JP7092460B2

JP7092460B2 - 構造油脂の製造方法

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Publication number: JP7092460B2
Application number: JP2016229275A
Authority: JP
Inventors: 実加瀬; 勇樹松井
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: JP2018082676A

Description

本発明は、ドコサヘキサエン酸を含有する構造油脂の製造方法に関する。

魚油の構成成分であるエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ＤＨＡ）等のω３系高度不飽和脂肪酸はその生理活性が注目され、これを含む油脂の利用が望まれている。

従来、ドコサヘキサエン酸を含むジアシルグリセロールの製造方法として、脂肪酸とグリセリンとのエステル化反応が知られている（例えば、特許文献１、２）。エステル化反応は、アルカリ触媒等を用いる化学法とリパーゼ等の酵素を用いる酵素法に大別されるが、温和な条件で反応を行う酵素法が好ましい。

特開２００４－２０８５３９号公報特開２００４－２２２５９５号公報

一般に、酵素法に用いるリパーゼにとってドコサヘキサエン酸は基質として認識し難く、特にグリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－３位に特異性を示す１，３位選択性リパーゼの反応性は低いため（特許文献１及び２）、ドコサヘキサエン酸を含むジアシルグリセロールの製造には部分グリセリドに特異的に作用する部分グリセリドリパーゼが利用されてきた。
しかしながら、部分グリセリドリパーゼを用いてドコサヘキサエン酸とグリセリンとをエステル化反応させると、ジアシルグリセロールだけでなく、ドコサヘキサエン酸を含むトリアシルグリセロールも多く副生してしまうことが判明した。
ここで、ドコサヘキサエン酸の生理機能発現をより効果的に引き出すためには、構造油脂として、トリアシルグリセロールよりもジアシルグリセロールが好ましい。言い換えれば、同等の生理機能発現のためには、トリアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールよりも多い量を要する。そして、ドコサヘキサエン酸は不飽和結合を多く有しているために熱や光に対して安定性が極めて低く、これを豊富に含む油脂は容易に劣化臭・異臭味を発生する。従って、ドコサヘキサエン酸の量が多くなると、抗酸化剤や、劣化臭・異臭味の発生抑制のためのマスキング剤等の添加剤もより多く必要となるが、このような添加剤は少量であるほうが望ましい。他方、トリアシルグリセロールではなく、ジアシルグリセロールが選択的に生成するようになれば、逆の場合に比べ、このような添加剤の使用量を少なくすることができる。

よって、本発明の課題は、ドコサヘキサエン酸を含むトリアシルグリセロールの生成を抑え、ジアシルグリセロール内に選択的にドコサヘキサエン酸を含有する構造油脂を製造する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究を行ったところ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）に由来する１，３位選択性リパーゼを用いて、酸価の高いドコサヘキサエン酸を含む脂肪酸類とグリセリンとをエステル化反応させれば、意外にも反応が進行し、且つ、ドコサヘキサエン酸を含むトリアシルグリセロールの副生が抑えられ、ジアシルグリセロール内に選択的にドコサヘキサエン酸を含む構造油脂が得られることを見出した。

すなわち、本発明は、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の８５質量％以上をジアシルグリセロール内に含有する構造油脂の製造方法であって、
ドコサヘキサエン酸を含み、且つ酸価が１７０～１８５ｍｇＫＯＨ／ｇである脂肪酸類と、グリセリンとを、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３位選択性リパーゼを用いてエステル化反応させる工程を含む、製造方法を提供するものである。

本発明によれば、ドコサヘキサエン酸を含むトリアシルグリセロールが少なく、ジアシルグリセロール内に多くのドコサヘキサエン酸を含有する構造油脂が得られる。

本発明の製造方法は、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の８５質量％以上をジアシルグリセロール内に含有する構造油脂の製造方法であって、
ドコサヘキサエン酸を含み、且つ酸価が１７０～１８５ｍｇＫＯＨ／ｇである脂肪酸類と、グリセリンとを、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３位選択性リパーゼを用いてエステル化反応させる工程を有する。
本明細書において「油脂」は「油」と同義であり、油脂（油）を構成する物質にはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のみならずモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）やジアシルグリセロール（ＤＡＧ）も含まれる。すなわち、油脂（油）は、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールのいずれか１種以上を含むものである。

