PL239133B1 - Sposób enzymatycznego wzbogacania lecytyny w izomer sprzężonego kwasu linolowego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób, który polega na tym, że do cząsteczek fosfatydylocholiny, w procesie enzymatycznej acydolizy katalizowanej immobilizowaną lipazą z Mucor miehei, wbudowuje się czysty izomer t10,c12 sprzężonego kwasu linolowego, a reakcję przeprowadza się w rozpuszczalniku niepolarnym, przy ciągłym mieszaniu, w kontrolowanej aktywności wody.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycznego wzbogacania lecytyny, zwłaszcza pochodzącej z żółtek jaj kurzych, w izomer sprzężonego kwasu linolowego.

Produkt będący przedmiotem wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym, kosmetycznym oraz w przemyśle farmaceutycznym w szczególności jako składnik leków i suplementów diety.

Naturalny sprzężony kwas linolowy (CLA) jako mieszanina izomerów pozycyjnych i geometrycznych występuje głównie w produktach pochodzących od zwierząt poligastrycznych: bydła, owiec i kóz (J. Pritsche i inni, Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A, 1998, 206(2), 77-82). Najbardziej rozpowszechnionym w naturze izomerem jest c9, 111 CLA, który stanowi 80-90% wszystkich izomerów CLA obecnych w mleku i produktach mlecznych (S. F. Chin i inni, Journal of Food Composition and Analysis, 1992,5(3), 185-197). W literaturze opisano wiele biologicznych właściwości CLA. Między innymi badano działanie przeciwnowotworowe izomerów CLA w stosunku do linii ludzkich komórek nowotworowych oraz w eksperymentach na gryzoniach (C. Degen i inni, Challenges and Chances. Toxicology in Vi1ro, 2012, 26(6), 985-992; C. Ip i inni, The Journal of Nutrition, 1999, 129(12), 2135-2142; C. Ip i inni, Cancer research, 1994, 54(5), 1212-1215). Ponadto stwierdzono, że CLA zmniejsza ryzyko miażdżycy (D. Kritchevsky i inni, Lipids, 2004, 39(7), 611.12; K. Chinnadurai i inni, Lipids in Health and Disease, 2013, 12(1), 121) oraz stymuluje układ odpornościowy (M. G. Hayek i inni, The Journal of nutrition, 1999, 129(1), 32-38). Ponadto zaobserwowano, że poszczególne izomery CLA mogą posiadać różną aktywność, działać synergistycznie lub nawet znosić wzajemnie swoje działanie. Na przykład izomer c9,M1 zwiększa przyrost masy mięśniowej w ciele, podczas gdy izomer f10,c12 powoduje zmniejszenie zawartości tkanki tłuszczowej w organizmie (M. W. Pariza i inni, Progress in Lipid Research, 2001,40(4), 283-298.). Jedne z nowszych badań potwierdziły również prozdrowotne działanie CLA na organizm ludzki, które można osiągnąć poprzez supiementację diety w sprzężony kwas linolowy (T. A. McCrorie i inni, Nutrition Research Reviews, 2011, 24(2), 206-227; A. Dilzer, i Y. Park; Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(6), 488-513). Liczne suplementy diety wytwarzane przemysłowo zawierają głównie mieszaninę izomerów c9,M1 i f10,c12 CLA w formie wolnych kwasów tłuszczowych lub ich estrów (etylowych lub triacylogliceroli). Nie są natomiast dostępne w handlu preparaty zawierające fosfolipidy (PL) jako nośniki izomerów CLA. Sprzężony kwas linolowy połączony estrowo z cząsteczką glicerofosfocholiny posiada tą przewagę nad preparatami na bazie wolnych kwasów tłuszczowych, że może być dostarczony do organizmu bardziej efektywnie ze względu na lepsze wchłanianie z przewodu pokarmowego dzięki właściwościom emulgującym fosfolipidu (V. P. Carnielli i inni, The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 67(1), 97-103).

