CN107012136A - 一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，所述方法是：将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶Lipozyme TL 100L酶液，在4℃下加入有机溶剂，静置沉淀1h后离心，取上清液再加入交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固载化，反应完全后，真空干燥，获得固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；本发明固定化脂肪酶制备条件简单，操作方便。固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的酶活力和批次稳定性远高于商品化酶Lipozyme TL IM，适合工业化应用。

Description

一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法及应用于豆油脱臭馏出物甲酯化反应。
(二)背景技术
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶，在动植物和微生物中普遍存在，能催化酯类化合物的分解、酯化、酯交换、内酯合成、肽合成、酯聚合及酰化反应等，是研究和应用最多的酶类之一。利用脂肪酶在有机相催化的反应可以合成多种高价值产品，如光学活性药物、有特殊生理功能的构造脂质等、精细化学品、手性化合物和生物柴油等方面有巨大的应用价值。
脂肪酶最突出的特点就是能够在油水界面催化反应，与化学催化剂相比，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等优点。然而，游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点。固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比最大的优势在于：固定化脂肪酶可以重复使用、连续操作、简化和更加高效地催化反应。因此脂肪酶的固定化研究具有重大的理论价值和实际意义。豆油脱臭馏出物(俗称DD油)是大豆油精炼过程中的副产品，主要含游离脂肪酸、甘油酯、生育酚、植物甾醇、甾醇酯及其他氧化分解产物等，是提取生育酚即维生素E及植物甾醇等具有较高生理活性物质的优质原料。从豆油脱臭馏出物中提取生育酚，通常先对其进行甲酯化预处理，甲酯化后，豆油脱臭馏出物的游离脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，沸点降低，有利于维生素E的分离。
目前，豆油脱臭馏出物甲酯化工艺采用的催化剂有浓硫酸、浓盐酸、离子交换树脂及各种生物酶。采用化学法制备天然VE，浓硫酸和浓盐酸的价格低、反应快、效果好，酯化率可达95％以上，但在工业生产中，对设备的腐蚀比较严重。近年来，采用各种生物酶进行酯化反应的研究越来越多，如脂肪酶Novozym435，Lipozyme TL IM等。生物催化剂相比化学催化剂有众多优势，如:高效的催化性能、保护天然VE的抗氧化性、不会产生大量的工业废水、低温低压的操作环境以及较低的设备成本等，但商品化固定化脂肪酶的价格相对较高。
(三)发明内容
本发明目的是为了解决化学方法的不足和商品化脂肪酶价格昂贵的问题，利用交联固载化方法制备固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，未见文献报道。利用固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化豆油脱臭馏出物甲酯化具有生产工艺条件温和，步骤简单，产品收率高，环境友好，节能环保等优点。本发明使用的固定化技术为固载化交联酶聚集体技术，是近几年新发展的一种固定化酶方法，它将交联酶聚集体技术与载体固定化相结合，实现酶的高效固定化。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，所述方法是：将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在4℃下加入有机溶剂，静置沉淀1h后离心，取沉淀再加入交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固载化，反应完全后，反应液真空干燥，获得固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；所述有机溶剂为下列之一：叔丁醇、异丙醇、乙二醇二甲醚或丙酮；所述交联剂为质量浓度5％戊二醛水溶液或质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液。
进一步，优选所述有机溶剂为叔丁醇或异丙醇。
进一步，所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶为液体脂肪酶Lipozyme TL 100L。
进一步，所述有机溶剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为1-6:1。
进一步，所述交联剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为0.1-0.4:1，所述大孔吸附树脂添加量以疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积计为0.1-0.5g/ml。
进一步，所述的大孔吸附树脂为下列型号之一：D101、DM11、D3520、AB-8、NKA、ESD-1、LSA-10或LSA-21。