〔脂肪酸類〕
本発明で用いられる脂肪酸類は、ドコサヘキサエン酸を含み、且つ酸価が１７０～１８５ｍｇＫＯＨ／ｇである。
脂肪酸類は、脂肪酸の他、アシルグリセロール（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール）等を含んでいても良い。
脂肪酸類の酸価（ＡＶ）は１７０～１８５ｍｇＫＯＨ／ｇであるが、反応効率の点、ジアシルグリセロールに結合するＤＨＡを高くできる点から、１８４ｍｇＫＯＨ／ｇ以下であるのが好ましく、また、更に１７２ｍｇＫＯＨ／ｇ以上、更に１７４ｍｇＫＯＨ／ｇ以上、更に１７６ｍｇＫＯＨ／ｇ以上であるのが好ましい。

エステル化反応でドコサヘキサエン酸が作用しやすいように、脂肪酸類には、ドコサヘキサエン酸が３８質量％以上含まれるのが好ましく、更に４３～５８質量％含まれるのが好ましい。
また、脂肪酸類中のω３系高度不飽和脂肪酸の含有量は、同様の点から、４０質量％以上が好ましく、更に４５～６０質量％が好ましい。
本明細書において、ω３系高度不飽和脂肪酸とは、炭素数が１８以上、好ましくは２０以上であり、不飽和結合数が３以上、好ましくは５以上である長鎖脂肪酸である。ドコサヘキサエン酸の他、例えば、エイコサペンタエン酸が挙げられる。

本発明では、油脂を加水分解して脂肪酸類を得るのが好ましい。
ここで、加水分解の対象となる油脂は、植物性油脂、動物性油脂のいずれでもよいが、構成脂肪酸としてω３系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が好ましい。このような油脂としては、魚油、藻油等の微生物油、アザラシ油等の動物油が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。魚油とは、水産動物油脂であり、例えば、イワシ、ニシン、サンマ、サバ、カツオ、マグロ、クジラ、イカ、たら肝臓等の原料から採取することができる。また、藻油は、緑藻綱、珪藻綱等に属する藻類から採取することができる。
また、油脂を構成する脂肪酸中のω３系高度不飽和脂肪酸の比率を高めた所謂ω３系高度不飽和脂肪酸濃縮油を用いてもよい。構成脂肪酸中のω３系高度不飽和脂肪酸の比率を高める方法としては、従来公知の方法、例えば、リパーゼを用いてω３系高度不飽和脂肪酸の以外の脂肪酸を優先的に遊離・除去する方法や溶剤分別法等が挙げられ、いずれの方法も使用できる。

加水分解の対象となる油脂を構成する全脂肪酸に対するドコサヘキサエン酸の含有量は、エステル化反応でドコサヘキサエン酸が作用しやすいようにする点から、１０質量％以上であることが好ましく、更に１３～４１質量％、更に１６～３８質量％、更に１８～３６質量％であることが好ましい。
また、油脂中、油脂を構成する全脂肪酸に対するω３系高度不飽和脂肪酸の含有量は、同様の点から、１０質量％以上であることが好ましく、更に１５～４３質量％、更に２０～３８質量％であることが好ましい。