Glicerofosfolipidy są naturalnie występującymi związkami, stanowiącymi podstawowy składnik błon komórkowych komórek eukariotycznych. Dzięki występowaniu w ich strukturze fragmentu hydrofobowego, który tworzą reszty kwasów tłuszczowych oraz fragmentu hydrofilowego złożonego z grupy fosforanowej, cząsteczki fosfolipidów zdolne są do tworzenia dwuwarstw oraz struktur micelarnych. Głównym naturalnym źródłem fosfolipidów, w tym fosfatydylocholiny, są nasiona rzepaku, słonecznika, ziarna soi, a także tkanki zwierzęce, w tym żółtko jaja czy mózg bydlęcy. W przypadku pozyskiwania fosfolipidów jako surowca dla przemysłu spożywczego, farmaceutycznego i kosmetycznego, największe znaczenie mają soja oraz żółtko jaja kurzego (P. Van Hoogevest i A. Wendel, European Journal of Lipid Science and Technology, 2014,116, 1088-1107). Jednakże, żadna lecytyna pozyskiwana z tych źródeł nie zawiera sprzężonego kwasu linolowego (L. E. Palacios i T. Wang, Journal of American Oil Chemists Society, 2005, 82, 571-578).

Dlatego też, korzystną ze względów zdrowotnych, byłaby taka modyfikacja fosfatydylocholiny, która zapewniłaby zachowanie NNKT, znajdujących się głównie w pozycji sn-2 oraz pozwoliłaby wprowadzić działający prozdrowotnie izomer sprzężonego kwasu linolowego w pozycję sn -1, jedynie kosztem nasyconych kwasów tłuszczowych. Te szczególne fosfolipidowe związki wzbogacone w aktywne biologicznie kwasy tłuszczowe, takie jak CLA, określane są terminem „super lecytyn (T. H. Trziszka i inni, Journal of Life Sciences, 2013, 7(8), 862-877).

Do tej pory znane są nieliczne metody enzymatycznego otrzymywania modyfikowanej sprzężonym kwasem linolowym lecytyny w reakcjach enzymatycznych z zastosowaniem lipaz i fosfolipaz.

Większość z opisanych metod opierała się na wymianie reszt acylowych w reakcji acydolizy pomiędzy fosfatydylocholiną sojową, a równomolową mieszaniną izomerów c 9, f11 i t10, c12 CLA lub oleju

PL 239 133 B1 bogatego w te izomery. Jedna z publikacji opisuje modyfikację PC poprzez transestryfikację, gdzie donorem grupy acylowęj są estry etylowe mieszaniny izomerów CLA. W metodzie tej otrzymano produkt o zawartości CLA równej 31,3% (L. P. Liu i inni, Science and Technology of Food Industry, 2011, 7, 042). Przekształcenia fosfatydylocholiny zwykle są przeprowadzane przy użyciu dostępnych komercyjnie immobilizowanych lipaz, takich jak Lipozyme® RM IM (L. P. Liu i inni, Science and Technology of Food Industry, 2011, 7, 042; M. E. Hossen i E. Hernandez, Journal of Lipid Science and Technology, 2005, 107(10), 730-736.), Novozyme® 435 i Lipozyme® TL IM (L. Peng i inni, Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(4), 523-532).

Fosfolipazy Ai i A2 dostępne są komercyjnie w postaci roztworów i wymagają immobilizacji przed ich użyciem w roli katalizatora (R. J. Baeza-Jimenez i inni, Grasas y Aceites, 2012, 63(1), 44-52; A. F. Vikbjerg i inni, Journal of Biotechnology, 2007, 128(3), 545-554). Duża większość opisanych reakcji modyfikacji PC sprzężonym kwasem linolowym została przeprowadzona bez użycia rozpuszczalników organicznych oraz stosując nadmiar molowy CLA, stanowiący od 3 do 5. W innej znanej metodzie modyfikacji PC w pozycji sn-2, wykorzystano liofilizowany preparat Lecitase® 10L, czyli PLA2 z trzustki wieprzowej. W wyniku estryfikacji w glicerolu 2-lizofosfatydylocholiny pochodzenia kurzego, stosując niski nadmiar CLA, otrzymano fosfatydylocholinę z 65%-ową wydajnością. W opisanej metodzie zastosowano kontrolę aktywności wody na niskim poziomie, zapewniając jednocześnie zdolności katalityczne enzymu poprzez dodatek formamidu jako związku „naśladującego” wodę. Ograniczono również negatywne działanie tworzącej się w wyniku estryfikacji wody, poprzez dodanie albuminy wołowej o higroskopijnych właściwościach. Sposób modyfikacji fosfatydylocholiny opisany powyżej posiada jednak pewne wady wynikające z trudności w izolowaniu produktu oraz niemożności ponownego wykorzystania enzymu, a co za tym idzie, reakcja ta jest trudna w przystosowaniu do procesu ciągłego, tak pożądanego w przemyśle.

