JP2021073951A - ジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】工業的に有利に高純度のジアシルグリセロールを高収率で製造する方法の提供。【解決手段】固定化酵素を用いて、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含み、当該工程の間中、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係が、次式（ｉ）；（ｉ） １００００ｘ＋１００≧ｙ≧２５００ｘ−３００（但し、ｘ≦０．６、２００≦ｙ≦１２００）（ここで、ｘは油相水分（質量％）、ｙは圧力（Ｐａ）を示す。）を満たす、ジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法に関する。

ジアシルグリセロールを高濃度に含む油脂は、食後の血中トリグリセリド（中性脂肪）の増加を抑制し、体内への蓄積性が少ない等の生理作用を有することが知られている（例えば特許文献１参照）。
ジアシルグリセロールの製造は、グリセリンと油脂とのグリセロリシス反応による方法や、グリセリンと脂肪酸とのエステル化反応による方法が一般的である（例えば特許文献２〜５参照）。これらの製法は、アルカリ触媒等を用いた化学法と、リパーゼ等の酵素を用いた酵素法に大別されるが、酵素を用いて温和な条件で反応を行うのが風味等の点で好ましいと云われている。

特開平１０−１７６１８１号公報 特公平６−６５３１０号公報 特公平６−６５３１１号公報 特開平４−３３０２８９号公報 特表２００４−５２８８４３号公報

グリセリンと脂肪酸とのエステル化反応を行う際には、反応系内を真空状態として生成する水を除き、一定値以下とすることによって、反応を効率的に進めることが常套手段である。真空条件は、簡便性の点から操作上一定に保つことが一般的であり、ある程度高い反応率で所望の品質のものが得られる。
しかしながら、固定化酵素を触媒としてグリセリンと脂肪酸とを一定の真空度を保ってエステル化反応させる場合、ジアシルグリセロール純度や反応収率向上の点から高真空条件とすると、酵素の耐久性の点で必ずしも満足するものとはいえず、工業的に課題のあることが判明した。
従って、本発明の課題は、工業的に有利に高純度のジアシルグリセロールを高収率で製造する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、所定の圧力下で、且つ油相水分と圧力が後述する式（ｉ）を満たす条件で酵素エステル化反応を行うことにより、固定化酵素中の水分量の過剰な低下を抑制し、酵素活性の低下を抑えながらエステル化反応を促進し、高純度のジアシルグリセロールを高い収率で得られることを見出した。

すなわち、本発明は、固定化酵素を用いて、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含み、当該工程の間中、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係が、次式（ｉ）；
（ｉ） １００００ｘ＋１００≧ｙ≧２５００ｘ−３００
（但し、ｘ≦０．６、２００≦ｙ≦１２００）
（ここで、ｘは油相水分（質量％）、ｙは圧力（Ｐａ）を示す。）
を満たす、ジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法を提供するものである。

本発明によれば、工業的に有利にジアシルグリセロール純度の高い油脂を高収率で製造することができる。

本発明のジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法は、固定化酵素を用いて、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含み、当該工程の間中、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係が、次式（ｉ）；
（ｉ） １００００ｘ＋１００≧ｙ≧２５００ｘ−３００
（但し、ｘ≦０．６、２００≦ｙ≦１２００）
（ここで、ｘは油相水分（質量％）、ｙは圧力（Ｐａ）を示す。）
を満たす、製造方法である。
ここで、油相は、脂肪酸、その低級アルキルエステル及び油脂であり、「油相水分」は、当該油相に含まれる水分である。
また、本明細書において「油脂」は「油」と同義であり、油脂（油）を構成する物質にはトリアシルグリセロールのみならずモノアシルグリセロールやジアシルグリセロールも含まれる。すなわち、油脂（油）は、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールのいずれか１種以上を含むものである。

〔固定化酵素〕
本発明で用いられる固定化酵素は、固定化リパーゼが好ましく、リパーゼは、特に制限されず、動物由来、植物由来、微生物由来のリパーゼを用いることができる。例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の起源のリパーゼが挙げられる。
固定化リパーゼの種類は、特に制限されず、グリセロールのｓｎ−１位とｓｎ−３位に特異性を示す１，３位選択リパーゼ、位置特異性のない（ランダム型）のリパーゼ等を用いることができる。なかでも、反応性の点から、１，３位選択リパーゼが好ましい。市販の固定化１，３位選択リパーゼとしては、例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭ（ノボザイムジャパン製）が挙げられる。

