CN105779409A - 一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其拆分(R,S)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的应用；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，生成(R)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸，转化率达49.8％，产物光学纯度都在98％以上。

Description

一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种立体选择性酯酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
(二)背景技术
(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸((R)-MAP-acid)是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛的应用于手性合成领域，特别是在手性农药制备方面，其需求量在飞速的增长。(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸经甲酯化以后得到的(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯((R)-DMPM)是制备精甲霜灵的关键中间体。目前通过拆分甲霜灵的外消旋体制备单一构型旋光体的工艺还不适宜大量生产，虽然也可以采用以L-乳酸为原料的手性合成方案，大规模工业化生产，但是由于需要经过繁琐复杂的化学合成步骤，不仅工业生产上费时费力，而且化学反应条件强烈，对环境污染比较严重，不符合人们绿色化学的要求，最重要的是此化学合成产品的最终光学纯度未能达到95％。因此，随着生物手性拆分技术发展，以上这些化学合成方法，必将被反应条件温和，环境友好的生物催化法所取代。
用于生物法制备(R)-DMPM的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分(R,S)-DMPM这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在生物法拆分(R,S)-DMPM中的应用奠定良好的基础。
酯酶(Esterases，EC3.1.1.X)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等；此外，放线菌中也存在个别种属可以产一定量的酯酶。这些野生菌中酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产重组酯酶具有十分重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种立体选择性酯酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯中的应用，解决了精甲霜灵中间体制备过程中中间体(R)-DMPM的ee.值达不到98％以上的技术难题，比利用进口商品脂肪酶拆分制备该化合物在催化剂成本上节省了80％以上。
本发明采用的技术方案是：
一种立体选择性酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。
所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还涉及所述立体选择性酯酶的编码基因，具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：
该立体选择性酯酶基因由如下方法得到：从不解糖假苍白杆菌WZZ003(Pseudochrobactrum asaccharolyticum)中分离纯化得到该立体选择性酯酶基因，N端测序结果经比对获得相似度最高的同源基因序列，设计引物1(5’-ATGCAAAAACAGCATGTTGAAAC-3’)、引物2(5’-TTAACCGCGCAGGAAACG-3’)。利用PCR技术，以来源于不解糖假苍白杆菌WZZ003的基因组DNA为模板克隆酯酶基因片段。将该片段连接到pEASY-E2载体上获得克隆载体pEASY-E2-Est并将其转化于大肠杆菌Trans1-T1中。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为813bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述立体选择性酯酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述立体选择性酯酶基因源自不解糖假苍白杆菌WZZ003(Pseudochrobactrum asaccharolyticumWZZ003)。该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M 2014209，保藏日期：2014年5月23日，已在先前申请专利(申请号：201510134861.3)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明还涉及所述立体选择性酯酶编码基因在制备立体选择性酯酶中的应用，具体的，所述的应用为：构建含有所述立体选择性酯酶基因的重组载体pEASY-E2-Est，将所述重组载体转化至大肠杆菌TransB(DE3)中，获得的重组大肠杆菌TransB(DE3)/pEASY-E2-Est。重组大肠杆菌经诱导培养，培养液经离心分离得到含有立体选择性酯酶的菌体细胞。菌体细胞在超声波破碎后，离心去除细胞碎片，所得的上清液通过Ni-NTA金属螯合亲和层析分离纯化得到重组酯酶。
本发明立体选择性酯酶活力测定方法为：反应体系3mL：2.8mL 50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)和0.1mL 10mmol/L对硝基苯酚乙酸酯(p-NPA)的乙腈溶液混合后，于35℃恒温水浴保温5min。之后加入0.1mL的酶液，并立即计时。反应时间为5min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的酶液作对照。在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
本发明还涉及所述的立体选择性酯酶在催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯中的应用，所述应用以含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(R,S)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以pH6.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质，在30℃，200rpm条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液先用乙酸乙酯萃，分离后的水相经盐酸酸化、乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸。所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为2～50g/L(优选10g/L)，所述底物体积终浓度以缓冲液体积计为2～20％(优选2～10％)。