油脂を加水分解する方法としては、高温高圧分解法と酵素分解法が挙げられる。
高温高圧分解法とは、油脂に水を加えて、高温、高圧の条件で反応することにより、脂肪酸とグリセリンを得る方法である。また、酵素分解法とは、油脂に水を加えて、油脂加水分解酵素を触媒として用い、低温の条件で反応することにより、脂肪酸とグリセリンを得る方法である。なかでも、ω３系高度不飽和脂肪酸のトランス化抑制の点から、油脂加水分解酵素を用いた酵素分解法が好ましい。
油脂加水分解酵素としては、リパーゼが好ましく、特に制限されず、動物由来、植物由来、微生物由来のリパーゼを用いることができる。例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の起源のリパーゼが挙げられる。
なかでも、加水分解効率の点から、位置・鎖長選択性のない、所謂非選択性リパーゼを用いるのが好ましく、更にキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）によって生産される非選択性リパーゼを用いるのが好ましい。例えば、リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ－Ｋ（天野エンザイム（株）製）がある。

油脂加水分解酵素は、当該酵素を担体に固定化した固定化油脂加水分解酵素を用いることが酵素活性を有効利用できる点から好ましい。
固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。なかでも、保水力が高い点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。

固定化担体として用いる樹脂の粒子径は５０～２０００μｍが好ましく、更に１００～１０００μｍが好ましい。細孔径は１０～１５０ｎｍが好ましく、更に１０～１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、更にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、ダウケミカル社製ＤｕｏｌｉｔｅＡ－５６８）がリパーゼ吸着性向上の点から好ましい。
このとき、用いる油脂加水分解酵素量は、担体質量に対して１０～３００質量％、更に３０～２００質量％、更に５０～１５０質量％が工業的生産性の点から好ましい。固定化の際、酵素を溶液状態にするが、緩衝剤を用いてｐＨ３～７に調整して用いることが好ましい。固定化時の温度は０～６０℃、更に３～４０℃が好ましい。

固定化リパーゼの活性を高めるために、リパーゼの固定化前に予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体を担体に吸着させる処理を施しても良い。処理を施す方法としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等の有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加える方法が挙げられる。
使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８～１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していても良い脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は２種以上を併用しても良い。

油脂を加水分解反応後、好ましくは遊離脂肪酸を取り除く。遊離脂肪酸を除去する方法は、アルカリ分解、蒸留等、特に制限されないが、工業的生産性の点から、蒸留処理は薄膜式蒸発装置を用いて行うのが好ましい。薄膜式蒸発装置としては、薄膜を形成する方法によって、遠心式薄膜蒸留装置、流下膜式蒸留装置、ワイプトフィルム蒸発装置（Ｗｉｐｅｄｆｉｌｍｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）等が挙げられる。

油脂を加水分解反応後、蒸留して遊離脂肪酸を取り除いた蒸留油を、更に加水分解反応するのが好ましい。油脂加水分解酵素としては、前記と同様リパーゼが好ましい。なかでも、加水分解効率の点から、キャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）によって生産される非選択性リパーゼやアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）によって生産される１，３位を優先的に加水分解するリパーゼを用いるのが好ましい。
また、効率性の観点より、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）によって生産される部分グリセリドリパーゼを組み合わせて用いてもよい。部分グリセリドリパーゼは、モノアシルグリセロール及びジアシルグリセロールを加水分解するが、トリアシルグリセロールを加水分解し難いリパーゼである。

加水分解反応は、常法に従って行うことができる。
加水分解後は、蒸留処理を行うことなく、脂肪酸類を後述するエステル化反応に用いてもよいが、前記の酸価（ＡＶ）の範囲を満たす条件で、蒸留処理を行うことが好ましい。
蒸留処理は、上記と同様、工業的生産性の点から、薄膜式蒸発装置を用いて行うのが好ましい。
圧力は、設備コストや運転コストを小さくする点、蒸留能力を上げる点、蒸留温度を最適に選定できる点から、減圧下が好ましく、更に０．５～２００Ｐａ、更に２～１００Ｐａが好ましい。
温度は、脂肪酸の異性化抑制の点から、１８０～２８０℃、更に１９０～２６０℃、更に１９５～２５０℃が好ましい。
滞留時間は、脂肪酸の異性化抑制の点から、５～１２０秒、更に１０～９０秒、更に１５～６０秒が好ましい。

