CN113881718B - 一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法及应用 - Google Patents

一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法及应用，脂肪酸的生物合成及酶催化技术领域，本发明采用使用的油脂为DHA和EPA的总含量≤8％的油脂，甘油、脂肪酶于反应器中，在40～70℃温度条件下，反应体系压力0～500Pa条件下进行甘油解反应，反应3～20h后，回收脂肪酶，获得油脂混合物；取上述得到的油脂混合物，加入水溶液、脂肪酶，在pH＝5～8，反应温度为30～60℃的环境下进行水解反应，反应0.5～20h后，回收脂肪酶和水溶液，获得富含游离脂肪酸的油脂组合物，水解率可以达到80％以上，水解反应结束之后，脂肪酶水相可同时回收重复利用，既降低生产成本，又减少废水的排放。

Description

一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方 法及应用
技术领域
本发明属于脂肪酸的生物合成及酶催化技术领域，具体涉及一种游离脂肪酸的制备方法。
背景技术
以植物油料加工制备游离脂肪酸是随着制皂工业的兴起而发展的，在我国已有数十年历史，现如今，游离脂肪酸已经成为了重要的有机化工和精细化工的原料，以脂肪酸为原料生产的下游衍生物，广泛应用于纺织印染、食品、医药、日用化工等各种行业。例如蓖麻油酸是重要的化工原料癸二酸的中间体，脂肪酸可用于丁苯橡胶生产中的乳化剂和其它表面活性剂；还可用于生产高级香皂、透明皂、硬脂酸及各种表面活性剂的中间体。
脂肪酸的生产方法主要由油脂水解法进行工业生产，目前我国规模较大的脂肪酸厂普遍采用加压塔式无催化水解工艺，但该方法技术复杂，引进装置投资较大, 对原料的要求高。采用碱催化水解法可降低装置要求，反应温度相对温和，但所得产物有异味而且颜色深，因此工业上尝试采用酶法制备游离脂肪酸。相对于传统的方法，利用脂肪酶进行催化的最大的优点就是可以在常温常压或是稍微偏高的温度下获得高纯度的产品。其产品色泽基本上与原料油脂相同，工艺简单，省能，产品纯度高。
目前，利用脂肪酶作为催化剂水解天然油脂已经进行了广泛的研究，例如脂肪酶Lipozyme TL 100L水解地沟油制备脂肪酸（彭元怀,卢美莹,李海雁.脂肪酶水解地沟油制备脂肪酸的研究[J].粮食与油脂,2017,30(07):69-72.），超声波辅助脂肪酶Lipozyme TLIM 水解茶叶籽油（向小乐,黄群,杨万根,余佶,沈旭,向勇平,麻成金.超声波辅助脂肪酶水解茶叶籽油条件的优化与动力学研究[J].食品与发酵工业,2015,41(02):141-146.），脂肪酶水解椰子油（武林贺,白新鹏,吴谦,徐小梦,马若影,李雪.脂肪酶水解椰子油动力学研究[J].食品研究与开发,2016,37(16):65-69）等。然而，目前酶法制备游离脂肪酸的问题在于油脂水解率在70%左右，产物中还剩较多甘油酯没有被水解，脂肪酶成本高。
发明内容
鉴于现有技术中有关游离脂肪酸的制备方法中存在的问题。本发明提供了一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，油脂水解率可达到80%以上。
具体的本发明提供了如下技术方案：
作为本发明的一个方面，提供一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，使用的油脂为DHA和EPA的总含量≤8%的油脂，具体包括以下步骤：
S1、取所述的油脂、甘油、脂肪酶于反应器中，在40~70℃温度条件下，反应体系压力0~500 Pa条件下进行甘油解反应，反应3~20h后，回收脂肪酶，获得油脂混合物；
S2、取S1中得到的所述油脂混合物，加入纯水或缓冲溶液、脂肪酶，在pH=5~8，反应温度为30~60℃的环境下进行水解反应，反应0.5~20h后，回收脂肪酶和水溶液，获得富含游离脂肪酸的油脂组合物；
其中，S1中所述油脂与所述甘油的质量比为1:1~35:1；S2中所述油脂混合物与所述水溶液的质量比为15:1~50:1；
S1中所述脂肪酶来源于Candida antarctica、Rhizomucor miehei、Rhizopus oryzae的脂肪酶中的至少一种；
S2中所述脂肪酶来源于Candida cylindracea、Burkaholderia cepacian、Penicillium camembertii、Rhizopus oryzea的脂肪酶中的至少一种。
在本发明的可选实施方式中，S1中所述的脂肪酶包括来源于Candida antarctica的Lipozyme 435、Novozym 435，来源于Rhizomucor miehei的Lipozyme RM IM、LipozymeRM，来源于Rhizopus oryzae的Lipase DF-15中的至少一种。
在本发明的可选实施方式中，S2中所述的脂肪酶包括来源于Candida cylindracea的AY "Amano" 400SD、Lipase AY-30SD、Lipase AYS，来源于Burkaholderia cepacian的PS "Amano" SD、Lipase PS，来源于Penicillium camembertii的Lipase G-50SD、Lipase G "Amano" 50，来源于Rhizopus oryzea的DF "Amano" 15、Lipase MER，以及来源于Burkaholderia cepacian的lipase AK "Amano"、Lipase AK中的至少一种。
在本发明的可选实施方式中，S2中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬盐缓冲溶液中的一种或者多种。
在本发明的可选实施方式中，所述的磷酸盐缓冲溶液或柠檬盐缓冲溶液浓度为0.05~0.5 mol/L。
在本发明的可选实施方式中，所述DHA和EPA的总含量≤8%的油脂，包括大豆油，菜籽油，葵花籽油，玉米油，花生油或棕榈油中的至少一种。
在本发明的可选实施方式中，S1中所述油脂与所述甘油的质量比为15:1~30:1；S2中所述油脂混合物与所述纯水或缓冲溶液的质量比为20:1~25:1。
在本发明的可选实施方式中，S1中所述反应时间为8~12 h；S2中所述反应时间为4~6 h。
在本发明的可选实施方式中，S1中所述脂肪酶的用量为所述油脂和所述甘油总质量的0.01%~10%；S2中所述脂肪酶的用量为所述油脂混合物质量的0.01%~20%。
在本发明的可选实施方式中，S2中所述脂肪酶的用量为所述油脂混合物质量的0.2%~10%。
在本发明的可选实施方式中，S1中所述反应温度为50~65℃，S2中所述反应的温度为35~45℃。
作为本发明的第二个方面，提供一种通过所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法得到的富含游离脂肪酸油脂组合物在食品、医药或日化领域中的应用。
