CN110331139A - 一种南极假丝酵母脂肪酶b的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，所述方法将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15‑45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；与市场上的现有商品固定化脂肪酶相比较，本发明制备的固定化脂肪酶有更高的酶活力，因此酶固定化方法具有良好的工业化应用前景。

Description

一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法

(一)技术领域

本发明属于酶工程领域，涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法。

(二)背景技术

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，还有此外化酯类化合物的分解、酯化、酯交换、内酯合成、肽合成、酯聚合及酰化反应等功能。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中。其中南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是一种重要的脂肪酶。南极假丝酵母脂肪酶B广泛的应用于光学活性药物、有特殊生理功能的构造脂质、精细化学品、手性化合物和生物柴油等方面，具有巨大的应用价值。

脂肪酶催化反应具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等特点。而游离态的脂肪酶作为一种蛋白质存在容易失活和催化反应不稳定的问题，反应过后也存在不易分离和分离成本高的问题。固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比最大的优势在于：固定化脂肪酶可以重复使用、连续操作、简化和更加高效地催化反应。因此脂肪酶的固定化具有重大的市场价值。

本发明建立了通过MOF结构ZIF-8结合CALB脂肪酶复合物，再与大孔吸附树脂交联的新型酶固定化方法。大孔吸附树脂具有良好的刚性结构和吸附能力，而且回收容易，同时会给予酶蛋白一定的保护作用。金属有机框架材料ZIF-8复合酶的大量文章(1.PitzalisF,Carucci C,Naseri M,et al.Lipase Encapsulation onto ZIF-8:A Comparisonbetween Biocatalysts Obtained at Low and High Zinc/2-Methylimidazole MolarRatio in Aqueous Medium[J].ChemCatChem,2018,10(7):1578–1585.2.Nadar S S,Rathod V K.Encapsulation of lipase within metal-Organic framework(MOF)withenhanced activity intensified under ultrasound[J].Enzyme Microb Technol,2018,108:11-20.)表明该材料能提高酶的催化活性、热稳定性和溶剂耐受性等性质。MOFs虽然能够提高酶的很多性质，但是MOFs本身是一种粉状物质，在实验操作的过程中容易被物料吸附结合而造成流失。将MOFs与大孔吸附树脂结合能够利用大孔吸附树脂大颗粒易回收的特点，降低固定化脂肪酶流失，提高回收率。与市场上的现有商品固定化脂肪酶相比较具有更高的稳定性和酶活力，本方法制备的的固定化脂肪酶具有良好的商业价值。

(三)发明内容

本发明提供一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，将MOFs和大孔吸附树脂结合作为固定化载体，提高了酶的溶剂耐受性和批次稳定性。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，所述方法是：将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15-45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；所述交联剂为下列之一：戊二醛或聚乙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺(PEI)。

进一步，所述二甲基咪唑水溶液和硝酸锌水溶液是将二甲基咪唑和硝酸锌分别与去离子水混合，在40Hz、25℃下超声30min制成，所述二甲基咪唑水溶液浓度为0.3125mol/L，所述硝酸锌水溶液浓度为5.21～12.50μmol/mL。

进一步，所述南极假丝酵母脂肪酶B优选购自丹麦诺维信公司的南极假丝酵母脂肪酶B酶液，酶量为72mg/ml，酶活为4166.67U/ml(水解活性)。

进一步，所述二甲基咪唑水溶液体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B重量计为130-850ml/g(优选277.78ml/g)；所述硝酸锌水溶液与二甲基咪唑水溶液体积比为25-60:1(优选40:1)。

进一步，所述非极性大孔吸附树脂为下列型号之一：D101-1，XAD1600N，HPD850，XAD1180N，XAD7HP，D3520或H103，优选D101-1；所述非极性大孔吸附树脂与南极假丝酵母脂肪酶B(若以酶液形式加入，则以酶液中酶的质量计)质量比为1-10:1，优选2.3:1。