〔グリセリン〕
本発明において使用するグリセリンは、エステル化の反応性の点から、純度９５質量％以上のものが好ましい。

〔１，３位選択性リパーゼ〕
本発明で用いられるリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３位選択性リパーゼは、トリアシルグリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－３位に特異性を示すリパーゼである。当該１，３位選択性リパーゼは、当該リパーゼを担体に固定化した固定化リパーゼを用いることが、リパーゼ活性を有効利用できる点、コストの点から好ましい。
固定化担体は、ω３系高度不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸の反応性向上の点から、アクリル樹脂が好ましい。固定化１，３位選択性リパーゼは、たとえば、Ｎｏｖｏｚｙｍ４００８６（ノボザイムジャパン製）が挙げられる。

〔エステル化反応〕
本発明において、１，３位選択性リパーゼを用いて、脂肪酸類とグリセリンとをエステル化する方法は、常法に従って行うことができる。
エステル反応に用いる固定化リパーゼの量は、酵素の活性を考慮して適宜決定することができるが、反応速度を向上する点から、脂肪酸類とグリセリンの合計量１００質量部に対して、１～３０質量％、更に２～２０質量％が好ましい。

エステル化反応を行う際のグリセリン基のモル数に対する脂肪酸基のモル数の比［ＦＡ／ＧＬＹ］は、ω３系高度不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロールの副生を抑える点から、３．０以下、更に２．５以下、更に２．３以下とするのが好ましく、また、反応速度向上、蒸留残渣比率の向上の点から、０．５以上、更に１．０以上、更に１．５以上とするのが好ましい。
グリセリン基のモル数に対する脂肪酸基のモル数の比［ＦＡ／ＧＬＹ］は、下式で表される。
ＦＡ／ＧＬＹ＝（脂肪酸のモル数＋モノアシルグリセロールのモル数＋ジアシルグリセロールのモル数×２＋トリアシルグリセロールのモル数×３）／（グリセリンのモル数＋モノアシルグリセロールのモル数＋ジアシルグリセロールのモル数＋トリアシルグリセロールのモル数）

エステル化反応の反応温度は、反応速度を向上する点、酵素の失活を抑制する点から、０～１００℃、更に２０～８０℃、更に３０～６０℃とするのが好ましい。
また、反応時間は、トリアシルグリセロールへの転移反応抑制の点、工業的な生産性の点から、１５時間以内、更に１～１２時間、更に２～１０時間が好ましい。

エステル化反応は、反応生成水を反応系外に除去しながら行われることが好ましい。例えば、減圧；ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用；反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法により、系外に除去されるのが好ましい。

１，３位選択性リパーゼと原料（脂肪酸類とグリセリン）の接触手段としては、浸漬、攪拌、固定化リパーゼを充填したカラムにポンプ等で通液する方法等が挙げられる。攪拌する場合、生産効率の点、リパーゼの破砕抑制の点から、１０～１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更に５０～７００ｒ／ｍｉｎ、更に１００～６００ｒ／ｍｉｎが好ましい。

反応系内の圧力は減圧下が好ましく、１～１００００Ｐａ、更に１０～５０００Ｐａ、更に１００～３０００Ｐａが好ましい。

エステル化反応を行った後の反応油中には、油脂、即ちトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールと、未反応物として脂肪酸が含まれる。
反応油の酸価（ＡＶ）は、ジアシルグリセロールに結合するＤＨＡを高くする点、工業的な生産の点から、２０～６０ｍｇＫＯＨ／ｇ、更に２５～５５ｍｇＫＯＨ／ｇ、更に３０～５０ｍｇＫＯＨ／ｇであることが好ましい。
また、反応油中のジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールの合計含有量は、生理効果、工業的生産性の点から、４５～６７質量％、更に４８～６５質量％であることが好ましい。

