CN113684230B - 一种酶法制备结构脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备结构脂的方法，属于油脂深加工领域。本发明第一步采用对甘油酯具有水解活性的脂肪酶催化油‑水体系发生水解反应，反应结束后回收脂肪酶和水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物，第二步加入甘油，采用具有酯化活性的脂肪酶催化甘油和游离脂肪酸发生酯化反应合成甘油二酯。本发明与化学法相比，反应条件温和，环境友好。相较于甘油和脂肪酸直接酯化制备甘二酯，本发明方法原料成本低，甘二酯得率高，同时避免了水解法制备甘二酯反应不易控制、副产物多的弊端。本发明所采用的方法生产成本低，产物易分离，同时制备得到更高得率的甘油二酯。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法制备结构脂的方法，属于油脂深加工领域。
背景技术
甘油二酯(DAG)是一类甘油三酯中的一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，具有特殊的生理功能。甘油二酯可以分为两种立体异构体，其分子结构式如式1所示，其中R或R1是脂肪酸基：
动物和人体试验表明，1,3-DAG被人体消化后生成甘油和游离脂肪酸，二者在人体内转化成能量，与甘油三酯相比，1,3-DAG独特的代谢特征，使其在控制高血脂症、肥胖症等有着一定的作用。另外，甘二酯作为多元醇型非离子表面活性剂的一个重要种类，具有润滑、抗静电、乳化等特性。甘二酯除了可应用于食品添加剂、医疗医药、化妆品等领域外，还可作为合成各种具有医药用途化合物的中间体。
目前工业上制备DAG主要有化学法和酶法，化学催化油脂甘油解制备甘二酯，是目前工业上生产甘二酯的主要方法，虽然化学法生产成本低，反应时间短，但是化学法催化剂多为强碱，同时反应对温度和压力的要求比较苛刻，常导致副反应的发生，因此工业上尝试采用酶法取代化学法制备DAG。酶法具有反应条件温和、产品质量高、环境污染小、副产物少、产品后处理简单、可用于制备结构酯等优点，虽然生物酶价格较高，但是固定化酶可以重复利用，因此生物酶法具有一定的可行性。
目前，国内外合成甘二酯的方法包括油脂甘油解法、直接酯化法、水解法。甘油解法是指以甘油三酯和甘油为原料，在脂肪酶的催化下制备甘油二酯的反应，甘油解法虽然工艺简单，但耗时长，产物纯度低，为降低底物粘度还需要加入一定量的溶剂。直接酯化法是指甘油和脂肪酸直接酯化合成甘油二酯，该方法反应时间短、产物纯度高，由于甘油和脂肪酸一般经过油脂的水解制备而来，以二者为原料制备甘二酯，在生产成本上要比油脂甘油解法高得多。水解法是通过酶催化甘油三酯水解来生成甘油二酯的方法，水解法的产物取决于反应进行的程度，局部水解时产物为甘油一酯、甘油二酯和游离脂肪酸，完全水解时产物为游离脂肪酸和甘油，水解法反应不易控制、副产物多，不适合工业化生产。
发明内容
【技术问题】
现有酶法制备甘油二酯的耗时长，产物纯度低、成本高。
【技术方案】
鉴于上述和/或现有酶法制备甘油二酯的方法中存在的问题，提出了本发明。本发明提供了一种酶法制备结构脂的方法，第一步利用脂肪酶催化油和水发生水解反应，获得富含游离脂肪酸的油脂混合物，第二步加入甘油在酶催化下发生酯化反应，得到甘二酯。
具体的本发明提供了如下技术方案：一种酶法制备结构脂的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、取油脂、水、脂肪酶于反应器中，在一定的温度和时间下进行水解反应，反应结束后回收脂肪酶和水，获得富含游离脂肪酸的油脂混合物；
S2、在步骤S1得到的油脂混合物中加入甘油、脂肪酶，在一定的真空条件下进行酯化反应，反应结束后回收脂肪酶，并将反应产物分离、纯化得到甘油二酯。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述油脂包括天然植物油脂、动物油脂、微生物油脂中的至少一种。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S1中的脂肪酶包括来源于Rhizopusoryzea、Candida cylindracea、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas fluorescens的脂肪酶中的至少一种。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S1中的脂肪酶包括来源于Rhizopusoryzea的Lipase DF"Amano"15、Lipase DF"Amano"IM和Lipase MER；来源于Candidacylindracea的AY"Amano"400SD、Lipase AY"Amano"30SD、AY"Amano"400SD-K、Lipase AYS和其固定化形式Candida cylindracea；来源于Pseudomonas cepacia的PS"Amano"SD、Lipase PS和其他固定化形式的Candida cylindracea，以及来源于Pseudomonasfluorescens的lipase AK"Amano"和其固定化形式的Pseudomonas fluorescens中的至少一种。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S1中，所述脂肪酶的用量为油脂总质量的0.01％～20％，优选为0.2％～15％。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S1中，所述油脂与水的质量比为1:1～10:1；优选为3:1～8:1。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S1中，所述反应的温度为20～60℃，反应的时间为0.5～12h；优选的，反应温度为25～45℃，优选的反应时间为1～8h。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述真空条件的压力范围是0.02-1000Pa。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的脂肪酶包括具有酯化活性的特异性酶和非特异性酶。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的具有酯化活性的特异性酶和非特异性酶包括来源于Rhizomucor miehei、Candida antarctica、Rhizopus oryzea、Penicillium camembertii、Pseudomonas cepacia的脂肪酶中的至少一种。