固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。
固定化担体の形状は、特に限定されないが、粒子状、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等が挙げられる。
なかでも、生産効率の点、脂肪酸との親和性及び保水力が高い点から、イオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。

固定化担体として用いる樹脂の粒子径は５０〜２０００μｍが好ましく、更に１００〜１０００μｍが好ましい。細孔径は１０〜１５０ｎｍが好ましく、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、更にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、ダウケミカル社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）が酵素吸着性向上の点から好ましい。
このとき、用いる酵素量は、担体質量に対して１０〜３００質量％、更に２０〜２５０質量％、更に３０〜２００質量％が好ましい。固定化の際、酵素を溶液状態にするが、酵素の特性に合わせて、緩衝剤をｐＨ５〜７に調整して用いることが好ましい。固定化時の温度は０〜６０℃、更に５〜４０℃が好ましい。

固定化酵素の活性を高めるために、酵素の固定化前に予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体を担体に吸着させる処理を施しても良い。処理を施す方法としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等の有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加える方法が挙げられる。
使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していても良い脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、２種以上を併用しても良い。

〔脂肪酸又はその低級アルキルエステル〕
本発明で用いられる脂肪酸又はその低級アルキルエステルは、直鎖又は分岐鎖の炭素数４〜２２、好ましくは炭素数８〜１８の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ゾーマリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ガドレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を用いることができる。また、上記脂肪酸とエステルを形成する低級アルコールとしては、炭素数１〜６のもの、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール又はｔ−ブタノール等が挙げられる。これらの脂肪酸又はその低級アルキルエステルは、２種以上を併用することもできる。

本発明では、原料油脂を加水分解して得られる脂肪酸を用いてもよい。
ここで、加水分解の対象となる原料油脂は、植物性油脂、動物性油脂のいずれでもよい。例えば、大豆油、菜種油、サフラワー油、米油、コーン油、ヒマワリ油、綿実油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、ハトムギ油、小麦胚芽油、シソ油、アマニ油、エゴマ油、サチャインチ油、クルミ油、キウイ種子油、サルビア種子油、ブドウ種子油、マカデミアナッツ油、ヘーゼルナッツ油、カボチャ種子油、椿油、茶実油、ボラージ油、パーム油、パームオレイン、パームステアリン、やし油、パーム核油、カカオ脂、サル脂、シア脂、藻油等の植物性油脂；魚油、アザラシ油、ラード、牛脂、バター脂等の動物性油脂；あるいはそれらのエステル交換油、水素添加油、分別油等の油脂類を挙げることができる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
原料油脂は、油脂を構成する脂肪酸中の飽和脂肪酸が３０質量％以下と少ない油脂が好ましい。
油脂を加水分解する方法としては、高温高圧分解法と酵素分解法が挙げられる。
高温高圧分解法とは、油脂に水を加えて、高温、高圧の条件で反応することにより、脂肪酸とグリセリンを得る方法である。また、酵素分解法とは、油脂に水を加えて、油脂加水分解酵素を触媒として用い、低温の条件で反応することにより、脂肪酸とグリセリンを得る方法である。

油脂加水分解酵素としては、リパーゼが好ましく、特に制限されず、前記の動物由来、植物由来、微生物由来のリパーゼを用いることができる。なかでも、加水分解効率の点から、位置・鎖長選択性のない、所謂非選択性リパーゼを用いるのが好ましく、更にキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）によって生産される非選択性リパーゼを用いるのが好ましい。例えば、リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ−Ｋ（天野エンザイム（株）製）がある。