本发明有益效果：
本发明提供的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，通过使用DHA和EPA的总含量≤8%的天然油脂，配合本发明中使用的脂肪酶能快速水解甘油酯，再调控体系中油脂、甘油、脂肪酶的用量，对反应温度、反应时间以及体系PH值的调控，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物，油脂的水解率可以达到80%以上；
本发明采用的脂肪酶为游离态或者固定化态，反应结束之后，离心分离得到水相和油相，脂肪酶和水相可同时回收重复利用，既降低了生产成本，又减少了废水的排放。
附图说明
图1为本发明实施例1玉米油两步前后的液相色谱（示差检测器）图，其中，a为玉米油反应前的液相色谱图，b为玉米油水解后的液相色谱图。
图2为本发明实施例5玉米油两步前后的液相色谱（示差检测器）图，其中，a为玉米油反应前的液相色谱图，b为玉米油水解后的液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明中涉及的产品表征分析：
上述油脂组合物的表征方法如下：
参考 Zhang 等{Zhang Y, Wang X, Zou S, et al. Synthesis of 2-docosahexaenoylglycerol by enzymatic ethanolysis [J]. Bioresour Technol,2018, 251(334-340)}的方法，利用 HPLC-RID 对反应后体系中的脂质成分进行定量分析。具体方法如下：取反应后的产物30 mg，加入1 mL流动相（正己烷：异丙醇：甲酸体积比=15:1: 0.003）溶解，过膜，液相色谱检测，色谱条件为：色谱柱 Sepax HP-Silica（4.6 mm×250mm×5 μm），柱温 30℃；样品浓度为 10 mg/mL，进样量为 15 μL；流动相正己烷：异丙醇：甲酸之比为 15:1:0.03（v/v/v），流速为 1 mL/min。各脂质组分通过标准品定性，样品浓度与峰面积呈线性关系，各物质的相对组成通过面积归一法表示（%）。
甘油脂的水解率分析
水解率的计算公式如下式（1）所示：
式（1）。
本发明提供了实施例1和实施例5的的检测结果附图，其他实施例和对比例采用同样的检测方法，本领域技术人员可以通过本发明提供的检测方法，直接地毫无疑义地确定本发明实施例的内容。
实施例1
S1：准确称取玉米油样品15.0 g，加入1.0 g甘油，并添加0.6g来源于Candida antarctica的脂肪酶Lipozyme 435催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应7h，控制反应体系的压力为200 Pa, 反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme 435，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物10.0 g, 加入1.0 g pH为7纯水溶液和和0.8 g源于Rhizopus oryzea的DF "Amano" 15，混合均匀，封口，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应6 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶Lipase G-50SD和水溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物，如图1。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为86.9%。
实施例2
S1：准确称取玉米油样品15.0 g，加入1.0 g甘油，并添加0.0016g源于Candida antarctica的脂肪酶Lipozyme 435催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应12 h，控制反应体系的压力为200 Pa, 反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme435，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物10.0 g, 加入0.5 g pH为7纯水溶液和和0.02 g来源于Penicillium camembertii的Lipase G-50SD，混合均匀，封口，控制反应温度为45℃，在磁力搅拌下反应6 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶Lipase G-50SD和水溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为82.1%。
实施例3
S1：准确称取玉米油样品30.0 g，加入1.0 g甘油，并添加3.1g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为40℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为500 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物25.0 g, 加入1.0 g pH为8，浓度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和2.5g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应4 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano" SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为89.2%。
实施例4
S1：准确称取玉米油样品10.0 g，加入1.0 g甘油，并添加0.66g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为50℃，在磁力搅拌下反应14h，控制反应体系的压力为50 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物8.0 g, 加入0.5 g pH为8，浓度为0.3 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和1.2 g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应10 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano" SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为91.2%。