Mając na uwadze wartość funkcjonalną modyfikowanej lecytyny, korzystniejszą jest wymiana reszt acylowych w pozycji sn -1, zachowując przy tym wszystkie nienasycone kwasy tłuszczowe znajdujące się naturalnie pozycji sn-2 PC. Można to uzyskać stosując reakcję acydolizy, która ogranicza ryzyko migracji reszt acylowych, powszechne podczas przeprowadzania dwuetapowej modyfikacji złożonej z etapu hydrolizy i ponownej estryfikacji i wiążącego się z tym procesu oczyszczania produktu pośredniego jakim jest 1 -LPC. W metodzie modyfikacji PC w pozycji sn -1 immobilizowaną na żywicy anionowej fosfolipazą PLA1 bez wykorzystania rozpuszczalnika organicznego, uzyskano wbudowanie CLA na poziomie 85-90% (R. J. Baeza-Jimenez i inni, Grasas y Aceites, 2012, 63(1), 44-52).

Większość opublikowanych enzymatycznych metod wprowadzania CLA do cząsteczki fosfatydylocholiny skupia się na uzyskaniu bardzo wysokiego stopnia wbudowania CLA i przywiązuje mniejszą uwagę do wydajności produktów modyfikacji. Na przykład wbudowanie CLA w pozycję sn -1 powyżej 85% jest osiągane przy stosunkowo małej wydajności fosfolipidów, osiągającej około 12%. Uzyskane wbudowanie CLA w odniesieniu do początkowej ilości wykorzystanej w reakcji PC, osiąga wydajność wbudowania na poziomie jedynie 10% (R. Baeza-Jimenez i inni, European Journal of Lipid Science and Technology, 2012, 114(11): 1261-1267). W innej metodzie otrzymano 30%-owe wbudowanie w fosfatydylocholinę i wydajność na poziomie 21%, co w stosunku do początkowej ilości PC wykorzystanej w acydolizie, daje jedynie 6%-owe wbudowanie sprzężonego kwasu linolowego (A. F. Vikbjerg i inni, Journal of Biotechnology, 2007, 128(3), 545-554).

Do tej pory nie jest znana metoda otrzymywania wzbogaconej lecytyny w pozycji sn -1 w czysty izomerycznie f10, c 12 CLA na drodze enzymatycznej acydolizy lipazą sn -1,3-specyficzną.

Celem wynalazku było opracowanie wydajnej metody wzbogacania naturalnej lecytyny w izomer f10, c 12 w jednoetapowym procesie enzymatycznej acydolizy.

Istotą sposobu według wynalazku jest to, że do cząsteczek fosfatydylocholiny wbudowuje się w procesie enzymatycznej acydolizy katalizowanej immobilizowaną lipazą z Mucor miehei czysty izomer f10, c 12 sprzężonego kwasu linolowego, a reakcję przeprowadza się w rozpuszczalniku niepolarnym, w czasie od 24 do 60 godzin w temperaturze od 35 do 55°C przy ciągłym mieszaniu, w kontrolowanej aktywności wody w zakresie od 0,33 do 0,11. Substraty oraz enzym użyte do reakcji inkubuje się przed rozpoczęciem acydolizy w tej aktywności wody przez czas od 24h do 72h, przy czym stosunek fosfatydylocholiny do 110,c12 CLA wynosi od 1:5 do 1:12, natomiast ilość enzymu stanowi od 15 do 40% wag. sumy substratów (PC + CLA). Następnie mieszaninę poreakcyjną oddziela się od enzymu po przez filtrację, a produkt reakcji będący mieszaniną modyfikowanej fosfatydylocholiny i lizofosfatydylocholiny oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej.

PL 239 133 B1

Korzystnie jest gdy w reakcji acydolizy stosuje się izomer 110, c 12 sprzężonego kwasu linolowego o czystości powyżej 90%.

Korzystnie jest gdy acydolizę przeprowadza się w heptanie lub heksanie.

