CN110564786B - 一种epa/dha型溶血磷脂组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EPA/DHA型溶血磷脂组合物及其制备方法，组合物中各组分含量：磷脂PC≤25％、溶血磷脂LPC≥65％、磷酸甘油胆碱GPC≤10％，其中，溶血磷脂LPC中EPA/DHA的含量大于60％。其步骤如下，以磷虾油中磷脂为原料，以磷脂酶A1为催化剂，催化磷脂发生醇解反应，待磷虾油中80％磷脂类物质发生醇解反应时，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，取下层磷脂混合物；以步骤一得到的磷脂混合物为原料，以固定化的偏甘油酯脂肪酶为催化剂，催化步骤一得到的磷脂混合物中的副产物GPC与EPA/DHA及其酯类衍生物发生反应，待反应结束，加入冷丙酮，静置或离心，取下层磷脂混合物，即得到以EPA/DHA型溶血磷脂为主的组合物。本发明提供的组合物含有丰富的EPA/DHA型溶血磷脂，具有重要的保健功能。

Description

一种EPA/DHA型溶血磷脂组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于利用生物催化制备脂类的领域，具体涉及以生物酶制剂作为催化剂，通过两步酶法，以磷虾油中磷脂和EPA/DHA及其酯类衍生物为原料，制备一种EPA/DHA型溶血磷脂组合物。
背景技术
自从20世纪70年代，科学家开始深入研究Omega-3脂肪酸的生理作用，结果表明，Omega-3脂肪酸具有抗血栓形成、降低血脂、促进心血管健康，现代科学研究证明，DHA为视网膜正常发育和神经系统正常功能的行使所必需。在大脑和视网膜中，DHA分别占该处脂肪酸总量的约20％及约35％，并主要以磷脂形式存在；DHA在哺乳动物和人类婴儿的大脑快速发育的过程中起到重要作用。在出生前生长和出生后早期生长的过程中，大量的DHA被沉积在发育的大脑和视网膜中，脑组织中DHA的积累在出生后早期生长的过程中持续处于高水平直到大约2岁；青少年时期，摄入DHA可以明显促进大脑内神经细胞的生长和树突的形成，因此有助于提高学习记忆能力。不仅如此，DHA还有利于预防老年痴呆的发生。研究表明，与健康老年人相比，老年痴呆患者大脑海马细胞的DHA含量降低近10％；给予DHA则有助于病症的减缓。DHA供给不足时，眼睛的感光能力及视力都会出现明显的下降。另一方面，EPA作为一种多不饱和脂肪酸化学信使，在免疫和炎症反应中起到重要作用。具体而言，EPA可通过调控血小板和血管壁处磷脂酰甘油(PG)的产生而发挥抗血栓作用；还通过竞争性抑制使得经由花生四烯酸路径合成的PGE2降低，从而减轻急性炎症反应。动物实验表明，EPA能够显著降低血甘油三酯水平。此外，DHA和EPA的共同给予对于儿童多动症的治疗、学龄儿童攻击性和暴力行为的控制和成年人抑郁症、焦虑症和惊恐症的改善方面均具有一定的效果。
EPA/DHA膳食来源主要有鱼、鱼油和海洋微藻藻油等，其结构多为乙酯型、甘油三酯型，现代研究发现，相比于乙酯型和甘油三酯型，磷脂型多不饱和脂肪酸更容易被人体吸收利用；随着科学研究的深入，发现了磷脂型EPA/DHA的消化转运途径，当EPA/DHA以溶血磷脂形式存在时，在转运蛋白Mfsd2a的转运下，可以通过血脑屏障到达大脑及视网膜等位置；而乙酯型及甘油三酯型无法通过血脑屏障到达大脑及视网膜等位置。
如参考文献1-7所示出的，本领域已经开发了多种方法，借助酯交换、酸解等反应将n-3多不饱和脂肪酸接入磷脂。
[参考文献1]孙兆敏等，酶法制备n-3多不饱和脂肪酸型磷脂的工艺，《中国油脂》。
[参考文献2]Xiang Li等，Production of Structured Phosphatidylcholinewith High Content of DHA/EPA by Immobilized Phospholipase A1-CatalyzedTransesterification，Int.J.Mol.Sci.。
[参考文献3]In-Hwan Kim等，Synthesis of Structured PhosphatidylcholineContaining n-3PUFA Residues via Acidolysis Mediated by ImmobilizedPhospholipase A1，J.Am.Oil.Chem.Soc.。
[参考文献4]In-Hwan Kim等，Phospholipase A1-catalyzed synthesis ofphospholipids enriched in n-3polyunsaturated fatty acid residues，Enzyme andMicrobial Technology。
[参考文献5]Hugo S.Garcia等，Enrichment of lecithin with n-3fatty acidsby acidolysis using immobilized phospholipase A1，GRASAS Y ACEITES。
[参考文献6]TingTing Zhao，Immobilized phospholipase A1-catalyzedmodification of phosphatidylcholine with n3polyunsaturated fatty acid，FoodChemistry。
[参考文献7]Lifeng Peng等，Production of structured phospholipids bylipase-catalyzed acidolysis:optimization using response surface methodology，Enzyme and Microbial Technology。
