CN112195170A

CN112195170A - 一种固定化重组酯酶及其制备r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用

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Publication number: CN112195170A
Application number: CN202010679906.6A
Authority: CN
Inventors: 章银军; 周铭鹏; 张泓骏; 郑建永; 汪钊
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-07-15
Also published as: CN112195170B

Abstract

本发明公开了一种固定化重组酯酶及其制备R‑2,6‑二甲基苯基氨基丙酸的应用，本发明固定化重组酯酶PAE07具有优异的对映选择性(e.e._p>98％)，高酶活，而且比较稳定，对(R,S)‑N‑(2,6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的耐受性好。可以在高底物浓度大于1mol/L的条件下进行催化在线制备R‑2,6‑二甲基苯基氨基丙酸，在最佳条件下具有48.5％的转化率，产物的e.e._p为99％，反应时间为480min，相对于其他催化(R,S)‑N‑(2,6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的酶催化效率更高，底物浓度可提高3倍以上，而且可以进行重复循环利用，可大大的节省反应成本，适合工业化生产。

Description

一种固定化重组酯酶及其制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组酯酶及制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的方法。

(二)背景技术

甲霜灵化学名称D,L-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯，俗称保种灵、瑞毒霉等。甲霜灵是一种对霜霉病菌、疫霉病菌和腐病菌有生物活性的酰胺类农用杀菌剂，杀菌机理主要是通过抑制病菌体内蛋白的合成，使菌体营养不足，不能支持其正常生长。甲霜灵具有S型和R型两种异构体，而市面上销售的甲霜灵往往都为外消旋体。药理研究表面，起到杀菌作用的主要是R型的异构体，R型的异构体作用比S型高20-30倍，有时甚至是100倍。而且混用，S型会对R型有抑制作用，所以制备纯度高的R型异构体，可以减少用量，降低成本。

R型的甲霜灵为精甲霜灵，精甲霜灵的合成主要以化学方法为主，以2，6二甲基苯胺或S-乳酸为原料。但是化学法反应速度比较慢，而且需要高温，高压，副产物比较多。得到高纯度的中间体(D)-(-)N-2,6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯((R)-DMPM)是合成左旋甲霜灵的关键，目前广泛应用的化学合成法并不能达到精甲霜灵产品的国际标准。而生物酶具有良好的底物特异性，可以利用生物酶法来进行手性拆分，得到高纯度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。有研究报道商品脂肪酶PS酶被用来拆分中间体 (R,S)-DMPM，得到e.e._p值大于98％的(R)-DMPM。但是PS酶很昂贵，反应时间比较长，因此需要发展更绿色，有效，具有更高选择性的新型催化剂来拆分(R,S)-N-(2,6- 二甲基苯基)氨基丙酸甲酯。

脂肪酶固定化方法大致上有吸附法、共价结合法、包埋法和交联法四种。但是因为脂肪酶具有的特有结构性质，对脂肪酶进行固定化时，我们常常选择表面具有一定疏水性的载体。为了追求更高效的固定化方法，经常把常规的几种固定化方法结合起来，比如吸附-交联法、包埋-交联法等，这些方法的结合有利于弥补单一方法的缺点，使固定化方法更加高效。

填充床反应器(Packed Bed Reactor PBR)就是将固定化酶或固定化细胞装填于柱式反应器内部，形成反应的床层，使流动反应液通过酶床层而催化反应。理想的填充床假设反应液以平稳，等速不受干扰的通过反应床层，流动模型符合活塞流流动模型。在连续稳态操作条件下，反应器同一截面上的物料的组成不随时间发生变化，但是随物料的流动方向位置不同而不同，反应随空间位置而变化。填充床反应器的操作模式可以分为连续和半连续反应。填充床反应器已广泛运用于固定化酶/细胞催化反应，包括生物柴油生产，污水处理，生产农药，异构化生产果葡糖浆等。

与其他常规的化学反应器相比，填充床反应器的反应效率比较高，而且易操作，结构简单，对酶的损害比较小，单位体积反应床的酶密度大；反应物的配比，反应的时间，温度，流速和接触时间等反应条件容易控制；需要的反应物的用量比较大，可以大产量的得到反应产物，反应过程中也方便进行检测，是一种适合工业化生产物质的技术。