具体的，1.5mL EP管中加入890μL 200mM pH6.0PBS缓冲液、10～100μL(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，混合后再加适当的重组大肠肝菌菌体，30℃，200rpm条件下反应0.5h～12h，反应结束后先用乙酸乙酯萃取未水解的(S)-DMPM，分离后的水相经盐酸酸化、乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到(R)-MAP-acid，对底物及其转化产物进行液相色谱分析，结果表明，重组大肠杆菌能高效催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，且反应后产物的光学纯度能达到98％以上。
本发明所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养16h，获得种子液；再以体积浓度1％的接种量将种子液接种到新鲜的含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD600为0.4-0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，22℃下诱导培养6～8h，然后在4℃下10000rpm离心10min，收集湿菌体。
本发明所述催化剂还可以为含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的上清液，或湿菌体冷冻干燥获得的冻干菌体；所述超声破碎是将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，超声波破碎，超声2s，间隔6s，有效超声时间5min，离心，获得上清液。
本发明所述催化剂还可以为重组酯酶，所述重组酯酶制备方法为：将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，然后进行超声破碎(超声2s，间隔6s，有效超声时间5min)，破碎悬浮液在4℃下10000rpm离心10min，尽量弃尽细胞碎片得蛋白粗酶液。按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取蛋白粗酶液上样至预平衡Ni2+柱中，再依次用10mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的水溶液洗脱杂蛋白和目的蛋白。用100mM咪唑洗脱重组酯酶后(即收集100mM咪唑水溶液洗脱液)，所得的酶液经超滤膜脱盐浓缩，获得重组酯酶。所述重组酯酶用量以缓冲液体积计为0.02g/L。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于不解糖假苍白杆菌WZZ003(Pseudochrobactrum asaccharolyticumWZZ003)的立体选择性酯酶基因核苷酸序列；该酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组酯酶；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，可以生成(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸，转化率达49.8％，产物光学纯度都在98％以上，产品质量优于化学法制备样品(光学纯度在95％以下)。
(四)附图说明
图1为PCR扩增酯酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为利用引物1-1和引物2扩增得到的酯酶基因片段；M为100bp DNA Ladder Marker；
图2为构建的重组质粒pEASY-E2-Est；
图3为PCR扩增鉴定阳性重组子的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；泳道1至4为PCR扩增的目的DNA片段。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
用核酸提取试剂盒提取不解糖假苍白杆菌WZZ003(PseudochrobactrumasaccharolyticumWZZ003)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(5’-ATGCAAAAACAGCATGTTGAAAC-3’)、引物2(5’-TTAACCGCGCAGGAAACG-3’)的作用下进行PCR扩增。
PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL):
10×TransStart rTaq Buffer(含Mg2+)5μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)12.5μL，浓度为50pM的引物1和引物2各1μL，基因组DNA 1μL，TransTaq DNA聚合酶1μL，加水补至50μL。
PCR反应条件为：预变性94℃，5min，然后进入温度循环94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
取6μL PCR反应液用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明为单一条带，扩增片段大小约为1kb，如图1所示。用DNA液体快速回收试剂盒纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。将该片段同T载体(pEASY-E2，该载体购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接，得到重组质粒pEASY-E2-Est，构建示意图如图2所示。将该重组质粒化学法转化至大肠杆菌T1感受态细胞中，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图3。由图可知，在1kb左右的位置具有单一条带，表明所挑选的菌株均为阳性重组子。获得的阳性重组子经培养后，提取质粒，送样测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为813bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2:
根据实施例1获得的重组质粒用化学法转化至大肠杆菌Trans B(DE3)(该感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司)中，获得含有胞内表达重组质粒pEASY-E2-Est的重组大肠杆菌Trans B(DE3)/pEASY-E2-YsEst。该重组大肠杆菌用含有氨苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基37℃下培养16h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，22℃下诱导培养6～8h，然后在4℃下10000rpm离心10min，收集含有重组酯酶的菌体细胞。所得的重组基因工程菌菌体细胞用50mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，经超声波破碎(超声2s，间隔6s，有效超声时间5min)后，离心去除细胞碎片，所得的上清液即为粗酶液。
该粗酶液基于对硝基苯酚乙酸酯的水解反应，测得其水解对硝基苯酚乙酸酯活力为1.39U/mg，而宿主菌大肠杆菌Trans B(DE3)(阴性对照)按照相同方法检测其水解对硝基苯酚乙酸酯活力仅为0.026U/mg。重组基因工程菌酯酶的水解活力分别是阴性对照的53倍，表明该酯酶基因在大肠杆菌Trans B(DE3)中成功实现过量表达。