本発明では、エステル化反応後、軽質留分を蒸発させてトリアシルグリセロールとジアシルグリセロールを残渣分として得る蒸留処理を行って、エステル化反応油からモノアシルグリセロール及び脂肪酸を除去するのが好ましい。
蒸留処理は薄膜式蒸発装置を用いて行うのが好ましい。
圧力は、揮発性の有臭成分を除去する点、設備コストや運転コストを小さくする点、蒸留能力を上げる点、蒸留温度を最適に選定できる点から、減圧下が好ましく、更に０．５～２００Ｐａ、更に２～１００Ｐａが好ましい。
温度は、揮発性の有臭成分を除去する点、風味を良好とする点から、１８０～２８０℃、更に１９０～２６０℃、更に１９５～２５０℃が好ましい。
滞留時間は、揮発性の有臭成分を除去する点、風味を良好とする点から、５～１２０秒、更に１０～９０秒、更に１５～６０秒が好ましい。

本発明の処理の結果、ドコサヘキサエン酸を含むトリアシルグリセロールの生成が抑制されて、ジアシルグリセロール内に選択的にドコサヘキサエン酸を含む構造油脂が得られる。本発明の構造油脂は、従来のドコサヘキサエン酸を含有する油脂に比べて、少ない使用量で高い生理機能発現が期待される。
本発明の構造油脂においては、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の８５質量％以上がジアシルグリセロール内に含まれるが、このジアシルグリセロール内に含まれるドコサヘキサエン酸の割合は、生理機能発現の観点から、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の８７質量％以上、更に８９質量％以上が好ましい。
ジアシルグリセロール内に含まれるドコサヘキサエン酸の割合は、油脂を構成する脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の総量に対する、ジアシルグリセロールを構成するドコサヘキサエン酸の割合を百分率で表したものである。詳細は後記実施例に記載した。

構造油脂を構成する脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の含有量は、生理機能発現に有利に働く点、油脂特性の点から、１８～６８質量％、更に２３～５８質量％、更に２８～４８質量％が好ましい。
また、構造油脂を構成する脂肪酸中のω３系高度不飽和脂肪酸の含有量は、生理機能発現に有利に働く点から、２０～７０質量％、更に２５～６０質量％であることが好ましい。

本発明の構造油脂において、ジアシルグリセロールの含有量は、生理機能発現の点から、６０～９５質量％、更に６５～９０質量％が好ましい。
また、本発明の構造油脂において、トリアシルグリセロールの含有量は、生理機能発現の点から、５～４０質量％、更に１０～３５質量％が好ましい。

本発明の方法により得られる構造油脂は、必要に応じて精製工程を行って、一般の食用油脂と同様に使用することができる。

以下の実施例において、「％」は「質量％」を意味する。
〔原料油脂〕
原料油脂として、表１に示すマグロ原油を用いた。なお、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有量の含有量、酸価（ＡＶ）、グリセリド組成は、次に示す方法にて測定した。

〔分析方法〕
（ｉ）ＤＨＡ含有量の測定
日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「メチルエステル化法（三フッ化ホウ素メタノール法）（２．４．１．２－１９９６）」に従って、試料を脂肪酸メチルエステルし、得られたサンプルをガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供した。トリヘンイコサノイン（和光純薬工業製）を内部標準物質として、ＤＨＡ（ＬａｒｏｄａｎＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）の検量線を作成した。次に、試料に内部標準物質を添加して分析し、内部標準物質のピークと検量線からＤＨＡの含有量を求めた。

（ii）酸価の測定
日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「酸価（２．３．１－１９９６）」に従って測定した。

（iii）グリセリド組成の測定
「グリセリド組成」は、ガラス製サンプル瓶に、サンプル１０ｍｇとトリメチルシリル化剤（「シリル化剤ＴＨ」、関東化学製）０．５ｍＬを加え、密栓した後、７０℃で１５分間加熱した。これに蒸留水１．０ｍＬ、ヘキサン２．０ｍＬを加えて、混合後、ヘキサン層をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、グリセリド組成の分析を行った。