加水分解反応は、常法に従って行うことができる。
加水分解反応は、以下の式（１）で示される遊離脂肪酸濃度によって管理し、所定の分解率に到達した時点で終了すればよい。
遊離脂肪酸濃度（％）＝加水分解油の酸価（ＡＶ）×（原料油脂の脂肪酸平均分子量／５６．１／１０）・・・・（１）
油脂を加水分解して得られる脂肪酸の遊離脂肪酸濃度は、ジアシルグリセロールの転移反応抑制の点から、８０質量％以上、更に８４質量％以上、更に８８質量％以上、更には９２質量％以上が好ましい。
加水分解後、反応液から脂肪酸を得るには、油脂加水分解酵素と水相を静置分離や遠心分離等で油相と分離すればよい。
加水分解油には、脂肪酸の他に未反応の油脂や部分的に加水分解された油脂等が含まれるが、エステル化反応原料の脂肪酸としてこのまま使用しても良く、蒸留による精製、ウインタリング等により脂肪酸組成の調整等を行った後に使用してもよい。

〔グリセリン〕
本発明において使用するグリセリンは、エステル化の反応性の点から、純度９５質量％以上のものが好ましい。

〔原料の仕込み比〕
エステル化反応を行う際のグリセリンのモルに対する脂肪酸のモルの比［ＦＡ／ＧＬＹ］は、反応油の組成が最適になる点（反応油中の脂肪酸等及びグリセリンの残存量、並びにモノアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールの生成量が抑制され、蒸留負荷が低減すると共にジアシルグリセロール高含有となり、生産効率が高くなる点）から、５．０以下、更に４．０以下、更に３．０以下、更に２．５以下とするのが好ましく、また、反応速度向上、蒸留残渣比率の向上の点から、０．５以上、更に１．０以上、更に１．２以上、更に１．５以上とするのが好ましい。
グリセリンのモルに対する脂肪酸のモルの比［ＦＡ／ＧＬＹ］は、以下の式（２）で表される。
ＦＡ／ＧＬＹ＝（遊離脂肪酸のモル＋モノアシルグリセロールのモル＋ジアシルグリセロールのモル×２＋トリアシルグリセロールのモル×３）／（グリセリンのモル＋モノアシルグリセロールのモル＋ジアシルグリセロールのモル＋トリアシルグリセロールのモル）・・・・（２）

〔エステル化反応〕
本発明では、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含み、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係は、次式（ｉ）；
（ｉ） １００００ｘ＋１００≧ｙ≧２５００ｘ−３００
（但し、ｘ≦０．６、２００≦ｙ≦１２００）
（ここで、ｘは油相水分（質量％）、ｙは圧力（Ｐａ）を示す。）
を満たすように操作する。エステル化反応は、反応生成水を反応系外に除去しながら行うことにより反応が進行するが、本発明においては反応生成水の除去を減圧により行う。しかし、エステル化触媒として固定化酵素を用いる場合は、反応系から水分を除去し過ぎると固定化酵素中の水分が低下してしまい、酵素活性が低下することにより、結果としてジアシルグリセロール純度の高い油脂を高い反応収率で得ることができなくなってしまうことが判明した。
本発明においては、反応系の油相水分が０．６質量％以下で、圧力１２００Ｐａ以下、２００Ｐａ以上の真空度において、油相水分に対して圧力を調整しながら酵素エステル化反応を行うことで、エステル化反応を促進しつつ、固定化酵素中の水分量の過剰な低下を抑制し、酵素活性の低下を抑えることにより、ジアシルグリセロール純度の高い油脂が、高い反応収率で得られる。また、酵素活性の低下を抑えることができる結果、固定化酵素の再利用性にも優れる。なお、反応系の油相水分が０．６質量％を超える場合には、圧力を１２００Ｐａ以下とする必要はないが、２００Ｐａ以上であることが好ましい。
以下、固定化酵素を用いて、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を「エステル化工程」ともいう。
本発明において、エステル化工程の間中、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係は、前記式（ｉ）を満たすが、酵素活性の低下を抑えながらエステル化反応を促進し、ジアシルグリセロール純度の高い油脂を高い反応収率で得る点から、次式(ii)；
（ii） １００００ｘ−１００≧ｙ≧２５００ｘ−１７５
（但し、ｘ≦０．５５、２００≦ｙ≦１２００）
を満たすことが好ましく、更に次式(iii)；
（iii) １００００ｘ−３００≧ｙ≧２５００ｘ−７５
（但し、ｘ≦０．５１、２００≦ｙ≦１２００）
を満たすことがより好ましい。