目前，有较多的国内外学者对酶法手性拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯制备高纯度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸进行了研究，有商业脂肪酶PS酶，洋葱伯克霍尔德氏菌的脂肪酶，白色杆菌的脂肪酶等。这些酶反应往往需要时间较长，反应的转化率和酶的选择性不太高，而且底物的耐受性也不太好。

因此，我们利用从土壤中筛选出来的高对映选择性和活性的假单胞杆菌 WZZ003(保藏号：CCTCC M2014209)，并在此基础上构建了含立体选择性酯酶编码基因的工程菌，经过菌体发酵培养，酶的分离纯化后分离出了酯酶PAE07并进行固定化，研究填充床反应器中酯酶催化在线制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的方法，旨在寻求一种高效，大产量的，高纯度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的在线可控选择性合成方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种固定化重组酯酶及其拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯((R,S)-DMPM)制备高纯度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸((R)-MAP-acid)的应用。将固定化重组酯酶填充入柱式固定床反应器，在高底物浓度反应体系里连续批量制备高纯度R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸，为工业化制备高纯度的精甲霜灵提供了借鉴。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种固定化重组酯酶，所述固定化重组酯酶是将含重组酯酶基因的工程菌经发酵培养并分离提取的重组酯酶，采用大孔树脂固定化获得的；所述重组酯酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明所述重组酯酶基因源自不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrumasaccharolyticum)CCTCC NO:M2014209。

本发明所述重组酯酶按如下方法制备：将含重组酯酶基因的工程菌接种至LB培养基，在37℃、200rpm下培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至LB培养基中，在37℃、180rpm下培养2h至OD值达到0.6-0.8，然后加入终浓度0.048mg/mL的IPTG，在37℃、150rpm下诱导培养10h后，获得发酵液；将发酵液超声破碎，离心(优选12000rpm离心10min)，取上清液上样镍柱，以含0-500mM (优选100-200mM)咪唑的50mM、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液为洗脱液进行梯度洗脱，收集150mM咪唑的洗脱液，利用超滤管(透过分子量为10K)在4500rpm转速下离心除盐并浓缩，获得重组酯酶，记为重组酯酶PAE07；所述超声破碎条件为：200W，超声1s，停3s，时间为10min。

本发明所述固定化重组酯酶按如下方法制备：将重组酯酶PAE07与大孔树脂按质量比0.020：1的比例混合，在35℃、200rpm的水浴摇床中吸附4个小时后，加入质量浓度50％聚乙烯亚胺(PEI)水溶液，在35℃、200rpm共价交联1小时后，抽滤除去未吸附酶液，滤饼用超纯水清洗，再次抽滤除去表面水分，再次抽滤的滤饼在45℃下真空干燥，得到固定化重组酯酶PAE07；所述聚乙烯亚胺与大孔树脂质量比为0.21:1。

所述大孔树脂的型号包括D3520、XAD1180N、H103、HAD7HP、850金凯树脂、 D3520、伯氨基树脂、850合成树脂、HKA、D101、DM11。XAD1180N(非极性大孔吸附树脂)，H103(苯乙烯型弱极性共聚体)，HAD7HP(苯乙烯非极性共聚体)， NKA(苯乙烯非极性共聚体)，DM11(非极性大孔吸附树脂)，D101(苯乙烯非极性共聚体)。所述大孔树脂在固定化之前按如下方法进行预处理：树脂在超纯水中进行室温浸泡24h后，再用质量浓度5％盐酸水溶液浸泡4h，用超纯水洗至pH中性；然后再用质量浓度5％NaOH水溶液浸泡4h，用超纯水洗至pH中性，最后用超纯水浸泡树脂，4℃冰箱保存待用(酸碱溶液重复处理2-3次效果最佳，一般阴离子离子交换树脂最后一次用NaOH溶液处理，阳离子交换树脂最后一次用盐酸溶液处理)。