然而，上述文献报道都聚焦于制备EPA/DHA型磷脂，且均采用一步酶法，最终产物磷脂中，DHA和EPA的接入率实际较低，而天然磷虾油磷脂中EPA+DHA的含量大于35％，均无法超过或者说只能相近，此外，采用一步酶法，不可避免会发生水解等副反应，导致最终生成物中副产物GPC的含量较高，且均没有提供进一步有效充分利用副产物GPC或降低副产物的方法。考虑到此，本发明提供一种两步酶法制备一种EPA/DHA型溶血磷脂组合物及其方法，尤其是第二步，首次采用偏甘油酯脂肪酶，催化EPA/DHA及其脂类衍生物与第一步酶法产物中的GPC发生转酯化反应，由于偏甘油酯脂肪酶独特的底物特异性，不仅可以增加产物中EPA/DHA的含量，提高EPA/DHA型溶血磷脂的含量，还可以有效降低副产物GPC的含量，最终所得磷脂组合物中溶血磷脂的含量≥65％，磷酸甘油胆碱GPC≤10％，溶血磷脂中EPA+DHA的含量的≥60％。
偏甘油酯脂肪酶(Partial glycerides lipases)是一类区别于甘油三酯脂肪酶(triacylglycerol lipase)的一类脂肪酶，其仅能作用于甘油单酯(如MGLP)或甘油单酯和甘油二酯(如Lipase G、Lipase SMG1等)，而不能作用于甘油三酯和磷脂。其独特的底物特异性使偏甘油酯脂肪酶在油脂工业和磷脂改性中具有重要的应用价值，如制备高纯度甘油二酯、高纯度甘油三酯、高纯度磷脂等。偏甘油酯脂肪酶可分为甘油单酯脂肪酶(Monoacylglycerol lipase)和甘油单酯-甘油二酯脂肪酶(Mono-and diacylglycerollipase)两大类，目前还没有报道将偏甘油酯脂肪酶用于降低改性磷脂中磷酸甘油胆碱GPC含量的报道。
发明内容
本发明提供一种可通过两步酶法制备EPA/DHA型溶血磷脂的组合物。其第二步酶法反应中，创造性采用偏甘油酯脂肪酶，催化EPA/DHA及其脂类衍生物与第一步酶法产物中的GPC发生转酯化反应，在增加产物中EPA/DHA的含量，提高EPA/DHA型溶血磷脂的含量的同时，可有效降低副产物GPC的含量，使最终所得磷脂组合物中溶血磷脂的含量≥65％，磷酸甘油胆碱GPC≤10％，溶血磷脂中EPA+DHA的含量的≥55％。
本发明的EPA/DHA型溶血磷脂组合物的质量百分比组成如下：磷脂PC≤25％、溶血磷脂LPC≥65％、磷酸甘油胆碱GPC≤10％，其中，溶血磷脂LPC中EPA/DHA的含量≥60％。
所述溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为1-9。
所述组合物中EPA+DHA的含量为50-70％。
本发明的EPA/DHA型溶血磷脂组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将磷虾油中磷脂预热至40℃-70℃，所述磷虾油磷脂中磷脂酰胆碱含量不低于80wt％，溶血磷脂酰胆碱的含量不高于10wt％，其余为磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等，磷虾油磷脂中EPA+DHA的含量为35％-40％，添加5wt％-20wt％的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)将小分子一元醇分3-6次加入上述混合液中，所述小分子一元醇加入量为步骤(1)中磷虾油磷脂摩尔的1-3倍；
(3)在上述反应体系中添加反应介质，所述反应介质为非极性有机溶剂，所述反应介质的加入量为上述反应体系的3-5v/w；
(4)将磷脂酶A1加入上述混合液中，所述磷脂酶A1的加入量为步骤(1)中油脂混合物重量的1-20wt％；
(5)控制反应时间并适时取样检测，待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生醇解后即结束反应；
(6)待反应结束，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(7)在室温下，将磷脂混合物A与EPA/DHA及其脂类衍生物按1:1-3的重量比进行混合，得到油脂混合物B，其中，所述EPA/DHA及其脂类衍生物中EPA+DHA的含量不低于90wt％；
(8)将步骤(6)获得的所述油脂混合物B预热至20℃-40℃，加入固定化的偏甘油酯脂肪酶混合，所述固定化的偏甘油酯脂肪酶的加入量为步骤(7)中油脂混合物重量的0-30wt％；
(9)待反应结束，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物C，即得到EPA/DHA型溶血磷脂组合。
步骤(2)中，所述小分子一元醇为甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇，优选甲醇和乙醇，更优选为甲醇；
步骤(3)中，所述非极性有机溶剂为环己烷、正己烷、正庚烷等，优选正己烷和正庚烷，更优选为正己烷；
步骤(5)中，所述EPA/DHA及其脂类衍生物来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合，优选EPA/DHA甲酯和EPA/DHA乙酯，更优选为EPA/DHA乙酯；
步骤(7)-(9)中，所述混合在常压下或在真空下进行反应；优选地，所述混合在在真空下进行反应。
步骤(8)中，所述固定化偏甘油酯脂肪酶可选自于如下的一种或多种：LipaseG、Lipase SMG1和两者的突变体；优选地，所述固定化的偏甘油酯脂肪酶的加入量为所述油脂混合物B的0wt％-30wt％，优选10wt％-25wt％；优选地，所述反应温度为25℃-35℃；所述反应优选进行1-48小时，优选24-36小时。
本发明的技术效果：
本发明选取的固定化酶作为催化剂，反应温度温和，可以保护多不饱和脂肪酸发生氧化，固定化脂肪酶的使用，提高了反应的可重复性，可降低生产成本。
本发明采用两步酶法制备EPA/DHA型溶血磷脂，第二步使用固定化的偏甘油酯脂肪酶，我们发现，偏甘油酯脂肪酶可以催化磷酸甘油胆碱与脂肪酸发生酯化反应，在没有酰基转移的情况发生下，其催化GPC与游离脂肪酸酯化只生产LPC，将偏甘油酯脂肪酶应用于磷脂改性中降低副产物GPC中，从而达到降低副产物，提高目标产物的含量，且偏甘油酯脂肪酶可应用于任何生物酶催化如水解、酯交换等改性磷脂反应中副产物GPC降低的工艺中，应用范围广，效果优。
具体实施方式
尽管本发明的保护范围不受下列实施例的限制，然而，参考这些实施例将更详细的介绍本发明的实施。在所述实施例中，除特别说明外，所有百分比均以重量计。