Korzystnie jest gdy ilość użytego rozpuszczalnika stanowi od 8 do 16-krotnego nadmiaru objętościowego w stosunku do masy użytej fosfatydylocholiny.

Korzystnie również jest, gdy acydolizę przeprowadza się w obecności związku naśladującego wodę, zwłaszcza dimetyloformamidu.

Korzystnie jest gdy reakcję prowadzi się przez czas 48h.

Korzystnie jest gdy reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C.

Korzystnie jest gdy do przeprowadzenia reakcji stosuje się mieszanie magnetyczne w zakresie 250-350 rpm.

Korzystnie jest gdy inkubację substratów przed reakcją i reakcję acydolizy prowadzi się w kontrolowanej aktywności wody równej 0,11.

Korzystnie jest gdy stosunek fosfatydylocholiny do CLA wynosi od 1:5 do 1:7.

Korzystnie jest gdy ilość lipazy stanowi od 20% wag. sumy substratów (PC i CLA).

Zaleta wynalazku jest to, że postępując zgodnie ze sposobem wykonania modyfikacji fosfatydylocholiny otrzymuje się lecytynę, w której obecny jest tylko jeden z aktywnych izomerów CLA (f10, c 12), a produkt charakteryzuje się wysokim stopniem wbudowania (Ecla = 53%) oraz wysoką wydajnością molową PC i LPC w stosunku do substratu, wynoszącą 60%. Dodatkową zaletą wynalazku jest zastosowanie jednoetapowego proces modyfikacji lecytyny oraz to, że immobilizowany enzym oraz frakcję kwasów tłuszczowych otrzymaną po rozdziale produktów acydolizy można wykorzystać powtórnie jako donor reszt acylowych izomeru f10,c12 CLA. Lecytyna wzbogacona w izomer f10, c 12 CLA może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym jako emulgator pełniący dodatkową funkcję nutraceutyczną, w przemyśle kosmetycznym oraz w przemyśle farmaceutycznym, w szczególności jako składnik leków i suplementów diety właściwościach przeciwnowotworowych oraz wspomagających odchudzanie.

Sposób według wynalazku jest bliżej objaśniony w przykładzie wykonania oraz na rysunkach (fig. 1 i fig. 2).

Na fig. 1 ukazano zależność stopnia efektywnego wbudowania izomeru f10, c 12 CLA do cząsteczki fosfatydylocholiny od czasu trwania reakcji acydolizy fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego, opisanej w przykładzie wykonania. Stopień efektywnego wbudowania izomeru CLA rozumiany jest jako ilość moli CLA wbudowanych do cząsteczek fosfolipidów w stosunku do początkowej ilości fosfatydylocholiny użytej do enzymatycznej acydolizy jest opisany wzorem:

lCA = (ilość moli CLA w PC + ilość moli CLA w LPC) / (ilość moli PC wzięta do reakcji) x 100%.

Na fig. 2 przedstawiono zawartość fosfatydylocholiny i lizofosfatydylocholiny w mieszaninie reakcyjnej w zależności od czasu trwania acydolizy w warunkach opisanych przykładem wykonania. Skład procentowy fosfolipidów w mieszaninie reakcyjnej został obliczony na podstawie wzorów:

%PC = (ilość moli PC po określonym czasie trwania reakcji) / (ilość moli PC wzięta do reakcji) x 100%;

%LPC = (ilość moli LPC po określonym czasie trwania reakcji) / (ilość moli PC wzięta do reakcji) x 100%