（iv）蒸留残渣中のＴＡＧとＤＡＧの分離方法
固相カラム（Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８５ｇ、Ｗａｔｅｒｓ製）にメタノール２０ｍＬを通液しコンデショニングした。その後、アセトニトリル２ｍＬに試料０．２ｇを溶解したサンプル溶液を固相カラムにロードした。次に、メタノール１００ｍＬを固相カラムにロードし、ＤＡＧフラクションを得た。ＤＡＧフラクションは、脱溶剤して秤量し、ＤＨＡ含有量を分析した。さらに、アセトン３０ｍＬを固相カラムにロードし、ＴＡＧフラクションを得た。同様に、ＴＡＧフラクションは、脱溶剤して秤量し、ＤＨＡ含有量を分析した。

〔ＤＨＡ比率の算出〕
ＤＨＡ比率（％）を次式（１）より算出した。
ＤＨＡ比率（質量％）
＝（残渣中ＤＡＧ［％］×ＤＡＧ中のＤＨＡ［％］）／（残渣中ＤＡＧ［％］×ＤＡＧ中のＤＨＡ［％］＋残渣中ＴＡＧ［％］×ＴＡＧ中のＤＨＡ［％］）×１００（１）

〔固定化１，３位選択性リパーゼ〕
リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来のＮｏｖｏｚｙｍ４００８６（ノボザイムジャパン製）を用いた。

〔固定化リパーゼＡＹの調製〕
リパーゼを固定化する担体としてＤｕｏｌｉｔｅＡ－５６８（佐々木化学製）を用いた。担体１０００ｇをＮ／１０のＮａＯＨ溶液１０Ｌ中で１時間攪拌し、ろ過した。その後、１０Ｌのイオン交換水中で１時間攪拌しろ過、５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ＬでｐＨ平衡化を２時間行いろ過した。その後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ＬでｐＨ平衡化を２時間しろ過する操作を２回行なった。この後、エタノール５Ｌでエタノール置換を３０分行いろ過した。その後、－３℃で析出する高融点成分を除いた大豆脂肪酸を１０００ｇ含むエタノール５Ｌを加え３０分間、脂肪酸を担体に吸着させ、ろ過した。その後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）５Ｌで３０分ずつ４回洗浄し、エタノールを除去し、ろ過して担体を回収した。その後市販のキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）に由来するリパーゼ（リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ－Ｋ、天野エンザイム製）１０００ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）９０００ｇに溶解した酵素液と５時間接触させ、リパーゼの固定化を行なった。その後、ろ過し、リパーゼが固定化された担体を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０Ｌで洗浄を行なうことにより、固定化していない酵素やタンパクを除去した。その後、マグロ原油を４０００ｇ加え１２時間攪拌し、ろ過して固定化リパーゼＡＹを得た。以上の操作はいずれも２０℃で行なった。その後、ろ過してヘキサンで油脂を洗浄し、脱溶剤して固定化リパーゼＡＹを得た。

〔固定化リパーゼＱＬＭの調製〕
固定化リパーゼＡＹと同じ製造法で、リパーゼの種類をアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来のリパーゼ（リパーゼＱＬＭ、名糖産業製）に変えて、固定化リパーゼＱＬＭを得た。

〔固定化リパーゼＧの調製〕
固定化リパーゼＡＹと同じ製造法で、リパーゼの種類をペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）に由来する部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ「アマノ」５０、天野エンザイム製）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を酢酸緩衝液（ｐＨ５）変えて、固定化リパーゼＧを得た。

〔原料脂肪酸１の調製〕
＜１．酵素加水分解反応１＞
表１に示すマグロ原油を２０００ｇ、蒸留水を２０００ｇ仕込み、温度４０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、固定化リパーゼＡＹを２００ｇ添加しバッチ攪拌反応により加水分解反応を２時間行った。固定化酵素を濾別した後、遠心分離（日立工機製、ローターＲ９Ａ、８０００ｒ／ｍｉｎ×１０ｍｉｎ）して甘水を分離した。その後、油相を減圧脱水してマグロ原油分解油を得た。この操作を２回繰り返し、マグロ原油分解油を得た。