本发明还提供一种所述固定化重组酯酶在拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯(R,S-DMPM)制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸(R-MAP-acid)中的应用，所述应用以(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以固定化重组酯酶为催化剂，采用填充床反应器进行；所述填充床反应器包括带保温夹套的底物槽1，磁力搅拌转子2，pH恒定仪(pH-stat)3，碱液罐4，带保温夹套的填充柱5，恒温水浴锅6，蠕动泵7；所述底物槽侧面设有出液口，内部放置磁力搅拌转子2，所述出液口通过设有蠕动泵7和流量计的管路与填充柱5的底部连接，所述填充柱5的顶部通过设有取样口的管路与底物罐连通形成循环；同时，pH恒定仪(pH-stat)3与碱液罐4连接后(当pH低于7.0后，PH-stat会感应pH的变化进行流加碱液，直至pH为7.0后停止流加)各自与底物罐1连通；所述底物罐1和填充柱5的保温夹套分别与恒温水浴锅6连接，所述保温夹套中的水与水浴锅形成循环。

进一步，所述应用方法为：将固定化重组酯酶装入填充柱，将含(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的0.2M、pH 7.0的PB缓冲液作为反应液加入底物槽1内，恒温水浴锅6温度为20-40℃，开启磁力搅拌，通过pH恒定仪3流加碱液罐4中的1 M NaOH水溶液调节底物罐中pH至7.0；开启蠕动泵7，将底物罐1中的反应液以0.2-1 mL/min(优选0.5mL/min)的流速通过连接管从填充柱5的底部通过填充柱并进入底物罐1中进行循环反应，通过恒温水浴锅控制填充柱反应器的温度在20-40℃，维持底物罐1中反应液pH为7.0，反应液在填充柱内连续循环反应30-720min，反应结束后，反应液分离纯化，获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

进一步，所述填充柱5的内径为1.5cm，柱高为30cm，高径比为20：1，填充柱的内径和柱高会影响填充柱内的流体流速及停留时间，但对反应本身不造成直接影响。所述填充柱内固定化重组酯酶装填量为0.236g/cm³。

进一步，所述底物浓度为0.5-2.0mol/L，优选1mol/L。

进一步，所述反应温度优选为35℃。

进一步，所述反应时间优选为480min，可以通过调节蠕动泵的来调节填充柱内流体的流速进而调节原料在填充柱内的停留时间，即反应时间。

进一步，所述反应液分离纯化方法为：向反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止酶反应并萃取，将水相用4M HCl酸化使溶液pH降至2.0，并用等体积的乙酸乙酯萃取两次；之后，将有机相50℃干燥并浓缩除去全部乙酸乙酯，得到白色的晶体，即为 R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

本发明采用的填充床反应器中底物槽的数目可以是一个或多个，视具体需求而定。所述的底物槽和填充柱的保温夹套通过循环连续通入恒温水浴锅内的水，以此有效控制底物槽和反应柱的温度保持一致。所述的恒温水浴锅可以根据具体实验的情况进行选择，如恒温水浴箱。

本发明对填充柱的材料不限，推荐使用绿色，环保的材质，例如二氧化硅管；填充柱内的液体流动方向优先选择为从下而上，以此保证反应的床层稳定，均匀，使反应液匀速稳定的通过。

本发明方法将固定化重组酯酶PAE07均匀填充在填充柱内，可以通过机械方法直接将颗粒状的催化剂均匀固定于填充柱内，然后利用通入缓冲液将酶床压实，减小空隙，增大接触面积。

本发明的反应产物可以随时进行取样检测拆分反应的进程，也可以在线收集产物，所得反应液可以通过常规处理方法即可获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸结构式：

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明固定化重组酯酶PAE07具有优异的对映选择性(e.e._p>98％)，高酶活，而且比较稳定，对(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基) 氨基丙酸甲酯的耐受性好。可以在高底物浓度大于1mol/L的条件下进行催化在线制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸，在最佳条件下具有48.5％的转化率，产物的e.e._p为99％，反应时间为480min，相对于其他催化(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的酶催化效率更高，底物浓度可提高3倍以上，而且可以进行重复循环利用，可大大的节省反应成本，适合工业化生产。

(四)附图说明

图1为本发明固定化重组酯酶PAE07手性拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的反应机理示意图。