在本发明的一种或多种实施方式中，所述步骤S2中的脂肪酶包括来源于Rhizomucor miehei的Lipozyme RM IM和Lipozyme RM；来源于Candida antarctica的Lipozyme 435、Lipase CL“Amano”IM和Novozym 435；来源于Rhizopus oryzea的DF"Amano"15和Lipase DF"Amano"IM；来源于Penicillium camembertii的Lipase G"Amano"50、Lipase G-50SD和其固定化形式的Penicillium camembertii，以及来源于Pseudomonascepacia的Lipase PS"Amano"SD和Lipase PS中的至少一种。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S2中，所述脂肪酶的用量为油脂混合物和甘油总质量的0.01％～15％，优选为2％～8％。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S2中，所述油脂混合物与甘油的质量比为10:1～35:1，优选为15:1～30:1，更优选为18:1～27:1。
在本发明的一种或多种实施方式中，步骤S2中，所述酯化反应的温度为40～70℃，反应时间为3～24h；优选的，反应温度为50～65℃，优选的反应时间为8～12h。
本发明还提供了上述方法在食品、医药、日化领域的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种酶法制备结构脂的方法，即两步法制备甘二酯，第一步是在具有水解活性脂肪酶的催化下，天然油脂发生水解反应生成富含游离脂肪酸的油脂混合物，第二步是在具有酯化活性脂肪酶的催化下，油脂混合物中的游离脂肪酸和甘油发生酯化反应生成甘油二酯，相较于甘油和脂肪酸直接酯化制备甘二酯，本发明方法原料成本低，甘二酯得率高，同时避免了水解法制备甘二酯反应不易控制、副产物多的弊端。
(2)本发明第一步选用的脂肪酶都具有较高的水解活性，其中来源于Candidacylindracea的脂肪酶水解活性最高，来源Rhizopus oryzae的脂肪酶在第一步水解过程中就能产生较高含量的甘二酯，本领域技术人员能够根据脂肪酶的不同特点选择对应的工艺。
附图说明
图1为本发明实施例1的大豆油反应前后的液相色谱(示差检测器)图，其中，a为大豆油反应前的液相色谱图，b为水解反应后酯化反应之前的液相色谱图，c为酯化反应之后的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明的一种两步酶法制备结构脂的方法，包括如下步骤：
(1)按照比例向反应器中加入油样、蒸馏水和脂肪酶，进行水解反应，反应结束后回收脂肪酶和水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。
(2)在步骤(1)制得的油脂混合物中加入适量甘油和脂肪酶，保持体系在指定温度下反应一定时间，反应结束后回收脂肪酶，反应产物进分离纯化得到富含DAG的甘油解产物。
产品表征分析：
上述步骤(1)的油脂混合物和和步骤(2)的甘油二酯的表征方法如下：
参考Zhang等{Zhang Y,Wang X,Zou S,et al.Synthesis of 2-docosahexaenoylglycerol by enzymatic ethanolysis[J].Bioresour Technol,2018,251(334-340)}的方法，利用HPLC-RID对反应后体系中的脂质成分进行定量分析。具体方法如下：取反应后的混合产物30mg，加入1mL流动相(正己烷：异丙醇：甲酸体积比＝15:1:0.003)溶解，过膜，液相色谱检测，色谱条件为：色谱柱Sepax HP-Silica(4.6mm×250mm×5μm)，柱温30℃；样品浓度为10mg/mL，进样量为15μL；流动相正己烷：异丙醇：甲酸之比为15:1:0.03(v/v/v)，流速为1mL/min。各脂质组分通过标准品定性，样品浓度与峰面积呈线性关系，各物质的相对组成通过面积归一法表示(％)。
DAG的得率分析
DAG得率的计算公式如下式(1)所示：
实施例1
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水20.0g，和0.047g源于Candidacylindracea的脂肪酶AY"Amano"400SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应4h。反应结束后，回收脂肪酶AY"Amano"400SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量见表1。
(2)取24.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.21g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，甘二酯的得率见表1。
实施例2
同实施例1，但是，步骤(1)中大豆油和蒸馏水的质量比修改为10:1(蒸馏水2.0g)，其余参数不变。
经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表1。
实施例3
同实施例1，但是，步骤(1)中大豆油和蒸馏水的质量比修改为20:1(蒸馏水1.0g)，其余参数不变。
经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表1。
表1大豆油和蒸馏水的质量比对游离脂肪酸的含量和甘二酯得率的影响(实施例1～3)
实施例4
同实施例1，但是，步骤(1)中体系反应温度修改为45℃，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表2。
实施例5
同实施例1，但是，步骤(1)中体系反应温度修改为55℃，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表2。
表2第一步反应温度对游离脂肪酸的含量和甘二酯得率的影响(实施例1、4、5)
实施例6
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水10.0g，和2.013g来源于Pseudomonascepacia的脂肪酶PS"Amano"SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应2h。反应结束后，回收脂肪酶PS"Amano"SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量见表3。