实施例5
S1：准确称取玉米油样品28.0 g，加入1.0 g甘油，并添加2.0g来源于Rhizopus oryzea的脂肪酶DF "Amano" 15催化其反应，控制反应温度为60℃，在磁力搅拌下反应11h，控制反应体系的压力为80 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶DF "Amano" 15，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物15.0 g, 加入0.5 g pH为7磷酸盐缓冲溶液和和0.16 g源于Candida cylindracea的脂肪酶AY "Amano" 400SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应2 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶AY "Amano" 400SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物，如图2。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为92.0%。
实施例6
S1：准确称取玉米油样品18.0 g，加入1.0 g甘油，并添加1.0g来源于Candida antarctica的脂肪酶Novozym 435 催化其反应，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应10 h，控制反应体系的压力为180 Pa，反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Novozym 435，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物10.0 g, 加入2.0 g pH为7磷酸盐缓冲溶液和0.4 g来源于Penicillium camembertii的Lipase G-50SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应8 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶Lipase G-50SD，脂肪酶Lipase G-50SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为83.3%。
实施例7（应用实施例）
取24.0 g富含游离脂肪酸的油脂组合物，加入1.0 g甘油，并添加1.21g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应8 h，控制反应体系的压力为100 Pa，反应结束后，回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，在0.5Pa、180℃进行分子蒸馏，得到的产物中，甘二酯的含量为70.3%。甘二酯可应用于食品添加剂、医疗医药、化妆品等领域。
实施例8（应用实施例）
蓖麻油的主要成分是蓖麻油酸，即12-羟基十八烯酸甘油酯，约90%，以蓖麻油为原料，采用本发明提供的制备方法得到富含蓖麻油酸的油脂组合物，可用来生产各种高档涂料，蓖麻油酸还是重要的化工原料癸二酸的中间体。
实施例9
S1：准确称取猪油样品25.0 g，加入1.0 g甘油，并添加3.1g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应20h，控制反应体系的压力为0 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物25.0 g, 加入1.0 g pH为8，浓度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和2.5g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应4 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano" SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为88.3%。
对比例1（与实施例1对比）
取玉米油样品10.0 g, 加入1.0 g pH为7纯水溶液和和0.8 g源于Rhizopus oryzea的DF "Amano" 15，混合均匀，封口，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应6 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶DF "Amano" 15和水溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为34.8%。
对比例2（与实施例6对比）
取玉米油样品10.0 g, 加入2.0 g pH为7磷酸盐缓冲溶液和0.4 g来源于Penicillium camembertii的Lipase G-50SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应8 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶Lipase G-50SD，脂肪酶Lipase G-50SD和磷酸盐缓冲溶液，得到油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为2.4%。
对比例3（与实施例1对比）
S1：准确称取玉米油样品15.0 g，加入0.05g甘油，并添加0.0002g来源于Candida antarctica的脂肪酶Lipozyme 435催化其反应，控制反应温度为65℃，在磁力搅拌下反应7h，控制反应体系的压力为200 Pa, 反应结束后，过滤回收非特异性脂肪酶Lipozyme 435，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物10.0 g, 加入1.0 g pH为7纯水溶液和和0.8 g源于Rhizopus oryzea的DF "Amano" 15，混合均匀，封口，控制反应温度为55℃，在磁力搅拌下反应6 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶DF "Amano" 15和水溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为30.2%。
对比例4（与实施例3对比）