图2为本发明实施例采用的填充床反应器的结构示意图。

图3为重组酯酶PAE07固定化树脂的筛选；A：XAD1180N；B：H103；C： HAD7HP；D：850金凯树脂；E：D3520；F：伯氨基树脂；G：850合成树脂；H： HKA；I：D101；J：DM11。

图4为重组酯酶PAE07固定化后热稳定性的变化。

图5为重组酯酶PAE07固定化后pH稳定性的变化。

图6为实施例6液相色谱图，A为(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯和R-2,6- 二甲基苯基氨基丙酸和S-2,6-二甲基苯基氨基丙酸液相图；B为固定化重组酯酶 PAE07催化(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的液相图；C为(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯液相图。

图7为重组酯酶PAE07的SDS-PAGE电泳鉴定图。M为蛋白的Marker，1为未诱导的菌液的电泳图，2为诱导后的菌液的电泳图，3为进行纯化后的重组酯酶PAE07 的电泳图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述室温是指25-30℃。

实施例1：重组酯酶的固定化

1、重组酯酶

从富含(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的土壤中筛选出来的一株假单胞杆菌WZZ003，并在此基础上构建了含立体选择性酯酶编码基因的工程菌，经过菌体发酵培养，破碎分离纯化筛选出目的蛋白，重组酯酶PAE07，具体为：

根据假单胞菌属物种的预期α/β水解酶的N端和C端氨基酸序列设计引物，以不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum asaccharolyticum)WZZ003(保藏号：CCTCC NO:M2014209，已在专利ZL 201510134861.3中公开)基因组为模板，进行PCR扩增，利用基因组DNA片段快速纯化试剂盒进行PCR产物的纯化，将PCR产物(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)导入PEASY-blunt E1 载体中，再将载体导入大肠杆菌DH5α中，提取质粒导入大肠杆菌BL-21，得到含所述酯酶基因的重组基因工程菌。

上游引物为：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；

下游引物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。

PCR扩增体系：

PCR扩增条件:

将重组基因工程菌接种至LB培养基，在37℃、200rpm下培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至LB培养基150mL中，在37℃、180rpm下培养2h至OD值达到0.6-0.8，然后加入终浓度0.000048g/mL的IPTG，在37℃、150rpm 下进行诱导，培养10h后获得发酵液；将发酵液在200W超声(超声1s，停3s，时间为10min)条件下破碎，12000rpm离心10min，取上清液上样镍柱(1 ml，Bio Basic Inc)，以含0mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、500mM咪唑的50mM、 pH8.0的Tris-Hcl缓冲液为洗脱液，进行梯度洗脱，收集150mM咪唑的洗脱液，利用超滤管(10K)在4500rpm转速下离心除盐并浓缩，获得重组酯酶40.3mg，并通过 SDS-PAGE进行鉴定，记为重组酯酶PAE07，见图7。

LB培养基组成(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，溶剂为水，pH调至7.2。

2、固定化

将重组酯酶PAE07固定于大孔丙烯酸系阴离子树脂D3520，并通过聚乙烯亚胺(PEI)进行交联制备固定化重组酯酶，具体为：

大孔树脂预处理：大孔树脂D3520在超纯水中进行室温浸泡24h后，再用质量浓度5％盐酸水溶液浸泡4h，用超纯水洗至pH中性；然后再用质量浓度5％NaOH 水溶液浸泡4h，用超纯水洗至pH中性，最后用超纯水浸泡树脂，4℃冰箱保存待用 (酸碱溶液重复处理2-3次效果最佳，一般阴离子离子交换树脂最后一次用NaOH溶液处理，阳离子交换树脂最后一次用盐酸溶液处理)。

将600mL(308.5mg)步骤1方法制备的重组酯酶PAE07和大孔树脂D3520以酯酶/树脂(mg/g)20：1的比例混合，在35℃、160rpm的水浴摇床中吸附反应4 小时后，加入3mL质量浓度50％聚乙烯亚胺水溶液(PEI，3.24g，质量终浓度为0.25％)， 35℃、160rpm共价交联1小时。反应结束后，抽滤除去未吸附酶液，滤饼用超纯水清洗，再抽滤除去表面水分，在45℃真空干燥，得到15.3g固定化重组酯酶PAE07，酶活为26.5U/g。