＜２．蒸留１＞
上記１で得た、マグロ原油分解油を、ワイプトフィルム蒸発装置（２－０３型：神鋼環境ソリューション製）を用いて、温度設定２３０℃、真空＜２Ｐａ、流量１５０ｍＬ／ｈの条件で薄膜蒸留処理し、遊離脂肪酸を留去して、残渣にＤＨＡ及びＥＰＡを濃縮したグリセリドを得た。

＜３．酵素加水分解反応２＞
上記２で蒸留した残渣１５００ｇ、蒸留水１５００ｇを４ツ口フラスコに仕込み、温度４０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、固定化リパーゼＱＬＭを１５０ｇと固定化リパーゼＧを１５０ｇ添加し、バッチ攪拌反応により加水分解反応を２４時間行った。固定化リパーゼを濾別後、油相を減圧脱水した。

＜４．蒸留２＞
上記３で得た、酵素加水分解反応油を、ワイプトフィルム蒸発装置（２－０３型：神鋼環境ソリューション製）を用いて、温度設定２３０℃、真空＜２Ｐａ、流量１５０ｍＬ／ｈの条件で薄膜蒸留処理し、残渣成分のＭＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧを除いて、原料脂肪酸１を得た。表２に、分析値を示した。

〔原料脂肪酸２の調製〕
＜酵素加水分解反応＞
〔原料脂肪酸１の調製〕の＜１．酵素加水分解反応１＞及び＜２．蒸留１＞まで、同じ操作を行い、ＤＨＡ及びＥＰＡを濃縮したグリセリド組成物を得た。蒸留した残渣１５００ｇ、蒸留水１５００ｇを４ツ口フラスコに仕込み、温度４０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌しながら、固定化リパーゼＡＹを１５０ｇと固定化リパーゼＧを１５０ｇ添加し、バッチ攪拌反応により加水分解反応を７２時間行った。固定化リパーゼを濾別後、油相を減圧脱水して、原料脂肪酸２を得た。表２に、分析値を示した。

〔実施例１〕
＜１．エステル化反応＞
マグロ油由来の原料脂肪酸１を４ツ口フラスコに仕込み、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の固定化１，３位選択性リパーゼを原料脂肪酸１とグリセリンの合計に対して５％添加し、温度５０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌した。その後、グリセリンを４ツ口フラスコに仕込み、真空度４００Ｐａの条件でエステル化反応を行った。４ツ口フラスコ内のグリセリンに対する脂肪酸のモル比（ＦＡ／ＧＬＹ）は２とした。８時間後、リパーゼを濾別して、エステル化反応油を得た。

＜２．エステル化反応油の蒸留＞
上記１．で得たエステル化反応油を、ワイプトフィルム蒸発装置（２－０３型：神鋼環境ソリューション製）を用いて、温度設定２３０℃、真空＜２Ｐａ、流量１２０ｍＬ／ｈの条件で薄膜蒸留処理した。残渣（ＤＡＧ+ＴＡＧ）と留分（ＦＡ+ＭＡＧ）の質量から分離比率を求めた。蒸留残渣を固相カラムでＤＡＧとＴＡＧを分離し、それぞれのＤＨＡ含有量を測定した。

〔実施例２〕
マグロ油由来の原料脂肪酸１とグリセリンの仕込みを変えて、グリセリンに対する脂肪酸のモル比（ＦＡ／ＧＬＹ）を２．５とした以外は、実施例１と同じ条件でエステル化反応と蒸留を行った。