实施例1
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.8mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 10mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4))待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(5)称取磷脂混合物A 50mg，EPA/DHA乙酯150mg，充分混合，获得油脂混合物B。
(6)将步骤(4)获得的所述油脂混合物B预热至30℃，加入固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase G 20mg并混合，在30℃的温度下反应24小时，待反应结束，加入冷丙酮，或离心，得下层磷脂混合物C，即得到组合物1；
组合物1中磷脂含量为23.1％,溶血磷脂含量65.5％，磷酸甘油胆碱含量为9.2％，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为61.3，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为8.47。
实施例2
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.8mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 10mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4)待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(5)称取磷脂混合物A 50mg，EPA/DHA乙酯100mg，充分混合，获得油脂混合物B。
(6)将步骤(4)获得的所述油脂混合物B预热至30℃，加入固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase G 15mg并混合，在30℃的温度下反应36小时，待反应结束，加入冷丙酮，或离心，得下层磷脂混合物C，即得到组合物2；
组合物2中磷脂含量为23.9％,溶血磷脂含量65.1％，磷酸甘油胆碱含量为9.7，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为60.1，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为8.29。
实施例3
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.8mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 20mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4)待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(5)称取磷脂混合物A 50mg，EPA/DHA乙酯150mg，充分混合，获得油脂混合物B。
(6)将步骤(4)获得的所述油脂混合物B预热至30℃，加入固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase G 40mg并混合，在30℃的温度下反应24小时，待反应结束，加入冷丙酮，或离心，得下层磷脂混合物C，即得到组合物3；
组合物3中磷脂含量为23.8％,溶血磷脂含量66.1％，磷酸甘油胆碱含量为8.6，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为61.8，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为8.63。
实施例4
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.2mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 20mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4)待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(5)称取磷脂混合物A50mg，EPA/DHA乙酯100mg，充分混合，获得油脂混合物B。
(6)将步骤(4)获得的所述油脂混合物B预热至30℃，加入固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase G 15mg并混合，在30℃的温度下反应36小时，待反应结束，加入冷丙酮，或离心，得下层磷脂混合物C，即得到组合物4；
组合物4中磷脂含量为23.1％,溶血磷脂含量65.3％，磷酸甘油胆碱含量为9.9，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为60.4，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为8.27。
实施例5
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.2mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.2mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 20mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4)待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(5)称取磷脂混合物A 50mg，EPA/DHA乙酯150mg，充分混合，获得油脂混合物B。