酶活定义：在0.2M pH7.0的PB缓冲液中，30℃下，每分钟将1μmol的(R)-DMPM 水解成(R)-MAP-acid所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

酶活测定体系：取20μL纯酶液于2mL EP管中，加入990μL的0.2M的pH＝7 的PB缓冲液，10μL的底物(R，S)-DMPM，混合后在30℃，200rpm条件下反应30min。反应结束后，用4M盐酸调pH至2，加入1mL乙酸乙酯，摇晃均匀后静置，待溶液分层后，乙酸乙酯层取20μL，用旋转蒸发仪蒸干，然后加入1mL的液相流动相溶解制成检测样品，通过液相色谱仪器检测R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯峰面积，根据R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯标准曲线，获得酶蛋白的立体选择性及催化水解活性，计算对映体过量值e.e._p、酶活力。

R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯标准曲线：R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯标准品用0.2M的pH＝7的PB缓冲液配制系列浓度标准液，采用液相色谱检测不同浓度的峰面积，获得标准方程y＝2379700x+305898.79，x代表R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯体积浓度(％)；y代表R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的峰面积。

酶活力测定公式：A＝[(a₁-a)/(a₁/a₀)]×C×V×ρ/(M×t×a₀)

A——样品中酶的活力(U)

a——样品液相检测时，R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯峰面积

a0——同样浓度的标样液相检测时，R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的峰面积

a1——根据标准曲线计算出的同样浓度的标样，R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的峰面积

C——转化液中，底物的体积分数

V——转化液体积

ρ——底物密度(1.06g/mL)

M——底物摩尔质量(197g/mol)

t——转化时间(30min)

HPLC液相色谱检测：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱

Cellud-Y(250×4.6m)；正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝98:2:0.1(体积比)，流速0.5mL/min，柱压212pa，柱温30℃；进样量10μL。

式(1)中e.e._p为产物的对映体过量值，A_P1为产物R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸峰面积， A_P2为产物S-2,6-二甲基苯基氨基丙酸峰面积；

式(2)中e.e._s为底物的对映体过量值，A_P3为底物S-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的峰面积，A_P4为底物R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的峰面积；

式(3)中C为转化率，e.e._p为产物的对映体过量值，e.e._s为底物的对映体过量

相对活力(％)＝B₀/B×100％

B₀:固定化酯酶经过不同条件处理后的酶活；B：固定化酯酶未经处理之前的酶活

实施例2重组酯酶固定化树脂的筛选

将实施例1中大孔树脂D3520替换为XAD1180N、H103、HAD7HP、850金凯树脂、D3520、伯氨基树脂、850合成树脂、HKA、D101、DM11，其他操作同实施例1，分别获得不同载体的固定化酯酶。分别取0.02g固定化酯酶测酶活力。树脂对固定化脂肪酶酶活力的影响如图3所示。同样的条件下，采用树脂D3520进行脂肪酶固定化的效果最好，所以我们将采用D3520进行后续实验。

实施例3重组酯酶固定化后的热稳定性

为了探究固定化重组酯酶PAE07的热稳定性，将实施例1方法获得的固定化重组酯酶PAE07和游离重组酯酶PAE07分别在20、25、30、35、40、45、50℃保温12h，然后采用实施例1方法检测酶活力。固定化重组酯酶PAE07和游离重组酯酶PAE07 的热稳定性结果如图4所示。保温12h后，从30～50℃，游离酶相对酶活力下降明显，在50℃保温下，游离酶相对酶活力只有56％；反观固定化酶，保温12h后，从30～50℃，相对酶活力减小不多；在50℃保温下，固定化重组酯酶PAE07相对酶活力仍有85％，说明固定化对酶起到保护作用，提高了酶的热稳定性。