进一步，所述固定化方法按如下步骤进行：将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(优选丹麦诺维信公司的液体脂肪酶Lipozyme TL 100L)在4℃下加入有机溶剂，静置沉淀1h后，10000rpm离心10分钟，取沉淀再加入交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固载化2h，反应液45℃真空干燥，获得固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；所述有机溶剂为叔丁醇或异丙醇；所述交联剂为质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液；所述有机溶剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为4:1；所述交联剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为0.2:1，所述大孔吸附树脂添加量以疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积计为0.25g/ml。
本发明所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶为丹麦诺维信公司的液体脂肪酶LipozymeTL 100L。
本发明所述固定化脂肪酶用于催化豆油脱臭馏出物酯化反应，具体为：以固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶为催化剂，加入豆油脱臭馏出物，甲醇、叔丁醇，在50℃、200rpm水浴反应5h，反应液过滤，滤饼回收催化剂继续使用，滤液分离纯化，获得酸值5mgKOH/g以下的豆油脱臭馏出物(为下一步提取维生素E和植物甾醇的原料)；所述豆油脱臭馏出物体积用量以催化剂质量计为20ml/g，所述甲醇和叔丁醇体积用量以催化剂质量计分别为10ml/g、20ml/g。
本发明所述豆油脱臭馏出物购自嘉吉集团，酸值108mgKOH/g，水分含量3％以下。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明固定化脂肪酶制备条件简单，操作方便。固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的酶活力和批次稳定性远高于商品化酶Lipozyme TL IM，适合工业化应用。
(四)附图说明
图1固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的催化批次稳定性。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
将液体脂肪酶Lipozyme TL 100L(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，丹麦诺维信公司)100ml，在4℃下加入叔丁醇400ml，静置沉淀1小时后，转速10000rpm离心10分钟，除去上清液，沉淀加入20g非极性大孔吸附树脂D101和20ml交联剂(质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液)，摇床振荡交联2小时，然后反应液45℃真空干燥4小时，制备获得固定化脂肪酶9.96g。对固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，得出比酶活力3580U/g。
固定化脂肪酶酯化活力单位的定义及测定方法如下：
脂肪酶酯化活力定义(U)：50℃下每分钟生成1μmoL产物油酸甲酯所需要的酶量。比酶活力的计算方式如下：X＝[V×(V1/V2)]ρ/[(m·T)·M]
其中，V为通过标准曲线计算出的油酸甲酯的体积(mL)；V1为反应体系总体积(mL)；V2为取出的样品体积(mL)；ρ为油酸甲酯的密度(g/ml)，T为反应的时间(min)；m为加入的固定化脂肪酶的质量(g)；M为油酸甲酯的摩尔质量(g/mol)。
固定化脂肪酶的酯化活性测定反应条件：取0.02g固定化脂肪酶，加入1ml油酸，0.5ml甲醇，0.5ml叔丁醇，在30℃，200rpm的水浴摇床中反应30分钟后，取出10ul反应后的样品加到1ml的乙酸乙酯进行气相色谱检测。
气相色谱条件：Agilent 6890气相色谱仪，色谱柱是DB-23毛细管柱(60.0 m×0.32 mm×0.25μm)，FID检测器；检测条件为柱温220℃，恒温保持10 min，进样温度250℃，检测器温度250℃，载气为高纯氮气，柱头压107.27 Kpa；尾吹气流量24.0 mL·min-1；分流比20:1。
实施例2
按照实施例1方法制备不同批次固定化脂肪酶，以不同批次的商品液体脂肪酶Lipozyme TL 100L的酯化活性为对照，获得固定化脂肪酶的批次稳定性比较结果，如表1所示，自制固定化脂肪酶的酶活力和稳定性远高于商品化酶Lipozyme TL IM。
表1：实施例1制备的固定化脂肪酶和商品化酶的稳定性比较结果
实施例3
将实施例1有机溶剂改为表1所示，其他条件不变。对获得的固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，结果如表2所示。
表2：不同有机溶剂沉淀的比酶活力结果
实施例4
将实施例1中叔丁醇的体积改为表3所示，其他条件不变。对获得的固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，结果如表3所示。
表3：不同体积叔丁醇沉淀的比酶活力结果
实施例5
将实施例1中交联剂改为质量浓度5％戊二醛水溶液，其它不变，获得固定化脂肪酶9.68g，比酶活力3220U/g。
实施例6
利用吸附交联法固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶：将液体脂肪酶Lipozyme TL100L(丹麦诺维信公司)100ml在30℃下加入20g非极性大孔吸附树脂D101，摇床振荡交联2小时，加入20ml交联剂(质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液)，摇床振荡交联1小时，然后45℃真空干燥4小时，制备获得固定化脂肪酶9.56g。对固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，得出比酶活力2850U/g，酶活力远低于利用实施例1制备的固定化脂肪酶3580U/g。