P r z y k ł a d

W szklanej fiolce naważa się 100 mg PC z żółtka jaja kurzego (0,129 mmol) i 218 mg t10,c 12 CLA (0,774 mmol), o składzie: f10, c 12 - 96,5%; c 9,f11 - 2,8%; inne izomery - 0,7% otrzymanego wg metody (N. Niezgoda i inni, Przemysł Chemiczny, 2011,90, 949-957). Stanowi to 6-krotny nadmiar CLA w stosunku do fosfatydylocholiny. Reagenty rozpuszcza się w 1200 μL heptanu oraz dodaje się 80 μL dimetyloformamidu, jako związku naśladującego wodę, zwiększającego wydajność reakcji acydolizy, co stanowi 5% całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej. W osobnej fiolce naważa się immobilizowaną na żywicy jonowymiennej lipazę z Mucor miehei (Lipozyme®) w ilości 63 mg, co stanowi 20% wag. sumy substratów (PC + CLA). Otwarte fiolki z reagentami i enzymem inkubuje się w szczelnej komorze o stałej aktywności wody a «=0,11 przez okres 48h, w celu ustabilizowania rzeczonej aktywności wody w mieszaninie reagentów oraz w katalizatorze enzymatycznym. Określona aktywność wody jest zapewniona dzięki obecności w komorze nasyconego roztworu chlorku litu. Po ustabilizowaniu się aw, fiolki zamyka się i stabilizuje w temperaturze 45°C przez 30 minut. Po tym czasie do reagentów przenosi się enzym i prowadzi się reakcję na mieszadle magnetycznym w temperaturze równej 45°C, przy intensyw

PL 239 133 B1 ności mieszania 300 rpm. Reakcję acydolizy prowadzi się przez 48h, uzyskując mieszaninę lizofosfatydylocholiny i fosfatydylocholiny wzbogaconej w izomer f10,c12 CLA. Mieszaninę poreakcyjną przesącza się następnie przez krótką kolumnę wypełnioną ziemią okrzemkową (Celite®), przemywając, kolumnę mieszaniną chloroform:metanol 2:1 (v/v). Przesącz odparowuje się na. wyparce rotacyjnej w temperaturze 40°C, a następnie uzyskaną mieszaninę rozdziela się na kolumnie chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym (60A, 230-400 mesh). Rozdział CLA od fosfolipidów (PC i LPC) przeprowadza się stosując eluent chloroform:metanol:woda o składzie 65:25:4 (v/v) zbierając frakcję z fosfolipidami, a następnie odparowuje się je na wyparce rotacyjnej w temperaturze 40°C. W wyniku rozdziału uzyskuje się lecytynę wzbogaconą w izomer f10, c12 CLA o składzie 38% fosfatydylocholiny i 22% lizofosfatydylocholiny. Stopień efektywnego wbudowania izomeru CLA (Ecla) otrzymanej lecytyny wynosi 53%.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób enzymatycznego wzbogacania lecytyny, zwłaszcza z żółtek jaj kurzych znamienny tym, że do cząsteczek fosfatydylocholiny, w procesie enzymatycznej acydolizy katalizowanej immobilizowaną lipazą z Mucor miehei, wbudowuje się czysty izomer f10, c12 sprzężonego kwasu linolowego, a reakcję przeprowadza się w rozpuszczalniku niepolarnym, w czasie od 24 do 60 godzin w temperaturze od 35 do 55°C, przy ciągłym mieszaniu, w kontrolowanej aktywności wody w zakresie od 0,33 do 0,11, przy czym substraty oraz enzym użyte do reakcji inkubuje się przed rozpoczęciem acydolizy w tej aktywności wody przez czas od 24h do 72h, natomiast stosunek fosfatydylocholiny do f10,c12 CLA wynosi od 1:5 do 1:12, zaś ilość enzymu stanowi od 15 do 40% wag, sumy substratów (PC + CLA), następnie mieszaninę poreakcyjną oddziela się od enzymu poprzez filtrację, a produkt reakcji będący mieszaniną modyfikowanej fosfatydylocholiny i lizofosfatydylocholiny oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej od nieprzereagowanego izomeru CLA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w reakcji acydolizy stosuje się izomer f10, c 12 sprzężonego kwasu linolowego o czystości powyżej 90%.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acydolizę przeprowadza się w heptanie lub heksanie.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ilość użytego rozpuszczalnika stanowi od 8 do 16-krotnego nadmiaru objętościowego w stosunku do masy użytej fosfatydylocholiny.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acydolizę przeprowadza się w obecności związku naśladującego wodę, zwłaszcza dimetyloformamidu.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję prowadzi się przez czas 48h.
7. 7. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przeprowadzenia reakcji stosuje się mieszanie magnetyczne w zakresie 250-350 rpm.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubację substratów przed reakcją i reakcję acydolizy prowadzi się w kontrolowanej aktywności wody równej 0,11.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek fosfatydylocholiny do f10,c12 CLA wynosi od 1:5 do 1:7.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość lipazy stanowi od 20% wag. sumy substratów (PC i CLA).