实施例4重组酯酶固定化后pH稳定性变化

良好的pH稳定性可以使固定化酶适应多变的反应过程，有利于其工业化生产。为了探究固定化酶的pH稳定性，实验将实施例1方法获得的固定化重组酯酶PAE07 和游离重组酯酶PAE07分别置于pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，35℃环境下 12h，然后采用实施例1方法检测酶活力，结果如图5所示。静置12h后，从pH 6.0～7.0，固定化酶和游离酶相对酶活力都有升高；在pH 7.0，固定化酶和游离酶的相对酶活力都达到最大值，且相差不大；pH超过7.0后，游离酶相对酶活力下降迅速，而固定化酶下降缓慢，在pH9.0环境下静置12h，相对酶活力还有90.2％。说明固定化对酶起到保护作用，提高了酶的pH稳定性。

实施例5填充床反应器

参照图2，所述填充床反应器，包括带保温夹套的底物槽1，磁力搅拌转子2，pH 恒定仪(pH-stat)3，碱液罐4，带保温夹套的填充柱5，恒温水浴锅6，蠕动泵7；所述底物槽侧面设有出液口，内部放置磁力搅拌转子2，所述出液口通过设有蠕动泵 7和流量计的管路与填充柱5的底部连接，所述填充柱5的顶部通过设有取样口的管路与底物罐连通形成循环；同时，pH恒定仪(pH-stat)3与碱液罐4连接(当pH低于7.0后，PH-stat会感应pH的变化进行流加碱液，直至pH为7.0后停止流加)后各自与底物罐1连通；所述底物罐1和填充柱5的保温夹套分别与恒温水浴锅6连接并使保温夹套中的水与水浴锅形成循环。

所述填充柱5的内径为1.5cm，柱高为30cm，高径比为20：1。所述填充柱内装填实施例1方法制备的12.5g固定化重组酯酶PAE07。

实施例6：R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的合成

采用实施例4所述填充床反应器。

将含1mol/L(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的0.2M、pH 7.0的PB缓冲液900mL作为反应液加入底物槽1内，恒温水浴锅6温度为35℃，开启磁力搅拌，通过pH恒定仪3控制流加碱液罐4中的1M NaOH水溶液调节底物罐中pH至7.0。开启蠕动泵7，将底物罐1中的反应液以0.5mL/min的流速通过连接管从填充柱5的底部通过填充柱并进入底物罐1中进行循环反应，通过恒温水浴锅控制填充柱反应器的温度在35℃，维持底物罐1中反应液pH为7.0，反应液在填充柱内连续循环反应 480min，反应结束后，取反应液通过实施例1的HPLC液相色谱，计算产物R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的e.e._p，转化率，液相反应图如6所示，(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基) 氨基丙酸甲酯转化率为48.5％，R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的e.e._p为99％。

将反应液中加入等体积的乙酸乙酯终止反应并萃取，将水相用4M HCl酸化至pH为2后，再用等体积的乙酸乙酯萃取两次。之后，将有机相50℃干燥并浓缩至乙酸乙酯除尽，得到白色的晶体84.5g，即为R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

实施例7反应温度对转化率的影响

将实施例5中反应温度改为25、30、35、40℃，其他同实施例5，反应结果如表 1所示。

表1、温度对拆分反应的影响

反应温度[℃]	转化率[％]	e.e.<sub>p</sub>[％]
			25	30	98.9
30	37	99.1
			35	48.5	99
40	40	98.8

表1的结果表明，当流速为0.5mL/min，反应时间均为480min，反应随温度的升高，转换率也明显升高，当反应温度达到35℃时，转换率最高，如果此时继续升温，将会使固定化酯酶的酶活造成损失，从而导致了反应的转换率开始降低，所以本发明中填充床反应器中(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯拆分反应的最佳反应温度为35℃。

实施例8底物浓度对转化率的影响

将实施例5中(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯浓度分别改为0.5mol/L、0.7mol/L、1.0mol/L、1.3mol/L、1.6mol/L、2.0mol/L，在不同底物浓度下反应30 分钟，其他同实施例5，取样进行液相检测。

V₀＝C₀M/t，V₀为固定化重组酯酶的反应初速度，C₀为反应30分钟时的转化率， M为底物的摩尔数，t为反应时间。

根据实施例5计算反应30min的转化率，再根据V₀＝CM/t计算反应480min的转化率，结果如表2所示。

表2、底物浓度对反应的影响

表2的结果表明，随着反应物(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的底物浓度的增加，固定化重组酯酶PAE07的反应初速度也随着增加，当底物的浓度为1.0mol/L时，反应的固定化重组酯酶PAE07的反应初速度为最优，拆分反应的反应速度最快。此时如果继续增加反应物(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的用量，将会导致固定化重组酯酶PAE07的反应初速度减小，底物浓度对固定化重组酯酶PAE07起到抑制作用，所以，该反应的最佳底物浓度为1.0mol/L，在该反应条件下，固定化重组酯酶PAE07的反应初速度最快。