〔比較例１〕
＜１．エステル化反応＞
マグロ油由来の原料脂肪酸２を４ツ口フラスコに仕込み、固定化リパーゼＧ（部分グリセリド選択性）を原料脂肪酸２とグリセリンの合計に対して１０％添加し、温度４０℃、４００ｒ／ｍｉｎで攪拌した。その後、グリセリンを４ツ口フラスコに仕込み、真空度４００Ｐａの条件でエステル化反応を行った。４ツ口フラスコ内のグリセリンに対する脂肪酸のモル比（ＦＡ／ＧＬＹ）は１．５とした。１６５時間後、固定化リパーゼＧを濾別して、エステル化反応油を得た。

＜２．エステル化反応油の蒸留＞
上記１で得たエステル化反応油を、ワイプトフィルム蒸発装置（２－０３型：神鋼環境ソリューション製）を用いて、温度設定２３０℃、真空＜２Ｐａ、流量１２０ｍＬ／ｈの条件で薄膜蒸留処理した。蒸留残渣を固相カラムでＤＡＧとＴＡＧを分離し、それぞれのＤＨＡ含量を測定した。

〔比較例２〕
マグロ油由来の原料脂肪酸２とグリセリンの仕込みを変えて、グリセリンに対する脂肪酸のモル比（ＦＡ／ＧＬＹ）を２としてエステル化反応を２５時間行った以外は、比較例１と同じ条件でエステル化反応と蒸留を行った。

〔比較例３〕
マグロ油由来の原料脂肪酸２とグリセリンの仕込みを変えて、グリセリンに対する脂肪酸のモル比（ＦＡ／ＧＬＹ）を２．５としてエステル化反応を１８時間行った以外は、比較例１と同じ条件でエステル化反応と蒸留を行った。

エステル化反応条件、反応油の酸価、蒸留の分離比率、及び蒸留残渣の分析値を表３に示す。

表３より明らかなように、ＤＨＡを含む脂肪酸類をリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３位選択性リパーゼでエステル化反応すると蒸留残渣は４５～６７％得られ、また、ＤＨＡはＴＡＧではなく主にＤＡＧに多く含まれていた。
これに対して、ＤＨＡを含む脂肪酸類を固定化リパーゼＧ（部分グリセリド選択性）でエステル化反応すると蒸留残渣は多かったが、ＤＨＡはＤＡＧに選択的に含まれず、ＴＡＧにも多く含まれていた。

Claims

トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールからなり、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸の８５質量％以上をジアシルグリセロール内に含有する構造油脂の製造方法であって、
ドコサヘキサエン酸を３８～５８質量％含み、且つ酸価が１７０～１８５ｍｇＫＯＨ／ｇである脂肪酸類と、グリセリンとを、グリセリン基のモル数に対する脂肪酸基のモル数の比［ＦＡ／ＧＬＹ］が１．０以上３．０以下となる範囲で、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｕｒｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３位選択性リパーゼを用いて２０～８０℃で１～１２時間エステル化反応させる工程を含む、製造方法。
脂肪酸類が蒸留処理したものである請求項１記載の構造油脂の製造方法。
脂肪酸類がドコサヘキサエン酸を４３～５８質量％含有するものである請求項１又は２記載の構造油脂の製造方法。
エステル化反応時間が２～１０時間である請求項１～３のいずれか１項記載の構造油脂の製造方法。
脂肪酸類とグリセリンとを、グリセリン基のモル数に対する脂肪酸基のモル数の比［ＦＡ／ＧＬＹ］が１．５以上２．５以下となる範囲でエステル化反応させる請求項１～４のいずれか１項記載の構造油脂の製造方法。
エステル化反応により酸価が２０～６０ｍｇＫＯＨ／ｇである反応油を得る請求項１～５のいずれか１項記載の構造油脂の製造方法。
構造油脂が油脂を構成する脂肪酸中にドコサヘキサエン酸を２３～４８質量％含有するものである請求項１～６のいずれか１項記載の構造油脂の製造方法。
構造油脂がジアシルグリセロールを６０～９５質量％含有するものである請求項１～７のいずれか１項記載の構造油脂の製造方法。