(2)取18.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.73g来源于Candida antarctica的脂肪酶Novozym 435催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应16h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Novozym 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率见表3。
实施例7
同实施例6，但是，步骤(1)中体系反应时间修改为4h，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表3。
实施例8
同实施例6，但是，步骤(1)中体系反应时间修改为8h，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表3。
表3第一步反应时间对游离脂肪酸的含量和甘二酯得率的影响(实施例6～8)
实施例9
(1)准确称取大豆油样品10.0g，蒸馏水10.0g，和1.92g来源于Pseudomonascepacia的脂肪酶PS"Amano"SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应12h。反应结束后，回收脂肪酶PS"Amano"SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为97.8％。
(2)取12.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.66来源于Candida antarctica的脂肪酶Novozym 435催化其反应，控制反应温度为50℃，在磁力搅拌下反应12h，控制反应体系的压力为200Pa，反应结束后，回收脂肪酶Novozym 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率见表4。
实施例10
同实施例9，但是，步骤(2)中油脂混合物和甘油的质量比修改为18:1(油脂混合物18.0g)，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表4。
实施例11
同实施例9，但是，步骤(2)中油脂混合物和甘油的质量比修改为27:1(油脂混合物27.0g，步骤(1)量不足时补足)，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表4。
实施例12
同实施例9，但是，步骤(2)中油脂混合物和甘油的质量比修改为36:1(油脂混合物36.0g，步骤(1)量不足时补足)，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表4。
表4油脂混合物和甘油对甘二酯得率的影响(实施例9～12)
实施例13
同实施例10，但是，步骤(2)中反应温度修改为30℃，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表5。
实施例14
同实施例10，但是，步骤(2)中反应温度修改为40℃，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表5。
实施例15
同实施例9，但是，步骤(2)中反应温度修改为60℃，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表5。
表5第二步反应温度对甘二酯得率的影响(实施例10、13～15)
实施例16
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水10.0g，和3.14g来源于Pseudomonascepacia的脂肪酶PS"Amano"SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应8h。反应结束后，回收脂肪酶PS"Amano"SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为89.0％。
(2)取20.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.98g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应16h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率见表6。
实施例17
同实施例16，但是，步骤(2)中体系反应时间修改为3h，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表6。
实施例18
同实施例16，但是，步骤(2)中体系反应时间修改为5h，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表6。
实施例19
同实施例16，但是，步骤(2)中体系反应时间修改为12h，其余参数不变，经HPLC-ELSD检测，步骤(1)中游离脂肪酸的含量和步骤(2)甘二酯的得率见表6。
表6第二步反应时间对游离脂肪酸的含量和甘二酯得率的影响(实施例16～19)
实施例20
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水15.0g，和2.48g来源于Pseudomonasfluorescens的脂肪酶lipase AK"Amano"一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应10h。反应结束后，回收脂肪酶lipase AK"Amano"和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为79.4％。
(2)取20.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.98g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应16h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为65.4％。
实施例21
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水4.0g，和0.006g源于Rhizopus oryzea的脂肪酶DF"Amano"15一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应3h。反应结束后，回收脂肪酶DF"Amano"15和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为46.5％。