(6)将步骤(4)获得的所述油脂混合物B预热至30℃，加入固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase G 30mg并混合，在30℃的温度下反应24小时，待反应结束，加入冷丙酮，或离心，得下层磷脂混合物C，即得到组合物5；
组合物5中磷脂含量为22.9％,溶血磷脂含量65.9％，磷酸甘油胆碱含量为9.3，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为60.7，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为8.32。
对比实施例1
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mLg的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.2mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 20mg加入上述混合液中，并开始反应；
(3))待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A，即得到组合物6；
组合物5中磷脂含量为19.4％,溶血磷脂含量48.87％，磷酸甘油胆碱含量为29.7，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为43.9，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为7.23。
对比实施例2
(1)称取磷虾油磷脂1.0g，并预热至50℃，添加0.1mL的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)加入1.8mL的乙醇(分多次加入)和3mL的正己烷；
(3)将磷脂酶A1 10mg加入上述混合液中，并开始反应；
(4))待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生水解，结束反应，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A，即得到组合物7；
组合物7中磷脂含量为19.7％,溶血磷脂含量48.54％，磷酸甘油胆碱含量为29.13，其中溶血磷脂中EPA+DHA的含量为42.73，溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为7.16。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：
所述的EPA/DHA型溶血磷脂组合物的质量百分比组成如下：磷脂PC≤25％、溶血磷脂LPC≥65％、磷酸甘油胆碱GPC≤10％，其中，溶血磷脂LPC中EPA/DHA的含量≥60％；
所述方法包括如下步骤：
(1)将磷虾油中磷脂预热至40℃-70℃，所述磷虾油磷脂中磷脂酰胆碱含量不低于80wt％，溶血磷脂酰胆碱的含量不高于10wt％，其余为磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，磷虾油磷脂中EPA+DHA的含量为35％-40％，添加5wt％-20wt％的pH为5.0的Tris-HCL缓冲液；
(2)将乙醇分3-6次加入上述混合液中，所述乙醇加入量为步骤(1)中磷虾油磷脂摩尔的1-3倍；
(3)在上述反应体系中添加反应介质，所述反应介质为正己烷，所述反应介质的加入量为上述反应体系的3-5v/w；
(4)将磷脂酶A1加入上述混合液中，所述磷脂酶A1的加入量为步骤(1)中油脂混合物重量的1-20wt％；
(5)控制反应时间并适时取样检测，待磷虾油磷脂中至少80％磷脂类物质发生醇解后即结束反应；
(6)待反应结束，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物A；
(7)在室温下，将磷脂混合物A与EPA/DHA乙酯按1:1-3的重量比进行混合，得到油脂混合物B，其中，所述EPA/DHA乙酯中EPA+DHA的含量不低于90wt％；
(8)将步骤(7)获得的所述油脂混合物B预热至20℃-40℃，加入固定化的偏甘油酯脂肪酶混合，所述固定化的偏甘油酯脂肪酶的加入量为步骤(7)中油脂混合物重量的0-30wt％；所述固定化的偏甘油酯脂肪酶为Lipase G；
(9)待反应结束，加入冷丙酮，静置或离心，得下层磷脂混合物C，即得到EPA/DHA型溶血磷脂组合。
2.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：所述溶血磷脂LPC中2位溶血磷脂(2-LPC)与1位溶血磷脂(1-LPC)的比为1-9。
3.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：所述组合物中EPA+DHA的含量为50-70％。
4.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：步骤(7)中，所述EPA/DHA乙酯来自于鱼油、海藻油、微生物油脂中的任一种，或上述油脂的任意组合。
5.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：步骤(7)-(9)中，混合在常压下或在真空下进行反应。
6.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：所述固定化的偏甘油酯脂肪酶的加入量为所述油脂混合物B的1wt％-30wt％，反应温度为25℃-35℃；反应时间1-48小时。
7.如权利要求1所述的制备EPA/DHA型溶血磷脂组合物的方法，其特征在于：步骤(8)中，所述固定化的偏甘油酯脂肪酶的加入量为所述油脂混合物B的10wt％-25wt％；反应时间24-36小时。
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