CN111996221B - 一种酶法制备sn2-LPC的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶法制备sn2‑LPC的方法，属于油脂加工技术领域。采用固定化脂肪酶在乙醇过量和较低反应温度下催化卵磷脂醇解制备sn2‑LPC，由于固定化脂肪酶在乙醇过量的条件下对卵磷脂具有极强的sn‑1位特异性和极高的反应活性，从而大大提高了sn2‑LPC的生成速率；且反应在25～40℃的较低温度下进行，可有效避免sn2‑LPC和sn1‑LPC间的酰基转移，且可保证所用脂肪酶具有较高的操作稳定性，最终产物中副产物少，sn2‑LPC的含量高。该方法操作简单，反应温度低，时间短，产物中sn2‑LPC含量高，具有良好的经济效益和工业应用前景。

Description

一种酶法制备sn2-LPC的方法
技术领域
本发明属于油脂加工技术领域，具体涉及一种酶法制备sn2-LPC的方法。
背景技术
溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine,LPC)是卵磷脂裂解去掉一个脂肪酸酰基后的产物，其在一定程度上改变了由于HLB(亲水疏水平衡值)值偏低而使普通磷脂应用范围受限的状况，较普通磷脂具有更好的水分散性，因而具有良好的乳化性及乳化稳定性。LPC也具有广泛的生物学效应，其被认为是与心血管和神经退行性疾病呈正相关的关键因子，对动脉粥样硬化、肝脏疾病等的诊断和治疗具有非常重要的作用；此外，sn2-LPC是DHA穿过血脑屏障的优选载体，在提高脑DHA含量，改善脑功能方面具有重大作用。近年来，sn2-LPC因其独特的生理功能而被广泛关注，制备sn2-LPC也成为了当前的研究热点。
酶法水解、醇解和酯化是制备sn2-LPC的常用手段，磷脂酶和脂肪酶是用于催化的常用酶类。磷脂酶A1和具有sn-1(3)位特异性的脂肪酶均可特异性作用于卵磷脂的sn-1位酯键，催化得到sn2-LPC。水解法制备sn2-LPC的反应体系简单，反应时间短，但反应温度较高，产物为sn1-LPC和sn2-LPC的混合物，且含量低。在磷脂酶A1催化水解大豆磷脂制备LPC的研究中，在优化的反应条件下(加水量20％，加酶量12U/g，反应温度65℃，反应时间80min)，产物中LPC的含量仅为9.87％(轻工科技,2017,33(07):13-15)；醇解法制备sn2-LPC反应效果要优于水解法，底物磷脂酰胆碱的转化率可达90％以上，但由于反应过程中酰基转移的存在，导致最终产物为sn1-LPC和sn2-LPC的混合物，且二者含量通常在65％以下(王梦华，河南工业大学,2012)；酶法酯化可合成富含多不饱和脂肪酸的LPC，且产物中LPC的含量最高可达89.1mol％，但酯化反应过程中更易于生成sn1-LPC，产物中sn2-LPC含量通常低于15mol％(Eur.J.Lipid Sci.Technol.,2018,120:170059)。总之，目前酶法水解、醇解和酯化制备sn2-LPC时，产物中sn2-LPC的含量均普遍偏低。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种酶法制备sn2-LPC的方法，该方法反应条件简单、时间短，产物中的sn2-LPC含量高。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种酶法制备sn2-LPC的方法，包括以下步骤：
步骤1：在过量无水乙醇存在的条件下采用固定化脂肪酶催化卵磷脂于25～40℃下进行醇解反应；
步骤2：反应结束后，分离得到sn2-LPC。
优选地，步骤1的具体步骤为：将卵磷脂和无水乙醇在反应容器中混合均匀后，加热至25～40℃后连接回流装置，加入固定化脂肪酶后，在搅拌状态下进行醇解反应。
进一步优选地，卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40～100。
进一步优选地，卵磷脂中磷脂酰胆碱的质量分数＞90％。
进一步优选地，固定化脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme 435。
进一步优选地，固定化脂肪酶的添加量为底物总质量的6％～15％。
进一步优选地，搅拌的转速为250～500rpm。
进一步优选地，醇解反应的时间为1～3h。
优选地，分离采用丙酮沉淀法，具体操作为：除去反应产物中的固定化脂肪酶和乙醇后加入3倍体积得冷丙酮，离心5min后分离出沉淀，采用冷丙酮洗涤沉淀3次后，氮气吹干即得sn2-LPC。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的酶法制备sn2-LPC的方法，采用固定化脂肪酶在乙醇过量和较低反应温度下催化卵磷脂醇解制备sn2-LPC，由于固定化脂肪酶在乙醇过量的条件下对卵磷脂具有极强的sn-1位特异性和极高的反应活性，从而大大提高了sn2-LPC的生成速率；且反应在25～40℃的较低温度下进行，不仅可有效避免sn2-LPC和sn1-LPC间的酰基转移，而且可保证所用脂肪酶具有较高的操作稳定性，最终产物中副产物少，sn2-LPC的含量高达90％以上。该方法操作简单，反应温度低，时间短，产物中sn2-LPC含量高，具有良好的经济效益和工业应用前景。
进一步地，醇解反应的容器连接回流装置，可有效避免反应过程中由于乙醇挥发而造成的反应速率降低和产物生成量减少。
更进一步地，卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40～100，无水乙醇远过量，可保证所用脂肪酶具有较强的sn-1位特异性，促进sn2-LPC的生成，且可保证所用脂肪酶具有较高的操作稳定性。
进一步地，卵磷脂中磷脂酰胆碱的质量分数＞90％，可确保产物中sn-2LPC含量较高。
进一步地，固定化脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme 435，且其用量为为底物总质量的6％～15％，可保证所用脂肪酶在过量乙醇存在情况下具有较强的sn-1位特异性和酶活性，且可保证反应的经济性。
进一步地，醇解反应时搅拌的转速为250～500rpm，不仅可保证较高的反应速率，而且可较好的保证所用固定化酶的颗粒完整性。
进一步地，醇解反应的时间为1～3h，不仅可保证产物中sn-2LPC含量较高，而且可保证所用脂肪酶具有较高的操作稳定性。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。如非写明，所有百分比均为质量百分比。
实施例1