本発明では、エステル化工程において、油相水分が０．６質量％以下では、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係が式（ｉ）を満たすのであれば、圧力は一定であってもよいが、エステル化反応の促進と、固定化酵素中の水分量の過剰な低下を抑制することによる酵素活性低下抑制をより高度に両立し、さらに転移反応を抑制して、ジアシルグリセロール純度の高い油脂を高い反応収率で得る点から、圧力を変化させながらエステル化反応を行うことが好ましく、圧力は油相水分の低下と共に低下するように変化させることがより好ましい。
圧力は、低真空度から高真空度となるように変化させることが好ましい。具体的には、エステル化反応を、圧力２００〜１２００Ｐａの範囲内で、かつ油相水分を基に前記式（ｉ）の範囲内となる真空度に調整すればよい。また、真空度の操作は、前記式（ｉ）の範囲内となるように連続的に推移させても、段階的に推移させてもよい。ただ、反応初期は水分量が高いため、油相中の水分量が０．６質量％超の場合は１２００Ｐａ超の圧力で反応させてもよく、その後反応が進行して油相中の水分量が０．６質量％以下となった時点では１２００Ｐａ以下となっているように調整する。例えば、油相中の水分量が０．３質量％となった時点で、真空度を上げて圧力を１２００Ｐａ未満４５０Ｐａ以上の間に調整することが好ましく、１２００Ｐａ未満５７５Ｐａ以上とすることがより好ましく、１２００Ｐａ未満６７５Ｐａ以上とすることが更に好ましい。更に反応が進行して油相中の水分量が０．２質量％以下となった時点で、より真空度を上げて圧力を１２００Ｐａ未満２００Ｐａ以上の間に調整することが好ましく、１２００Ｐａ未満３２５Ｐａ以上の間に調整することがより好ましく、１２００Ｐａ未満４２５Ｐａ以上の間に調整することが更に好ましい。更に反応が進行して油相中の水分量が０．１質量％以下となった時点で、更に真空度を上げて圧力を１１００Ｐａ以下２００Ｐａ以上の間に調整することが好ましく、９００Ｐａ以下２００Ｐａ以上の間に調整することがより好ましく、７００Ｐａ以下２００Ｐａ以上の間に調整することが更に好ましい。
なお、一回目のエステル化反応で、圧力とその時の反応時間に対する油相水分の変化の関係を把握しておくと、固定化酵素を繰り返して使う場合には、圧力に対する油相水分は反応時間で想定できるため、水分測定を省略することができる。

また、本発明のエステル化反応において、ジアシルグリセロール純度の高い油脂を高い反応収率で得る点から、反応生成水を除去する方法として、減圧の他に、例えば、ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用、反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法を併用してもよい。

エステル化工程では、固定化酵素の活性を有効に利用できる点から、油相水分ｘが０．２５質量％以上、好ましくは０．３〜０．６質量％で、２０分以上、好ましくは６０分以上エステル化反応させ、次いで、反応生成水を反応系外に除去しながらエステル化反応を行うことで油相水分を低下させて、油相水分ｘが０．２５質量％未満、好ましくは０．２質量％以下で、１５分以上、好ましくは６０分以上エステル化反応させることが好ましい。

エステル化反応に用いる固定化酵素の量は、酵素の活性を考慮して適宜決定することができるが、反応速度を向上する点から、原料（グリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステル）の合計質量に対して、１〜３０質量％、更に２〜２０質量％が好ましい。

固定化酵素と原料（グリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステル）の接触手段としては、浸漬、攪拌、固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液する方法等が挙げられる。攪拌する場合、生産効率の点、酵素の破砕抑制の点から、１０〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更に５０〜７００ｒ／ｍｉｎ、更に１００〜６００ｒ／ｍｉｎが好ましい。

エステル化反応の反応温度は、反応性の点から、２０〜８０℃、更に３０〜７０℃が好ましい。また、反応時間は、トリアシルグリセロールへの転移反応抑制の点、工業的な生産性の点から、１０時間以内が好ましく、更に０．１〜８時間、更に０．５〜５時間が好ましい。