实施例9反应时间对转化率的影响

将实施例5反应时间分别改为30min、60min、120min、180min、240min、300 min、360min、420min、480min、540min、600min、660min、720min，其他同实施例5，结果如表3所示。

表3：反应时间对拆分反应转化率的影响

反应时间[min]	转化率[％]	e.e.<sub>p</sub>[％]
			30	5	99.2
60	12	99.2
			120	19	99.1
180	24	99.3
			240	30	99.1
300	35	99
			360	42	98.9
420	45	98.8
			480	48.5	99
540	44	98.5
			600	41	98.1
660	39	97.4
			720	36	96.1

表3的结果表明，反应进行360min即可得到42％转换率的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸，(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯有大部分拆分成了R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。随着反应时间的增加，反应的转化效率逐渐增加，当反应进行到480min时，R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的转换率可以达到48.5％，此时如果继续去延长反应的时间，反而会导致反应转换率的降低，因而，填充床反应器中R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的制备的最佳时间为480min。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种固定化重组酯酶及其制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgcaaaaac agcatgttga aaccagacat ggccgccttg aagtgatgac aagcgcaggc 60

aagggcgctg cagttttgct tattcatggc aactcagctt gcaaagaagt gtttcacaag 120

cagtttgaat ccgatctcgc gcatgatttc cggctgatcg cttttgatct gccgggacat 180

ggcgcttctg ccaatgctgc cgagccgcaa aagagctata ctttgcatgg ttatgctcag 240

gcggcagccg atgtactgaa agcgctggat gtatcgtccg tagctgtgtt tggctggtcg 300

ctcggcgggc atattggtct ggaaatgatt gcacagcaag cgccagtcag ccgtttaatg 360

atcaccggca cgccgccttt ctcgaaagag ccggattctg tagggcaggc attcgtgccg 420

agtgaagaac tgaaatatgg tggtcagcgt gatctcgacg atgaacaggc gcaatcctat 480

gcgcgtcatg tggtgcatcc tgacaagccg acaccggatt ttgtggtgga tgctgtgcgc 540

agaaccgacg ggctgacacg tcagacaatg tttgagaata ttctggctga taatatcgcc 600

gaccagcagc atatggctga aaattgccct gtaccgctgg ctattctcaa cggcgctgag 660

gatcatttca tcaataatgc gcatattgca tcgctgaatt ataagaacct ctgggaagag 720

acgattttcc tgctgccaca ggtcggccat gcggcatttc tggagaaacc gcaggtcttt 780

aatcgtattt tgtcgcgttt cctgcgcggt taa 813

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Gln Lys Gln His Val Glu Thr Arg His Gly Arg Leu Glu Val Met

1 5 10 15

Thr Ser Ala Gly Lys Gly Ala Ala Val Leu Leu Ile His Gly Asn Ser

20 25 30

Ala Cys Lys Glu Val Phe His Lys Gln Phe Glu Ser Asp Leu Ala His

35 40 45

Asp Phe Arg Leu Ile Ala Phe Asp Leu Pro Gly His Gly Ala Ser Ala

50 55 60

Asn Ala Ala Glu Pro Gln Lys Ser Tyr Thr Leu His Gly Tyr Ala Gln

65 70 75 80

Ala Ala Ala Asp Val Leu Lys Ala Leu Asp Val Ser Ser Val Ala Val

85 90 95

Phe Gly Trp Ser Leu Gly Gly His Ile Gly Leu Glu Met Ile Ala Gln

100 105 110

Gln Ala Pro Val Ser Arg Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Pro Phe Ser

115 120 125

Lys Glu Pro Asp Ser Val Gly Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Glu Leu