称取100g大豆卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500mL圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入10g Novozym 435，在转速为250rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应2h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为91.03％。
实施例2
称取100g蛋黄卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500mL圆底烧瓶中(蛋黄卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40)，搅拌使之混合均匀，加热至25℃后连接回流装置。再向其中加入15g Lipozyme 435，在转速为400rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应3h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为92.19％。
实施例3
称取100g大豆卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500mL圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:100)，搅拌使之混合均匀，加热至40℃后连接回流装置。再向其中加入12g Lipozyme 435，在转速为500rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应1h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为90.88％。
实施例4
称取100g蛋黄卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500mL圆底烧瓶中(蛋黄卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入6g Novozym 435，在转速为500rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应3h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为91.63％。
实施例5
称取100g磷虾卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500mL圆底烧瓶中(磷虾卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:80)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入10g Novozym 435，在转速为350rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应2h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为92.00％。
对比例1
称取100g蛋黄卵磷脂、无水乙醇和正己烷的混合物置于500mL圆底烧瓶中(蛋黄卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:2，蛋黄卵磷脂和正己烷的比值为1:5，m/v)，搅拌使之混合均匀，加热至65℃后连接回流装置。再向其中加入15g Lipozyme 435，在转速为400rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应3h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为22.15％。和实施例2相比，本对比例在溶剂体系下进行醇解反应，底物摩尔比低，反应温度高，最终反应产物中sn2-LPC的含量仅为22.15％，远低于实施例2反应产物中sn2-LPC的含量。
对比例2
称取100g磷虾卵磷脂、无水乙醇和正己烷的混合物置于500mL圆底烧瓶中(磷虾卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:2，磷虾卵磷脂和正己烷的比值为1:5，m/v)，搅拌使之混合均匀，加热至65℃后连接回流装置。再向其中加入10g Novozym 435，在转速为350rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应2h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，最后用丙酮沉淀法分离得到sn2-LPC，经测定产物中sn2-LPC的含量为16.33％。和实施例5相比，本对比例在溶剂体系下进行醇解反应，底物摩尔比低，反应温度高，最终反应产物中sn2-LPC的含量仅为16.33％，远低于实施例2反应产物中sn2-LPC的含量。

Claims (3)

1.一种酶法制备sn2-LPC的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将卵磷脂和无水乙醇在反应容器中混合均匀后，加热至25~40℃后连接回流装置，加入固定化脂肪酶后，在搅拌状态下进行醇解反应；卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40~100；固定化脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme 435；卵磷脂中磷脂酰胆碱的质量分数＞90%；固定化脂肪酶的添加量为底物总质量的6%~15%；醇解反应的时间为1~3h；
步骤2：反应结束后，分离得到sn2-LPC。
2.根据权利要求1所述的酶法制备sn2-LPC的方法，其特征在于，搅拌的转速为250~500rpm。
3.根据权利要求1所述的酶法制备sn2-LPC的方法，其特征在于，分离采用丙酮沉淀法，具体操作为：除去反应产物中的固定化脂肪酶和乙醇后加入3倍体积得冷丙酮，离心5 min后分离出沉淀，采用冷丙酮洗涤沉淀3次后，氮气吹干即得sn2-LPC。
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