反応系における固定化酵素の水分量は、酵素活性の低下を抑えながらエステル化反応を促進し、高純度のジアシルグリセロールを高い収率で得られる点から、油相水分が０．６質量％超のときは、２．５〜１０質量％であることが好ましく、３．０〜８質量％であることがより好ましく、油相水分が０．６質量％以下のときは、１．５〜７質量％であることが好ましく、２．０〜６質量％であることがより好ましい。また、エステル化反応終了時の固定化酵素の水分量は、固定化酵素を再利用した際に高純度のジアシルグリセロールの反応収率を高くできる点から、１．０〜３．０質量％、更に１．２〜２．５質量％が好ましい。

本発明では、エステル化工程に加えて、設備負荷や工業的な効率性を考慮して、１２００Ｐａ超の圧力下で、グリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含んでいてもよい。

かくして、ジアシルグリセロール純度の高い油脂が高い反応収率で得られる。また、エステル化反応に使用した固定化酵素は、高い酵素活性が維持されているため、以降のエステル化反応に再使用することができる。固定化酵素を、以降のエステル化反応に再使用する回数は、酵素活性によって相違するものの、１回以上、更に２回以上、更に５回以上、更に１０回以上であるのが好ましい。
本発明のジアシルグリセロール高含有油脂において、ジアシルグリセロールの純度は８０質量％以上であることが好ましく、更に８５〜９９．５％、更に９０〜９９％、更に９０〜９８％であることが、生理効果、工業的生産性の点から好ましい。ここで、ジアシルグリセロール純度は、［ジアシルグリセロール／（ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール）×１００］である。

また、本発明のジアシルグリセロール高含有油脂において、ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール含有量は、７０質量％以上であることが好ましく、より好ましくは７０〜９９質量％、更に７５〜９８質量％、更に７７〜９７質量％であることが、生理効果、工業的生産性の点から好ましい。

エステル化反応により得られたジアシルグリセロール高含有油脂は、必要に応じて精製工程を行って、一般の食用油脂と同様に使用することができる。

以下の実施例において、「％」は「質量％」を意味する。

〔サンプリング方法〕
フラスコ内の真空ラインを遮断し、窒素により常圧に戻してサンプリングした。その後、遠心分離が可能な試験管に反応生成物のサンプルを約３ｇ採取し、３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離を行った。沈降した触媒を除去した油相（上層）を分析した。
〔分析方法〕
（ｉ）油相水分の測定
前記〔サンプリング方法〕にて取得した油相（上層）の水分をカールフィッシャーＡＱ−３００（平沼産業製）で測定した。

（ii）酸価の測定
前記〔サンプリング方法〕にて取得した油相（上層）を日本油化学協会編「基準油脂分析試験法」２００３年版中の「酸価（２．３．１−１９９６）」に従って分析した。
以下の式（１）で、油相（上層）の遊離脂肪酸濃度を求めた。アマニ油の脂肪酸平均分子量は２８０とした。
遊離脂肪酸濃度（％）＝油相（上層）の酸価（ＡＶ）×（アマニ油の脂肪酸平均分子量／５６．１／１０）・・・・（１）

（iii）グリセリド組成の測定
ガラス製サンプル瓶に、前記〔サンプリング方法〕にて取得した油相（上層）を約１０ｍｇとトリメチルシリル化剤（「シリル化剤ＴＨ」、関東化学製）０．５ｍＬを加え、密栓し、７０℃で１５分間加熱した。これに水１．５ｍＬとヘキサン１．５ｍＬを加え、振とうした。静置後、油相（上層）をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、グリセリド組成の分析を行った。以下の式（３）で、モノアシルグリセロール＋ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロールの合計を求め、ＧＣ分析により各々の濃度を求めた。
モノアシルグリセロール＋ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール＝１００−遊離脂肪酸濃度（％）・・・・（３）

（iv）反応収率及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）純度の算出
反応５時間後のグリセリド組成から、以下の式（４）、（５）で、反応収率とＤＡＧ純度を求めた。
反応収率（％）＝ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール・・・・（４）
ＤＡＧ純度（％）＝ジアシルグリセロール／ジアシルグリセロール収率×１００・・・・（５）

（ｖ）固定化酵素の乾燥質量比率の測定
油分及び水分の付着した固定化酵素ａ質量部に対し１０質量倍のヘキサン及びアセトンで交互に各３回ずつ洗浄後、７０℃で１５時間放置することにより脱溶剤し、固定化酵素のみの質量を秤量した（ｂ質量部）。以下の式（６）で、固定化酵素の乾燥質量比率を求めた。
固定化酵素の乾燥質量比率＝ｂ／ａ（−）・・・・（６）
（ａ：油分及び水分の付着した固定化酵素質量、ｂ：固定化酵素質量）