实施例7
改变实施例1中质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液的体积，其他条件不变。对获得的固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，结果如表4所示。
表4：不同体积交联剂的比酶活力结果
实施例8
改变实施例1中大孔吸附树脂，其他条件不变。对获得的固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，结果如表5所示。
表5：不同型号大孔吸附树脂的比酶活力结果
实施例9
改变实施例1中大孔吸附树脂为大孔吸附树脂NKA，并改变添加量，其他条件不变。对获得的固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，结果如表6所示。
表6：不同添加量大孔吸附树脂的比酶活力结果
实施例10
将按实施例1方法获得的固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶应用于豆油脱臭馏出物的甲酯化反应，反应条件如下：固定化脂肪酶添加量为1g，加入20ml豆油脱臭馏出物(购至嘉吉集团，酸值108mgKOH/g，水分含量3％以下)，10ml甲醇和20ml叔丁醇，反应温度50℃，水浴摇床转速200rpm，反应时间5小时。结束后，反应液过滤固定化脂肪酶后，固定化脂肪酶回收利用，滤液在0.1MPa压力下减压蒸馏除去甲醇和叔丁醇至无馏出物，测定浓缩液的酸值(按照国家标准规定的方法GB/T 5530-2005测定)，并计算甲酯化率，酯化率＝(油脂初始酸值-反应后油脂酸值)/油脂初始酸值×100％。豆油脱臭馏出物的初始酸值即108mgKOH/g，反应后的豆油脱臭馏出物酸值为3.2mgKOH/g，酯化率为97.0％。
实施例11：
按实施例10方法，利用不同来源的固定化脂肪酶催化豆油脱臭馏出物的甲酯化反应，反应的酯化率见表7。表7结果表明，按实施例1方法获得的固定化脂肪酶要优于其他脂肪酶。
表7：不同脂肪酶的酶转化结果
实施例12：
按实施例10方法，利用实施例1制备的固定化脂肪酶催化豆油脱臭馏出物的甲酯化反应，过滤回收的固定化脂肪酶重新进行催化豆油脱臭馏出物的甲酯反应，连续反应20批次，其不同批次的酯化率见图1。图1结果表明，按实施例1方法获得的固定化脂肪酶具有良好的稳定性。第20批次时，酶仍保持较高的催化活性，第20批酯化率为91.8％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述方法是：将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在4℃下加入有机溶剂，静置沉淀1h后离心，取沉淀再加入交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固载化，反应完全后，反应液真空干燥，获得固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；所述有机溶剂为下列之一：叔丁醇、异丙醇、乙二醇二甲醚或丙酮；所述交联剂为质量浓度5％戊二醛水溶液或质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液。
2.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述有机溶剂为叔丁醇或异丙醇。
3.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶为液体脂肪酶Lipozyme TL 100L。
4.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述有机溶剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为1-6:1。
5.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述交联剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为0.1-0.4:1，所述大孔吸附树脂添加量以疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积计为0.1-0.5g/ml。
6.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为下列型号之一：D101、DM11、D3520、AB-8、NKA、ESD-1、LSA-10或LSA-21。
7.如权利要求1所述固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在4℃下加入有机溶剂，静置沉淀1h后，10000rpm离心10分钟，取沉淀再加入交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固载化2h，反应液在45℃真空干燥，获得固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；所述有机溶剂为下列之一：叔丁醇或异丙醇；所述交联剂为质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液；所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶为液体脂肪酶Lipozyme TL 100L；所述有机溶剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为4:1；所述交联剂与疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积比为0.2:1，所述大孔吸附树脂添加量以疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶体积计为0.25g/ml。
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