酯酶水解硝基苯酚乙酸酯的活力测定方法为：2.8mL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和0.1mL 10mmol/L对硝基苯酚乙酸酯(p-NPA)的乙腈溶液混合后，于35℃恒温水浴保温5min，之后加入0.1mL的粗酶液，并立即计时。反应时间为5min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的粗酶液作对照，在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。酶活力单位定义为在pH 7.5和35℃下，1min氧化1μmol对硝基苯酚NADPH所需的酶量。
实施例3：
实施例2中获得重组大肠杆菌Trans B(DE3)/pEASY-E2-Est湿菌体，用50mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，然后进行超声破碎(超声2s，间隔6s，有效超声时间5min)，破碎悬浮液在4℃下10000rpm离心10min，尽量弃尽细胞碎片得蛋白粗酶液。按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取蛋白粗酶液上样至预平衡Ni2+柱中，再依次用10mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的水溶液洗脱杂蛋白和目的蛋白。收集用100mM咪唑水溶液洗脱后的流出液，经超滤膜脱盐浓缩，然后于-20℃低温保藏，即为重组酯酶。
实施例4：
以实施例2中获得含有重组酯酶的大肠杆菌Trans B(DE3)/pEASY-E2-Est湿菌体为生物催化剂，催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，从而制备(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸。在1mL反应体系中，取0.01g重组湿菌体，加入1mL pH6.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，制成菌悬液，然后加入20μL、50μL、70μL、100μL的外消旋的DMPM，在水浴摇床中30℃、200rpm条件下进行水解反应。每隔1h取一个样。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，有机层取20μL，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析。分析条件包括：色谱柱：Cellud-Y(5μm,4.6×250mm)，流动相：色谱级正己烷/异丙醇/三氟乙酸＝98/2/0.1％(v/v/v),流速：0.5ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl。结果见表1。
表1结果表明，重组大肠杆菌能高效拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯。在湿菌体量都为1％添加量的情况下，2％、5％的(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯分别能在2h、4h反应掉，转化率分别为48.5％和48.3％。而7％、10％的(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯在反应5.5h和9h后转化率分别为49.1％和49.8％。并且整个反应过程中产物光学纯度都在98％以上。
表1：重组细胞催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯
实施例5：
以实施例3中获得的重组酯酶生物催化剂，催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，制备(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸。在1mL反应体系中，加0.02mg重组酯酶，加入1mL pH6.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，然后加入50μL的外消旋的DMPM，在水浴摇床中30℃、200rpm条件下进行水解反应，反应4个小时。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，有机层取20μL，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析。结果显示，重组酯酶在添加量在0.02mg/mL情况下，5％的(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯能在4小时内全部反应掉，转化率为49.6％，光学纯度达到99.2％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种立体选择性酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。
2.一种权利要求1所述立体选择性酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.一种权利要求2所述编码基因在制备立体选择性酯酶中的应用。
6.一种权利要求1所述立体选择性酯酶在催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(R,S)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以pH6.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质，在30℃，200rpm条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液先用乙酸乙酯萃，分离后的水相经盐酸酸化、乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为2～50g/L，所述底物体积终浓度以缓冲液体积计为2～20％。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养16h，获得种子液；再以体积浓度1％的接种量将种子液接种到新鲜的含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD600为0.4-0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，22℃下诱导培养6～8h，然后在4℃下10000rpm离心10min，收集湿菌体。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述催化剂为含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的上清液，超声破碎液分离提取的重组酯酶或湿菌体冷冻干燥获得的冻干菌体；所述超声破碎是将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，超声波破碎，超声2s，间隔6s，有效超声时间5min，离心，获得上清液。
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