(2)取15.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加0.165来源于Candida antarctica的脂肪酶Lipozyme 435催化其反应，控制反应温度为56℃，在磁力搅拌下反应24h，控制反应体系的压力为800Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme 435，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为61.7％。
实施例22
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水15.0g，和2.48g来源于Pseudomonasfluorescens的脂肪酶lipase AK"Amano"一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应12h。反应结束后，回收脂肪酶lipase AK"Amano"和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为82.0％。
(2)取23.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加0.89g来源于Rhizopus oryzea的脂肪酶DF"Amano"15催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应15h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶DF"Amano"15，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为63.7％。
实施例23
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水10.0g，和0.141g来源于Candidacylindracea的Lipase AY-30SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应10h。反应结束后，回收脂肪酶Lipase AY-30SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为83.3％。
(2)取18.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加0.89g来源于Penicilliumcamembertii的脂肪酶Lipase G"Amano"50催化其反应，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应24h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipase G"Amano"50，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为60.7％。
实施例24
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水5.0g，和0.278g来源于Candidacylindracea的Lipase AYS一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应5h。反应结束后，回收脂肪酶Lipase AY-30SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为80.5％。
(2)取22.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加0.89g来源于Penicilliumcamembertii的脂肪酶Lipase G"Amano"50催化其反应，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应24h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipase G"Amano"50，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为65.2％。
对比例1(与实施例21对比)
采用一步水解法制备DAG，包括如下步骤：
准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水4.0g，和0.006g来源于Rhizopus oryzea的脂肪酶DF"Amano"15一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应3h。反应结束后，回收脂肪酶DF"Amano"15和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到含有DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为50.9％。
对比例2(与实施例1对比)
采用一步水解法制备DAG，包括如下步骤：
准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水20.0g，和0.16g源于Candida cylindracea的脂肪酶AY"Amano"400SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应4h。反应结束后，回收脂肪酶AY"Amano"400SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到含有DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为6.9％。
对比例3(与实施例1对比)
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水20.0g，和0.16g来源于Penicilliumcamembertii的脂肪酶Lipase G"Amano"50一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应4h。反应结束后，回收脂肪酶Lipase G"Amano"50和蒸馏水，得到油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为2.5％。