S1：准确称取玉米油样品30.0 g，加入1.0 g甘油，并添加3.1g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为90℃，在磁力搅拌下反应8h，控制反应体系的压力为50 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物25.0 g, 加入1.0 g pH为8，浓度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和2.5g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为30℃，在磁力搅拌下反应4 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano" SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为70.0%。
对比例5（与实施例4对比）
S1：准确称取玉米油样品10.0 g，加入1.0 g甘油，并添加0.66g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为50℃，在磁力搅拌下反应14h，控制反应体系的压力为50 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物8.0 g, 加入0.5 g pH为10，浓度为0.3 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和1.2 g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应10 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano" SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为72.2%。
对比例6（与实施例4对比）
S1：准确称取玉米油样品10.0 g，加入1.0 g甘油，并添加0.66g来源于Rhizomucor miehei的脂肪酶Lipozyme RM IM催化其反应，控制反应温度为50℃，在磁力搅拌下反应14h，控制反应体系的压力为50 Pa，反应结束后，过滤回收脂肪酶Lipozyme RM IM，产物经水洗、离心脱除甘油，得到油脂混合物。
S2：取上述油脂混合物8.0 g, 加入0.5 g pH为8，浓度为0.3 mol/L的磷酸盐缓冲溶液和1.2 g来源于Burkaholderia cepacian的脂肪酶PS "Amano" SD，混合均匀，封口，控制反应温度为35℃，在磁力搅拌下反应1 h。反应结束后，离心分离，回收脂肪酶PS "Amano"SD和磷酸盐缓冲溶液，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物。经HPLC-RID检测，计算得到的甘油酯水解率为32.4%。
通过以上实施例及对比例可以看出，本发明提供的两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物，采用DHA和EPA的总含量≤8%的天然油脂，配合本发明中使用的脂肪酶能快速水解甘油酯，再调控体系中油脂、甘油、脂肪酶的用量在本发明的限定范围内，对反应温度、反应时间以及体系PH值控制在本发明限定的范围内，得到富含游离脂肪酸的油脂组合物，油脂的水解率有显著提升，可以达到80%以上；在本发明的限定范围外，水解率均有明显下降。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修 改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取所述的油脂、甘油、脂肪酶于反应器中，在40~70℃温度条件下，反应体系压力0~500 Pa条件下进行甘油解反应，反应7~20h后，回收脂肪酶，获得油脂混合物；所述的油脂为DHA和EPA的总含量≤8%的油脂；
S2、取S1中得到的所述油脂混合物，加入纯水或者缓冲溶液、脂肪酶，在pH=5~8，反应温度为30~60℃的环境下进行水解反应，反应2~20h后，回收脂肪酶和水溶液，获得富含游离脂肪酸的油脂组合物；
其中，S1中所述的油脂与所述甘油的质量比为10:1~30:1；S2中所述油脂混合物与所述水溶液的质量比为15:1~50:1；
S1中所述脂肪酶选自来源于Candida antarctica、Rhizomucor miehei、Rhizopus oryzae的脂肪酶；
S2中所述脂肪酶选自来源于Candida cylindracea、Burkaholderia cepacian、Penicillium camembertii、Rhizopus oryzea的脂肪酶；
S1中所述脂肪酶的用量为所述油脂和所述甘油总质量的0.01%~10%；S2中所述脂肪酶的用量为所述油脂混合物质量的0.01%~15%。
2.根据权利要求1所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，S2中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬盐缓冲溶液中的一种或者多种。
3.根据权利要求2所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液或柠檬盐缓冲溶液浓度为0.05~0.5 mol/L。
4.根据权利要求1所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，所述DHA和EPA的总含量≤8%的油脂，包括大豆油，菜籽油，葵花籽油，玉米油，花生油、棕榈油或猪油中的至少一种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，S1中所述油脂与所述甘油的质量比为15:1~30:1；S2中所述油脂混合物与所述纯水或缓冲溶液的质量比为20:1~25:1。
6.根据权利要求1所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，S1中所述反应时间为8~12 h；S2中所述反应时间为4~6 h。
7.根据权利要求1所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，S2中所述脂肪酶的用量为所述油脂混合物质量的0.2%~10%。
8.根据权利要求1~4，6~7中任一项所述的使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法，其特征在于，S1中所述反应温度为50~65℃，S2中所述反应的温度为35~45℃。
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