进一步，所述交联剂体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B质量计为2-17ml/g，优选11.6ml/g。优选交联剂为质量浓度25％的聚乙烯亚胺水溶液。

进一步，优选交联温度为30℃。滤饼干燥温度为35℃。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明固定化脂肪酶制备条件简单，操作方便，固定化酶活力高达38.39U/mg，较现有的固定化方法具有更好的温度稳定性和溶剂耐受性。重复利用10次以后，酶活力还能保留84％以上，适合工业化生产。

(四)附图说明

图1固定化南极假丝酵母脂肪酶B的催化批次稳定性。

图2固定化南极假丝酵母脂肪酶B的催化溶剂耐受性。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1南极假丝酵母脂肪酶B的固定化条件和脂肪酶活性测定方法

将二甲基咪唑和硝酸锌分别加入去离子水中，在40Hz下分别超声20min，分别配制得到0.3125mol/L二甲基咪唑水溶液和0.3125mol/L硝酸锌水溶液。取60mL0.3125mol/L二甲基咪唑水溶液、1.5mL0.3125mol/L硝酸锌水溶液和3mL南极假丝酵母脂肪酶B酶液(丹麦诺维信公司CALB，酶量72mg/ml，4166.67U/ml)混合，获得混合酶液，在25℃、200rpm下磁力搅拌反应30min，获得含MOFs(CALB-ZIF-8)复合物的反应液。向反应液中加入0.5g大孔树脂D101-1和2.5mL质量浓度25％聚乙烯酰亚胺(PEI)水溶液，在30℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，用真空滤纸抽滤机真空抽滤，滤饼在35℃真空干燥4h，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B(记为CALB-ZIF-8@D101-1)0.258g。对固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，得出比酶活力38.39U/mg。

固定化脂肪酶酯化活力单位的定义及测定方法如下：

脂肪酶酯化活力定义(U)：35℃下每小时生成1μmoL产物所需要的酶量。

比酶活力的计算方式如下：X＝[V×(V1/V2)]ρ/[(m·T)·M]

其中，V为通过标准曲线计算出的脂肪酸甲酯的体积(mL)；V1为反应体系总体积(mL)；V2为取出的样品体积(mL)；ρ为油酸甲酯的密度(g/ml)；T为反应的时间(h)；m为加入的固定化酶的质量(g)；M为油酸甲酯的摩尔质量(g/mol)。

固定化酶的酯化活性测定反应条件：取0.02g固定化酶，加入1ml油酸，0.5ml甲醇，0.5ml有机溶剂(叔丁醇)，40μL水，在35℃，200rpm的水浴摇床中反应1小时后，取出10uL反应后的样品加到1ml的乙酸乙酯进行气相色谱检测。

气相色谱条件：Agilent 6890气相色谱仪，色谱柱是DB-23毛细管柱(60.0m×0.32mm×0.25μm)，FID检测器；检测条件为柱温箱温度220℃，恒温保持10min，进样口温度250℃，检测器温度250℃，载气为高纯氮气，柱头压107.27Kpa；尾吹气流量24.0mL·min^-1；分流比20:1。

