CN112322670B - 甘油二酯的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一种甘油二酯的合成方法，包括以下步骤：(1)将油脂、脂肪酶和溶剂混合，进行水解反应，得水解产物；(2)在甘油二酯脂肪酶的作用下，将步骤(1)所得水解产物与甘油进行酯化反应；步骤(1)所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1‑H108A。本发明的合成方法可以制备得到高纯度的甘油二酯，且操作简便，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成领域，特别是涉及一种甘油二酯的合成方法。
背景技术
肥胖已逐渐成为世界各国一个十分严重的公共卫生问题。甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)作为一种功能性油脂可以减少人体脂肪的过度积累，促进人体中的脂质代谢，因此受到人们的广泛关注。甘油二酯是甘油三酯(triacylglycerol，TAG)的一个脂肪酸被羟基取代的所形成的结构脂，由两个结构异构体1,2-DAG和1,3-DAG组成，是食用油天然组成的一部分。甘油二酯被美国食品药品监督局(FDA)列为安全食品(GRAS)，在食品领域具有广泛的应用。
甘油二酯的制备主要方法包括甘油解法、酯化法、水解法。甘油解是以甘油与甘油三酯为底物，通过酶法催化甘油解反应，得到以甘油二酯为主的反应产物。因甘油解体系中大量存在的甘油，使体系的粘度增大，从而影响酶的催化。酯化法是酶法催化脂肪酸和甘油反应，得到含DAG的产物。但是在酯化之前需要制备较高纯度的脂肪酸，因此相比于其它制备方法此方法的制备过程通常比较复杂，会一定程度的增加制备成本与反应控制难度。而且酯化过程中甘油三酯的生成大大降低了甘油二酯的纯度，因为甘油三酯和甘油二酯很难分离，所以甘油三酯的含量影响甘油二酯的纯度，控制甘油三酯的含量至关重要。水解法是以甘油三酯为底物，选用1,3位脂肪酶部分水解，通过控制水解程度来制备甘油二酯。而水解度在实际工业生产中较难控制，给水解法增加了一定的困难。所以通过单一的制备方法来制备高纯度甘油二酯较为困难，需要多种技术手段协同制备。
CN 105400837 A公开一种酶催化甘油二酯的制备方法，采用先将油脂适度水解再将水解产物和甘油酯化的方法，所得产物中甘油二酯的含量为60％-65％。而且此制备技术需要严格控制水解过程中脂肪酸的含量在26-30wt％之间。可控的范围十分窄，控制不当可能使得甘油二酯水解过度，产生更多的脂肪酸，使得甘油二酯的纯度降低。而且此方法酯化过程的脂肪酶是甘油三酯脂肪酶，会在酯化过程中生成甘油三酯，使得甘油二酯含量降低，甘油三酯的含量升高。所以寻求一种经济，便捷，高纯度的制备方法势在必行。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种高纯度的甘油二酯的合成方法。
具体技术方案如下：
一种甘油二酯的合成方法，包括以下步骤：
(1)将油脂、脂肪酶和溶剂混合，进行水解反应，得水解产物；
(2)在甘油二酯脂肪酶的作用下，将步骤(1)所得水解产物与甘油进行酯化反应；
步骤(1)所述脂肪酶为甘油三酯脂肪酶MAS1或MAS1-H108A。
在其中一些优选实施例中，所述脂肪酶为甘油三酯脂肪酶MAS1-H108A。
在其中一些实施例中，所述甘油三酯脂肪酶MAS1或MAS1-H108A来源于Streptomycetes sp.Strain W007。
在其中一些实施例中，控制步骤(1)所述水解产物中的脂肪酸含量大于45wt％，优选大于50wt％，进一步优选大于60wt％。其中，本发明的发明人发现，控制步骤(1)所述水解产物中的脂肪酸含量大于60wt％，可以制备得到纯度大于80％的甘油二酯。
在其中一些实施例中，控制步骤(1)水解产物中的甘油三酯的含量小于22wt％，优选小于20wt％，进一步优选小于15wt％。
在其中一些实施例中，所述甘油二酯脂肪酶为脂肪酶SMG1、脂肪酶PCL、偏甘油脂肪酶AOL中的一种或两种以上的混合。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶SMG1来自马拉色霉菌。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶PCL来自青霉菌。
在其中一些实施例中，所述偏甘油脂肪酶AOL来自米曲霉。
在其中一些实施例中，所述溶剂为水或pH6～8的缓冲液。
在其中一些实施例中，所述步骤(1)的水解反应的温度为(20～60)℃。
在其中一些实施例中，所述步骤(1)的水解反应的pH为6～8。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述酯化反应的温度为30～50℃。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述酯化反应的pH为6～8。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述油脂和溶剂的质量比为1：0.1-5，进一步优选质量比为1：0.5-2。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述甘油与水解产物的质量比为(0.5-5)：1，进一步优选为(0.5-1.5)：1。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述脂肪酶的添加量为油脂质量的50～1000U/g，进一步为400～600U/g。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述甘油二酯脂肪酶的添加量为酯化反应混合物总质量的50～1000U/g，进一步为100～400U/g。