（vi）固定化酵素の水分の測定
油分及び水分の付着した固定化酵素の水分を、カールフィッシャーＡＱ−３００（平沼産業製）で測定した。以下の式（７）で、固定化酵素の水分を求めた。
固定化酵素の水分＝（ａ−ｂ×（１−ｃ））／ｃ（％）・・・・（７）
（ａ：油分及び水分の付着した固定化酵素の水分（％）、ｂ：油相（上層）の水分（％）、ｃ：固定化酵素の乾燥質量比率（−））

〔エステル化反応に使用する原料脂肪酸〕
４０Ｌジャケット加温式攪拌槽に、脱色アマニ油２０ｋｇ、蒸留水１２ｋｇを仕込み、温度４０℃、１００ｒ／ｍｉｎで攪拌した。その後、リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ（天野エンザイム製）を２００ｇ作用させて、加水分解反応を開始した。６時間後、攪拌を停止して静置分離を行い、水相を抜き出した。その後、１００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、蒸留水１２ｋｇを仕込み、リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ（天野エンザイム製）を２００ｇ作用させて、再度、加水分解反応を開始した。１８時間後、全量を遠心分離して、油相を分離した。油相に対して蒸留水を６０ｗｔ％加えて混合、遠心分離する操作を２回繰り返し、さらに７０℃で減圧脱水して加水分解油を得た。これをアマニ脂肪酸として以下のエステル化反応に用いた。表１にアマニ脂肪酸のグリセリド組成を示した。

〔エステル化反応〕
実施例１
アマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を５００ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭ（ノボザイムズ ジャパン(株)、水分含有量２．０％）を乾燥質量基準２５ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して１８００Ｐａに調整し、３０分後、６０分後に水分を測定し、分析値を基に、圧力を１２００Ｐａに調整した。その後は、３０分おきに水分を測定して、水分値を基にして圧力を調整した。具体的には、反応開始から１２０分後に圧力を８００Ｐａに調整、１８０分後に圧力を４００Ｐａに調整、２４０分後に圧力を２４０Ｐａに調整した。３００分後に反応を終了し、グリセリド組成、酸価及び固定化酵素の水分も測定した。

実施例２
表１に示したアマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を３０００ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを乾燥質量基準１５０ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした５０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。その後は、実施例１と同様の圧力調整条件とし、分析を行った。

実施例３
表１に示したアマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を５００ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを乾燥質量基準２５ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して８００Ｐａに調整した。圧力を一定とし、３０分おきに水分を測定した。３００分後に反応を終了し、グリセリド組成、酸価及び固定化酵素の水分も測定した。

実施例４
実施例１で使用後のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭの乾燥質量比率を測定した。乾燥質量比は０．４６６であった。三日月羽根をセットした１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、反応油が付着したＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを４３．７ｇ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭ２０．４ｇ、反応油２３．３ｇ）仕込んだ。次に、表１に示したアマニ脂肪酸２００ｇで３回洗浄して、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭに付着している油分を、アマニ脂肪酸に置換した。
表１に示したアマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を４０７．４ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０の仕込み量とした。アマニ脂肪酸はＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭに付着しているアマニ脂肪酸と新たに仕込んだアマニ脂肪酸の合計である。また、脂肪酸／グリセリンの合計に対するＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭの質量比率は５％で実施例１と同じである。
１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。その後は、実施例１と同様の圧力調整条件とし、分析を行った。

比較例１
アマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を５０ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを乾燥質量基準２．５ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした２００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して１１０Ｐａに調整した。圧力を一定とし、３０分おきに水分を測定した。３００分後に反応を終了し、グリセリド組成、酸価及び固定化酵素の水分も測定した。

比較例２
アマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を５００ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを乾燥質量基準２５ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して１２００Ｐａに調整した。圧力を一定とし、３０分おきに水分を測定した。その後は、比較例１と同様の分析を行った。

比較例３
アマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を５００ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを乾燥質量基準２５ｇの仕込み量とした。三日月羽根をセットした１０００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して１５００Ｐａに調整した。圧力を一定とし、３０分おきに水分を測定した。その後は、比較例１と同様の分析を行った。