实施例2固定化酶制备过程所用溶液的比例和浓度对酶活性的影响

将实施例1中硝酸锌水溶液体积设为1.0mL-2.4mL，其它操作及条件与实施例1相同，结果如表1所示，二甲基咪唑水溶液与硝酸锌水溶液最优体积比为40:1。

表1：不同体积的硝酸锌水溶液的比酶活力结果

实施例3固定化酶制备过程所用酶液的量对酶活性的影响

将实施例1中南极假丝酵母脂肪酶B酶液体积设为1-6ml，其它操作和条件与实施例1相同，结果如表2所示，加入酶液量的最优值为3mL(72mg/ml)。

表2不同体积酶液的比酶活力结果

实施例4固定化酶制备过程所用交联剂的用量对酶活性的影响

将实施例1中质量浓度25％聚乙烯亚胺水溶液体积改为表3所示，其它操作和条件与实施例1相同。可得聚乙烯亚胺水溶液优选加入体积为2.5mL。

表3不同体积聚乙烯亚胺比酶活力结果

实施例7固定化酶制备过程所用交联温度对酶活性的影响

将实施例1交联温度设为15-45℃，其它操作和条件与实施例1相同，结果如表4所示，最优的交联温度为30℃。

表4不同交联温度的比酶活力结果

实施例8固定化酶制备过程所用大孔树脂类型对酶活性的影响

将实施例1中大孔树脂型号设为表5所示，加入量均为0.5g，其它操作和条件不变与实施例1相同，结果如表5所示，最优的交联树脂为郑州勤实科技有限公司的D101-1。

表5不同型号大孔吸附树脂的比酶活力结果

实施例9固定化酶制备过程所用大孔树脂添加量对酶活性的影响

将实施例1中大孔树脂添加量设为表6所示，其它操作和条件与实施例1相同，结果如表6所示，最优的树脂添加量为0.5g。

表6不同添加量大孔吸附树脂的比酶活力结果

实施例10固定化南极假丝酵母脂肪酶B的溶剂耐受性

将实施例1酶活测试中有机溶剂改为表7所示，在不同有机溶剂中测试固定化南极假丝酵母脂肪酶B的酶活进而获得溶剂耐受性，反应条件与实施例1相同。结果如表7和图2所示，CALB-ZIF-8@D101-1具有较好的溶剂耐受性，特别是在DMF中也具有一定的活性。

表7不同有机溶剂的比酶活力结果

实施例11固定化南极假丝酵母脂肪酶B与商品固定化脂肪酶的酶活比较

将实施例1制备的固定化南极假丝酵母脂肪酶B与多种商品固定化脂肪酶在相同条件下进行比酶活力测试，结果见表8。相较市场上现有的商品酶，实施例1制备的CALB-ZIF-8@D101-1具有更高的活力。

表8不同固定化脂肪酶的比酶活力结果

实施例12固定化南极假丝酵母脂肪酶B的催化批次稳定性

取0.2g实施例1制备的CALB-ZIF-8@D101-1加入到2mLEP管中，然后加入1mL油酸和0.5mL甲醇混合液，再加入0.5mL叔丁醇和40μL水。在35℃、1500rmp金属浴条件下每隔1小时取10uL反应液加入到1mL乙酸乙酯中，采用实施例1方法检测其气相色谱峰面积，得到酶活力。最后将EP管中的反应液全部吸出再加入新的底物进行下一批反应，共取10次样即反应10批。结果如图1所示，结果表明其具有良好的批次稳定性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述方法是：将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15-45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；所述交联剂为下列之一：戊二醛或聚乙烯亚胺。

2.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述二甲基咪唑水溶液和硝酸锌水溶液是将二甲基咪唑和硝酸锌分别与去离子水混合，在40Hz、25℃下超声30min制成。

3.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述二甲基咪唑水溶液浓度为0.3125mol/L，所述硝酸锌水溶液浓度为5.21～12.50μmol/mL。

4.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述南极假丝酵母脂肪酶B为酶量72mg/ml的南极假丝酵母脂肪酶B酶液。

5.如权利要求3所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述二甲基咪唑水溶液体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B重量计为130-850ml/g；所述硝酸锌水溶液与二甲基咪唑水溶液体积比为25-60:1。

6.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述非极性大孔吸附树脂为下列型号之一：D101-1，XAD1600N，HPD850，XAD1180N，XAD7HP，D3520或H103。

7.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述非极性大孔吸附树脂与南极假丝酵母脂肪酶B质量比为1-10:1。

8.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述交联剂体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B质量计为2-17ml/g。

9.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于交联剂为质量浓度25％的聚乙烯亚胺水溶液。

10.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于交联温度为30℃，滤饼干燥温度为35℃。