在其中一些实施例中，所述水解产物是将水解反应完后的反应体系分层后所得的油相。所述油相(水解产物)不需进一步分离纯化，直接与甘油进行酯化反应。
在其中一些实施例中，步骤(2)所得酯化反应完后，对所述酯化产物进行分离提纯。
在其中一些实施例中，所述分离提纯为分子蒸馏分离纯化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现，选择甘油三酯脂肪酶MAS1或MAS1-H108A对油脂进行水解，尤其是选择MAS1-H108A进行水解，其对甘油三酯的水解能力强，可以使水解产物中甘油二酯的含量大于甘油三酯，再将所得水解产物不经分离甘油三酯和脂肪酸而直接和甘油进行酯化反应，再选择甘油二酯脂肪酶催化酯化反应，最终本发明方法可制备得到高纯度的甘油二酯，其甘油三酯含量低。
此外，本发明采用催化油脂先水解再酯化的方法制备甘油二酯，无需担心油脂过度水解，操作简便，可控制性强，生产成本低，便于工业化生产。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明的发明人在对脂肪酶MAS1以及MAS1-H108A的长期研究过程中首次意外发现，与常规脂肪酶不同，这两种脂肪酶(特别是MAS1-H108A)对甘油三酯的水解倾向性大于甘油二酯。基于该发现，本发明的发明人结合自身长期的经验和大量的科研探索，最终得到了本发明的一种甘油二酯的合成方法，包括以下步骤：
(1)将油脂、脂肪酶和溶剂混合，进行水解反应，得水解产物；
(2)在甘油二酯脂肪酶的作用下，将步骤(1)所得水解产物与甘油进行酯化反应；
步骤(1)所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1-H108A。
本发明所述脂肪酶MAS1为野生型，来源于放线菌Streptomycetes sp.StrainW007，脂肪酶MAS1-H108A是野生型脂肪酶MAS1的突变体。本发明方法所使用的脂肪酶MAS1或MAS1-H108A，可以是购买或者按照本领域常规方法制备得到。
在其中一些实施方式中，控制步骤(1)所述水解产物中的脂肪酸含量大于45wt％，进一步地，可以选择控制脂肪酸含量大于46wt％，47wt％，48wt％，49wt％，50wt％，52wt％，53wt％，54wt％，55wt％，56wt％，57wt％，58wt％，59wt％，60wt％，61wt％，61wt％，63wt％，64wt％，或65wt％，可以制备得到纯度更高的甘油二酯。其中，本发明的发明人发现，控制步骤(1)所述水解产物中的脂肪酸含量大于60wt％，可以制备得到纯度大于80％的甘油二酯。
在其中一些实施方式中，控制步骤(1)水解产物中的甘油三酯的含量小于22wt％，进一步地，可以选择控制甘油三酯的含量小于21wt％，20wt％，19wt％，18wt％，17wt％，16wt％，15wt％，14wt％，13wt％，12wt％，11wt％，10wt％，或9wt％，其可以制备得到纯度更高的甘油二酯。
在其中一些实施方式中，所述甘油二酯脂肪酶为脂肪酶SMG1、脂肪酶PCL和偏甘油脂肪酶AOL中的一种或两种以上的混合。
在其中一些实施方式中，所述溶剂为水或pH7～8的缓冲液。所述pH7～8的缓冲液为常规的缓冲液即可，例如pH7～8的磷酸盐缓冲液。
在其中一些实施方式中，所述步骤(1)的水解反应的温度为(20～60)℃，进一步地，所述水解反应的温度为30～50℃。具体地，所述水解反应的温度为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、或50℃。
在其中一些实施方式中，所述步骤(1)的水解反应的pH为6～8。
在其中一些实施方式中，步骤(2)所述酯化反应的温度为30～50℃，进一步地，所述酯化反应的温度为35～45℃；具体地，所述酯化反应的温度为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、或50℃。
在其中一些实施方式中，所述酯化反应的pH为6～8。
在其中一些实施方式中，步骤(1)所述油脂和溶剂的质量比为1：0.1-5，进一步优选质量比为1：0.1-2；具体地，所述油脂和溶剂的质量比为1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1。
在其中一些实施方式中，步骤(2)所述甘油与水解产物的质量比为(0.5-5)：1，进一步优选为(0.5-1.5):1；具体地，所述甘油和水解产物的质量比为1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1。
在其中一些实施方式中，步骤(1)所述MAS1脂肪酶的添加量为油脂质量的50～1000U/g，进一步为100～800U/g，200～700U/g，300～600U/g，或400～600U/g。
在其中一些实施方式中，步骤(2)所述甘油二酯脂肪酶的添加量为酯化反应混合物总质量的50～1000U/g，进一步为50～800U/g，50～600U/g，50～400U/g，100～300U/g。
在其中一些实施方式中，所述水解产物是将水解反应完后的反应体系分层后所得的油相，所述分层采用常规的分层方法即可。
步骤(2)所得酯化反应完后，对所述酯化产物进行分离提纯；进一步地，所述分离提纯为分子蒸馏分离纯化，该分子蒸馏分离纯化采用常规的方法即可。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中使用的各种酶的来源或参考制备的文献如下：
甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1的制备：脂肪酶MAS1的基因克隆、表达及其性质研究[D].华南理工大学,2016.
甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1-H108A：李琳琳.固定化脂肪酶MAS1-H108A的制备及其催化合成富含α-亚麻酸甘油三酯的应用研究[D].华南理工大学,2019.
偏甘油酯脂肪酶PCL：偏甘油酯脂肪酶PCL及PCL-I260R已在专利“CNIO8642026A一种偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用”中公开。
偏甘油酯脂肪酶AOL：偏甘油酯脂肪酶AOL及AOL-V269D已在专利“CNIO8504643A一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构”中公开。
甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L：来源于诺维信。
实施例1
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1-H108A(基于油的总质量)，8h时取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量60.2％，甘油二酯含量20.5％，甘油三酯含量12.3％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量9.5％，甘油二酯含量55.4％，甘油三酯含量12.1％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为82.07％。
实施例2
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1-H108A(基于油的总质量)，12h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量70.1％，甘油二酯含量15.6％，甘油三酯含量10.5％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量13.2％，甘油二酯含量53.0％，甘油三酯含量10.0％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为84.13％。
实施例3
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1-H108A(基于油的总质量)，24h取样检测水解产物，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。所得水解产物中脂肪酸含量80.8％，甘油二酯含量10.1％，甘油三酯含量8.2％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量15.1％，甘油二酯含量50.2％，甘油三酯含量8.1％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为85.79％。
实施例4
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1(基于油的总质量)，36h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量63％，甘油二酯含量18.7％，甘油三酯含量13.3％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量12.20％，甘油二酯含量52.3％，甘油三酯含量13.1％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为80.02％。
实施例5
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1(基于油的总质量)，48h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量73％，甘油二酯含量13.1％，甘油三酯含量11.8％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量13％，甘油二酯含量53％，甘油三酯含量11.5％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为81.20％。
实施例6
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1-H108A(基于油的总质量)，6h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量50.3％，甘油二酯含量25.5％，甘油三酯含量18.2％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量7.6％，甘油二酯含量52.6％，甘油三酯含量20.5％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为72.90％。
实施例7
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1(基于油的总质量)，24h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量48.3％，甘油二酯含量24.3％，甘油三酯含量19.5％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量8.3％，甘油二酯含量50.20％，甘油三酯含量21.5％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为70.01％。
对比例1
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L(基于油的总质量)，12h取样检测水解产物，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量65.8％，甘油二酯含量12.70％，甘油三酯含量21.50％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量11.3％，甘油二酯含量45.2％，甘油三酯含量21.4％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为67.87％。
对比例2
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L(基于油的总质量)，24h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。使所得水解产物中脂肪酸含量70.2％，甘油二酯含量9.1％，甘油三酯含量18.9％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量11.0％，甘油二酯含量44.8％，甘油三酯含量19.2％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为70.61％。
对比例3
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L(基于油的总质量)，36h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。所得水解产物中脂肪酸含量79.1％，甘油二酯含量6.0％，甘油三酯含量14.9％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量14.1％，甘油二酯含量43.5％，甘油三酯含量15.9％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为72.50％。