130 135 140

Lys Tyr Gly Gly Gln Arg Asp Leu Asp Asp Glu Gln Ala Gln Ser Tyr

145 150 155 160

Ala Arg His Val Val His Pro Asp Lys Pro Thr Pro Asp Phe Val Val

165 170 175

Asp Ala Val Arg Arg Thr Asp Gly Leu Thr Arg Gln Thr Met Phe Glu

180 185 190

Asn Ile Leu Ala Asp Asn Ile Ala Asp Gln Gln His Met Ala Glu Asn

195 200 205

Cys Pro Val Pro Leu Ala Ile Leu Asn Gly Ala Glu Asp His Phe Ile

210 215 220

Asn Asn Ala His Ile Ala Ser Leu Asn Tyr Lys Asn Leu Trp Glu Glu

225 230 235 240

Thr Ile Phe Leu Leu Pro Gln Val Gly His Ala Ala Phe Leu Glu Lys

245 250 255

Pro Gln Val Phe Asn Arg Ile Leu Ser Arg Phe Leu Arg Gly

260 265 270

Claims

1.一种固定化重组酯酶，其特征在于所述固定化重组酯酶是将含重组酯酶基因的工程菌经发酵培养并分离提取的重组酯酶，采用大孔树脂固定化获得的；所述重组酯酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述固定化重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述固定化重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶按如下方法制备：将含重组酯酶基因的工程菌接种至LB培养基，在37℃、200rpm下培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至LB培养基中，在37℃、180rpm下培养2h至OD值达到0.6-0.8，然后加入终浓度0.048mg/mL的IPTG，在37℃、150rpm下诱导培养10h后，获得发酵液；将发酵液超声破碎，离心，取上清液上样镍柱，以含0-500mM咪唑的50mM、pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液为洗脱液进行梯度洗脱，收集150mM咪唑的洗脱液，利用超滤管在4500rpm转速下离心除盐并浓缩，获得重组酯酶；所述超声破碎条件为：200W，超声1s，停3s，时间为10min。

4.如权利要求1所述固定化重组酯酶，其特征在于所述固定化重组酯酶按如下方法制备：将重组酯酶与大孔树脂按质量比0.02：1的比例混合，在35℃、200rpm的水浴摇床中吸附4个小时后，加入质量浓度50％聚乙烯亚胺水溶液，在35℃、200rpm共价交联1小时后，抽滤除去未吸附酶液，滤饼用超纯水清洗，再次抽滤除去表面水分，再次抽滤的滤饼在45℃下真空干燥，得到固定化重组酯酶；所述聚乙烯亚胺与大孔树脂质量比为0.21:1。

5.如权利要求1所述固定化重组酯酶，其特征在于所述大孔树脂的型号包括D3520，XAD1180N，H103，HAD7HP，NKA，DM11，D101。

6.一种权利要求1所述固定化重组酯酶在拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以固定化重组酯酶为催化剂，采用填充床反应器进行；所述填充床反应器包括带保温夹套的底物槽，磁力搅拌转子，pH恒定仪，碱液罐，带保温夹套的填充柱，恒温水浴锅，蠕动泵；所述底物槽侧面设有出液口，内部放置磁力搅拌转子，所述出液口通过设有蠕动泵和流量计的管路与填充柱的底部连接，所述填充柱的顶部通过设有取样口的管路与底物罐连通形成循环；同时，pH恒定仪与碱液罐连接后各自与底物罐连通；所述底物罐和填充柱的保温夹套分别与恒温水浴锅连接，所述保温夹套中的水与水浴锅形成循环。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将固定化重组酯酶装入填充柱，将含(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的0.2M、pH 7.0的PB缓冲液作为反应液加入底物槽内，恒温水浴锅温度为20-40℃，开启磁力搅拌，通过pH恒定仪流加碱液罐中的1M NaOH水溶液调节底物罐中pH至7.0；开启蠕动泵，将底物罐中的反应液以0.2-1mL/min的流速通过连接管从填充柱的底部通过填充柱并进入底物罐中进行循环反应，反应液在填充柱内连续循环反应30-720min，反应结束后，反应液分离纯化，获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述填充柱内固定化重组酯酶装填量为0.236g/cm³。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述底物浓度为0.5-2.0mol/L。