比較例４
比較例１で使用後のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭの乾燥質量比率を測定した。乾燥質量比は０．４８０であった。三日月羽根をセットした２００ｍＬの４ツ口フラスコに、反応油が付着したＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭを２ｇ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭ０．９６ｇ、反応油１．０４ｇ）仕込んだ。次に、表１に示したアマニ脂肪酸５０ｇで３回洗浄して、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭに付着している油分を、アマニ脂肪酸に置換した。
表１に示したアマニ脂肪酸及びグリセリンの合計を１９．２ｇ、脂肪酸／グリセリンのモル比２．０の仕込み量とした。アマニ脂肪酸はＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭに付着しているアマニ脂肪酸と新たに仕込んだアマニ脂肪酸の合計である。また、脂肪酸／グリセリンの合計に対するＬｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭ比率は５％で実施例１と同じである。
２００ｍＬの４ツ口フラスコに、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＲＭ ＩＭとアマニ脂肪酸を入れ、５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、グリセリンを添加して反応を開始した。直ちに、真空ポンプで減圧して２４０Ｐａに調整した。圧力を一定とし、３０分おきに水分を測定した。その後は、比較例１と同様の分析を行った。

実施例及び比較例の反応条件及び反応生成物、固定化酵素の水分の分析値を表２に示した。

また、反応経時で測定した油相（上層）の水分値と圧力条件を表３に示した。

表２、表３より明らかなように、固定化リパーゼを用いたエステル化反応において、圧力が１２００Ｐａ以下、２００Ｐａ以上の真空度下、油相水分と圧力が式（ｉ）を満たすようにエステル化反応を進めることにより、ジアシルグリセロール純度の高い反応油が収率よく得られることが確認された（実施例１〜４）。実施例１〜３では、油相水分が０．２５〜０．７％で２０分以上、油相水分が０．２５％未満で２０分以上保持され、エステル化反応終了時点の固定化酵素の水分量は３．０％以下となった。
また、実施例４に示すように、固定化リパーゼを繰り返し使用しても、得られた反応油のジアシルグリセロール純度及び反応収率は高かった。反応終了時点の固定化酵素の水分量は３．０％以下であった。
これに対して、圧力が２００Ｐａ未満の真空度においてエステル化反応させた比較例１では、得られた反応油のジアシルグリセロール純度及び反応収率を高くできたが、固定化リパーゼを繰り返し使用すると、比較例４に示したように、反応収率が大きく低下することが明らかとなった。比較例４の反応終了時点の固定化酵素の水分量は３．４％であった。
また、比較例２及び３にように、圧力が１２００Ｐａを超える真空度においては、得られた反応油は、ジアシルグリセロール純度は高くなるものの反応収率が低いことが明らかとなった。比較例２及び３では、油相水分が０．２５％未満で２０分以上保持されず、反応終了時点の固定化酵素の水分量は３．０％以上となった。

Claims (5)

1. 固定化酵素を用いて、２００〜１２００Ｐａの圧力下でグリセリンと脂肪酸又はその低級アルキルエステルとをエステル化反応させる工程を含み、当該工程の間中、油相水分（ｘ）と圧力（ｙ）の関係が、次式（ｉ）；
   （ｉ） １００００ｘ＋１００≧ｙ≧２５００ｘ−３００
   （但し、ｘ≦０．６、２００≦ｙ≦１２００）
   （ここで、ｘは油相水分（質量％）、ｙは圧力（Ｐａ）を示す。）
   を満たす、ジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
2. 前記工程において、油相水分ｘが０．２５質量％以上で２０分以上エステル化反応させ、次いで、反応生成水を反応系外に除去しながらエステル化反応を行うことで油相水分を低下させて、油相水分ｘが０．２５質量％未満で１５分以上エステル化反応させる請求項１記載のジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
3. 前記工程において、圧力を変化させながらエステル化反応を行う請求項１又は２記載のジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
4. 固定化酵素が固定化１，３位選択リパーゼである請求項１〜３のいずれか１項記載のジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
5. ジアシルグリセロール高含有油脂のジアシルグリセロールの純度が８０質量％以上である請求項１〜４のいずれか１項記載のジアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。