA、1-溶血甘油基卵磷脂型(1-Lyso-PC)DHA或EPA、2-溶血甘油基卵磷脂型(2-Lyso-PC)DHA或EPA以及溶血卵磷脂型(LPCs)DHA或EPA的相对百分含量，从而得出卵磷脂型与溶血卵磷脂型DHA(或EPA)的重量比(PCs/LPCs)以及1-溶血甘油基卵磷脂型与2-溶血甘油基卵磷脂型DHA(或EPA)的重量比(1-Lyso-PC:2-Lyso-PC)。
需要指出的是，本领域目前没有对接入至磷酸甘油基1位(即PLA1型)或2位(即PLA2型)的n-3多不饱和脂肪酸进行直接测定的方法。考虑到PLA1酶和PLA2酶分别催化磷酸甘油基1位和2位的酯化/水解可逆反应，终产物中1-溶血甘油磷脂和2-溶血甘油磷脂分别反映了生物酶制剂对PLA1接入和PLA2接入的n-3多不饱和脂肪酸的催化效率。因此，可通过终产物中1-溶血甘油基卵磷脂型与2-溶血甘油基卵磷脂型n-3多不饱和脂肪酸的重量比表征磷脂酶对1位和2位的选择性。该比值越高，表明对PLA1位的选择性越高，产物中接入至PLA1位的功能性磷脂的比例越高。
另一方面，PCs/LPCs表示酯化反应与水解反应的平衡。LPCs高表明平衡倾向于水解反应，获得的水解反应产物较多，这是不利的。应选择PCs/LPCs较高的反应条件。
所采用的核磁共振磷谱分析方法为：将最终产物按照100mg/ml的浓度溶于氘代氯仿及甲醇的混合溶液中(氘代氯仿:甲醇＝2:1)，之后将混合溶液置于核磁共振仪(Bruke400M Hz)上进行分析，参数为：频率：300MHz；扫描次数：128次；扫描温度：25℃。
实施例1-14：利用RM IM固定化酶催化DHA或EPA接入至PLA1位的反应
[油脂组合物1]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物1。
油脂组合物1的气相色谱图如图2所示，核磁共振磷谱图如图3所示。
[油脂组合物2]
(1)称取EPA酯类衍生物525mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物2。
[油脂组合物3]
(1)称取EPA酯类衍生物1050mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物3。
[油脂组合物4]
(1)称取EPA酯类衍生物2100mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物4。
[油脂组合物5]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，获得油脂混合物；该混合体系为无溶剂体系；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物5。
[油脂组合物6]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至30℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在30℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物6。
[油脂组合物7]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至90℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在90℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物7。
[油脂组合物8]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，不加入蒸馏水，直接将反应原料充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物8。
[油脂组合物9]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取18μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物9。
[油脂组合物10]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取3.6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶180mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物10。
[油脂组合物11]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取10.8μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶540mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物11。
[油脂组合物12]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应1小时，获得油脂组合物12。
[油脂组合物13]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应48小时，获得油脂组合物13。
[油脂组合物14]
(1)称取DHA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述DHA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物14。比较例1-3：利用其它酶催化剂催化EPA接入至PLA1位的反应
[油脂组合物c1]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取TL IM固定化酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物c1。
[油脂组合物c2]
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取SP435固定化酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物c2。
[油脂组合物c3]
首先，利用参考文献9所述的方法对液态PLA1酶进行固定。
(1)称取EPA酯类衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室温下的反应器中加入所述EPA酯类衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至52℃，精密量取6μl蒸馏水加入到反应原料中并充分混匀；
(3)精密称取PLA1固定化酶300mg，加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在52℃的温度下反应8小时，获得油脂组合物c3。
油脂组合物c3的气相色谱图如图4所示，核磁共振磷谱图如图5所示。
实施例和比较例获得的各油脂组合物的DHA或EPA接入率、PCs/LPCs以及1-Lyso-PC:2-Lyso-PC如表3所示。
表3
Figure BDA0000881355330000181

Claims (24)

1.一种制备PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在室温下，将n-3多不饱和脂肪酸或其酯类衍生物与大豆磷脂混合，获得油脂混合物；
(2)将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至30℃-90℃，加入蒸馏水并混合，所述蒸馏水的加入量为步骤(3)中酶制剂加入量的0-6wt％；
(3)将固定化的RM IM脂肪酶加入至步骤(2)获得的反应混合物中，在30℃-90℃的温度下进行反应，获得PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂；
其中，所述n-3多不饱和脂肪酸为DHA、EPA或二者的组合；并且
所述PLA1型n-3多不饱和脂肪酸磷脂占所获得的全部n-3多不饱和脂肪酸磷脂的不低于80wt％。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物中，DHA的含量不低于50wt％。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物中，DHA的含量不低于75wt％。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述EPA或其酯类衍生物中，EPA的含量不低于50wt％。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述EPA或其酯类衍生物中，EPA的含量不低于75wt％。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合；所述EPA或其酯类衍生物来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合。
7.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物选自于DHA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游离型DHA，或者上述DHA或其酯类衍生物的任意组合；所述EPA或其酯类衍生物选自于EPA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游离型EPA，或者上述EPA或其酯类衍生物的任意组合。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述DHA或其酯类衍生物为DHA乙酯型衍生物。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述EPA或其酯类衍生物为EPA乙酯型衍生物。
10.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述大豆磷脂中，磷脂的含量不低于75wt％。
11.如权利要求10所述的方法，其中，步骤(1)中，所述大豆磷脂中，磷脂的含量不低于85wt％。
12.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述n-3多不饱和脂肪酸甘油酯与所述大豆磷脂的重量比为(2-10):1。
13.如权利要求12所述的方法，其中，步骤(1)中，所述n-3多不饱和脂肪酸甘油酯与所述大豆磷脂的重量比为(3-4):1。
14.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合在无溶剂体系下进行。
15.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(1)中，所述混合在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自于由正己烷、异己烷、丙酮所组成的组中的任一种或任意组合。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述有机溶剂为正己烷。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述正己烷的加入量为：每100mg磷脂添加1ml正己烷。
18.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中，将步骤(1)获得的所述油脂混合物预热至45℃-65℃。
19.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中，所述蒸馏水的加入量为步骤(3)中酶制剂加入量的1.5-3.5wt％。
20.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量为步骤(1)中所述油脂混合物的5wt％-35wt％。
21.如权利要求20所述的方法，其中，步骤(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量为步骤(1)中所述油脂混合物的10wt％-30wt％。
22.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述反应温度为45℃-65℃。
23.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，所述反应进行1-48小时。
24.如权利要求23所述的方法，其中，步骤(3)中，所述反应进行4-24小时。
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