对比例4
(1)水解：在具塞三角瓶中加入大豆油和pH为7.5的磷酸缓冲溶液，其质量比为1:0.5，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入500U/g的甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L(基于油的总质量)，8h取样检测，静置分层，取油相作为水解产物并回收水相，所得油相无需分离脂肪酸和甘油酯。所得水解产物中脂肪酸含量49.5％，甘油二酯含量21.9％，甘油三酯含量28.01％。
(2)酯化：将水解产物和甘油按质量比(1：1)，加入具塞三角瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上40℃预热10min，预热结束后加入200U/g偏甘油酯脂肪酶PCL。所得酯化产物中脂肪酸含量8.2％，甘油二酯含量45.8％，甘油三酯含量29.2％。经过分子蒸馏分离纯化，甘油二酯含量为61.30％。
表1实施例和对比例中不同阶段的物质含量
由表1的结果可知，本发明实施例1-5的甘油二酯的合成方法，采用先水解后酯化的方法，并且在水解过程中采用甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1或MAS1-H108A进行催化水解，并控制水解产物中脂肪酸含量大于60％，所得水解产物再经酯化，实现了酯化产物中甘油二酯含量＞50％，该酯化产物经简单的分子蒸馏纯化，即可实现甘油二酯含量＞80％。其中，实施例1-3使用脂肪酶MAS1-H108A突变体的方法所得产物中甘油二酯含量明显优于实施例4-5使用脂肪酶Lipase MAS1野生型的方法。
实施例6中，控制水解产物中脂肪酸含量为50.3％，所得甘油二酯含量相比实施例1～3有所降低。实施例7中，控制水解产物中脂肪酸含量为48.3％，甘油二酯含量相比实施例4～5有所降低。说明本发明方法中，控制水解产物中脂肪酸的含量＞60％，可以得到纯度更高的甘油二酯。
而对比例1-4，选择甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L进行催化水解，其中对比例1-3中，即使控制水解产物中脂肪酸的含量＞60％，所得甘油二酯的纯度也远低于实施例1-5。对比例4控制水解产物中脂肪酸含量为49.5％，甘油二酯的纯度比所有的实施例均低，为61.30％。
从表1的结果还可以得知，实施例1-5中的在水解过程中，选择甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1或MAS1-H108A进行催化水解，水解产物中的TAG的含量明显低于DAG，而在对比例1-4中的在水解过程中，选择甘油三酯脂肪酶Lipase TL100L进行催化水解，相同脂肪酸含量时，水解产物中的TAG的含量明显高于DAG，而TAG的含量影响分离纯化，最终影响DAG的纯度。
在此基础上，本发明针对甘油三酯脂肪酶Lipase MAS1、MAS1-H108A酶和TL100L对油脂的水解进行进一步的深入研究，将反应1-108h的不同时间点的各物质的含量进行了测定，结果如表2-4所示。
表2 MAS1-H108A酶水解不同反应时间点各物质含量
反应条件：水：大豆油＝1:2(质量比)、pH7缓冲液、温度40℃、MAS1-H108A加酶量200U/g。
表3 MAS1酶水解不同反应时间点各物质含量
反应条件：水：大豆油＝1:2(质量比)、pH7缓冲液、温度40℃、MAS1加酶量200U/g。
表4 TL100L酶水解不同反应时间点各物质含量
反应条件：水：大豆油＝1:2(质量比)、pH7缓冲液、温度40℃、TL100加酶量200U/g。
对比MAS1-H108A、MAS1和TL100L水解大豆油，发现MAS1-H108A和MAS1在水解的过程更倾向水解三酯，脂肪酸含量达到45％以上时，水解产物甘油二酯的含量大于甘油三酯的。继续水解时发现脂肪酸大于60％时，甘油三脂含量会继续降低，所得水解产物可以不用分离甘油三酯和脂肪酸，直接在甘油二酯脂肪酶的催化下和甘油进行酯化反应，制备得到更高纯度的甘油二酯。而TL100L水解大豆油时，甘油三脂的含量几乎一直高于甘油二酯，所得水解产物中的甘油三酯含量也明显高于甘油二酯。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种甘油二酯的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将油脂、脂肪酶和溶剂混合，进行水解反应，得水解产物；
（2）在甘油二酯脂肪酶的作用下，将步骤（1）所得水解产物与甘油进行酯化反应；
步骤（1）所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1-H108A;
控制步骤（1）所述水解产物中的脂肪酸含量大于60wt%。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，控制步骤（1）水解产物中的甘油三酯的含量小于22wt%。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，控制步骤（1）水解产物中的甘油三酯的含量小于20wt %。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述甘油二酯脂肪酶为脂肪酶SMG1、脂肪酶PCL和偏甘油脂肪酶AOL中的一种或两种以上的混合。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述溶剂为水或pH6~8的缓冲液。
6.根据权利要求1~5任一项所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）的水解反应的温度为（20~60）℃，水解反应的pH为6~8；和/或，步骤（2）所述酯化反应的温度为30~50℃，酯化反应的pH为6~8。
7.根据权利要求1~5任一项所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）所述油脂和溶剂的质量比为1：0.1-5；
和/或，步骤（2）所述甘油与水解产物的质量比为（0.5-5）：1。
8.根据权利要求1~5任一项所述的合成方法，其特征在于，所述水解产物是将水解反应完后的反应体系分层后所得的油相。
9.根据权利要求1~5任一项所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）所得酯化反应完后，对所述酯化产物进行分离提纯。
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Denomination of invention: The synthesis method of diglycerides Granted publication date: 20211015 Pledgee: Bank of China Limited Foshan Nanhai Xiqiao Sub-branch Pledgor: Guangzhou Yonghua special medicine nutrition Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980005359 |