(2)取24.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.2g脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到含有DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为3.4％。
对比例4(与实施例1对比)
采用油脂甘油解法制备DAG，包括如下步骤：
取24.0g大豆油，加入1.0g甘油，并添加1.21g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到含有DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为20.3％。
对比例5(与实施例7对比)
相较于实施例7的区别仅在于第二步反应在常压下进行，其余均同实施例7。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为47.9％。
对比例6(与实施例1对比)
(1)准确称取大豆油样品20.0g，蒸馏水20.0g，和0.047g源于Candidacylindracea的脂肪酶AY"Amano"400SD一起加入到烧杯中，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应4h。反应结束后，回收脂肪酶AY"Amano"400SD和蒸馏水，得到富含游离脂肪酸的油脂混合物。经HPLC-ELSD检测，游离脂肪酸的含量为89.6％。
(2)取24.0g油脂混合物，加入1.0g甘油，并添加1.21g来源于Thermomyceslanuginosus的脂肪酶Lipozyme TL IM催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为100Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme TL IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到富含DAG的产物。经HPLC-ELSD检测，计算得到甘二酯的得率为30.7％。
脂肪酶水解活性的对比：
对比例7(与实施例1步骤(1)对比)
步骤(1)同实施例1，但是，步骤(1)中脂肪酶及其添加量修改为来源于Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS"Amano"SD，添加量为2.355g，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，经HPLC-ELSD检测，经HPLC-ELSD检测，得到脂质组成见表7。
对比例8(与实施例1步骤(1)对比)
步骤(1)同实施例1，但是，步骤(1)中脂肪酶及其添加量修改为来源于Pseudomonas fluorescens的脂肪酶lipase AK"Amano"，添加量为2.871g，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，经HPLC-ELSD检测，得到脂质组成见表7。
对比例9(与实施例1步骤(1)对比)
步骤(1)同实施例1，但是，步骤(1)中脂肪酶修改为来源于Rhizopus oryzea的脂肪酶Lipase DF“Amano”15，其余参数不变。经HPLC-ELSD检测，经HPLC-ELSD检测，得到脂质组成见表7。
表7大豆油水解产物脂质组成(实施例1，对比例6～9)
从表7可以看出，这四种脂肪酶都具有一定的水解活性，从实施例1和对比例7，8可以看出，脂肪酶PS"Amano"SD和AK"Amano"的添加量比AY"Amano"400SD的添加量高，但是在相同的反应时间内，AY"Amano"400SD水解得到的游离脂肪酸最高，说明AY"Amano"400SD具有更高的水解活性。从实施例1和对比例9可以看出，在相同的酶添加量和反应时间条件下，和AY"Amano"400SD相比，脂肪酶DF“Amano”15的水解活性较低，但是水解产物中含有39.04％的1，2-甘二酯，说明Lipase DF“Amano”15将甘三酯水解成甘二酯后，进一步水解甘二酯的活性低，甘二酯在水解产物中累计。Lipase DF“Amano”15催化游离脂肪酸和甘油酯化主要合成的是1，3-甘油二酯，水解产物中的1，2-甘二酯不会抑制1，3-甘油二酯的合成，联合实施例21可以看出，Lipase DF“Amano”15的水解产物和甘油发生酯化反应，甘二酯的含量可以得到进一步的上升。
本发明以实施例1的产物为例进行脂质组成分析，如图1所示为本发明实施例1的大豆油反应前后的液相色谱图，其中，a为大豆油反应前的液相色谱图，b为脂肪酶AY"Amano"400SD催化水解反应后的液相色谱图，c为脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化反应之后的液相色谱图，图a有一个甘三酯的峰，说明大豆油在反应前的主要成分为甘三酯(TAG)，含有少量的甘二酯(DAG)，图b中出现了游离脂肪酸(FFA)的峰，说明葵花籽油发生了水解反应，甘三酯的含量大幅度下降，主要生成了游离脂肪酸(FFA)，从图c可以看出游离脂肪酸的含量下降，甘三酯和甘二酯的含量上升，说明游离脂肪酸和甘油发生了酯化反应反应，产物的主要成分为甘二酯。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种酶法制备甘油二酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取油脂、水、脂肪酶于反应器中，在35-55℃温度下水解反应4 h，反应结束后回收脂肪酶和水，获得富含游离脂肪酸的油脂混合物，其中，所述脂肪酶选自以下脂肪酶或其固定化形式：来源于Candida cylindracea的AY "Amano" 400SD，油脂与水的质量比为1：1；所述脂肪酶的用量为油脂总质量的0.235%；所述油脂为大豆油；
S2、在步骤S1得到的油脂混合物中加入甘油、脂肪酶，在100 Pa的真空条件下进行酯化反应，反应结束后回收脂肪酶，并将反应产物分离、纯化得到得率不低于67%的甘油二酯，其中，所述酯化反应的温度为65℃，反应时间为8h；所述脂肪酶选自来源于Rhizomucor miehei的Lipozyme RM IM，所述油脂混合物与甘油的质量比为24:1；所述脂肪酶的用量为油脂混合物和甘油总质量的4.84%。
2.权利要求1所述的一种酶法制备甘油二酯的方法在食品、医药或日化领域中的应用。
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