CN110055297A

CN110055297A - 一种酯酶在拆分(r,s)-5-己内酯中的应用

Info

Publication number: CN110055297A
Application number: CN201910217706.6A
Authority: CN
Inventors: 郑建永; 李露园; 汪钊; 章银军; 孙杰
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN110055297B

Abstract

本发明提供了一种酯酶在拆分(R,S)‑5‑己内酯中的应用，所述酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌工程菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组酯酶；该重组酯酶具有催化拆分(R,S)‑5‑己内酯的能力，可以获得(S)‑5‑己内酯，对映体过量值>98％和转化率达到49.6％，拆分效率和产品收率高。

Description

一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种酯酶立体选择性催化水解拆分(R,S)-5-己内酯对映体合成单一构型的(S)-5-内酯和(R)-5-羟基己酸的应用。

(二)背景技术

(R,S)-5-己内酯主要用于杏仁、樱桃、黄油、奶油等食用香精，也用于烟草香精，可用于有机合成，为制取5-羟基己酸及其盐类的原料，是重要的香料和有机合成中间体。(S)-5-己内酯比(R)-对映体更不常见，(S)-5-己内酯可用于制备生物活性化合物如信息素，可以通过化学合成生产。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。

酯酶(EC3.1.1.1)因其能催化底物水解，合成短链酯类，因而被广泛应用在食品生产、清洁剂、化妆品、天然产物修饰等行业中。酯酶广泛存在于植物、动物、微生物中。由于微生物具有大规模工业化生产的产量高、反应稳定、操作简单等诸多优点，因而工业用酯酶大都是微生物来源。微生物酯酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的酯酶有较高的工业化应用价值。因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产重组酯酶具有十分重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性酯酶在生物法拆分(R,S)-5-己内酯中的应用，利用该酯酶可以高效拆分(R,S)-5-己内酯，得到高纯度(S)-5-己内酯和(R)-5-羟基己酸。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用(如图1所示)，所述酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示，具体的应用方法为：以含酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以(R,S)-5-己内酯为底物，以pH 7.0缓冲液为反应介质，在25-50℃、1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-5-己内酯和(R)-5-羟基己酸。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10g/L。

进一步，优选反应时间为1-5h，更优选反应条件为35℃、1000rpm反应5h。

进一步，所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21)接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.4-0.6(优选0.5)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到酯酶粗酶粉，即湿菌体冻干粉；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0。

本发明立体选择性酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MPRKRGTSTIKSPGDSKLREKDRTQDEGSKETRGSLWSNVALAIGVLAVGASIPMILSRLDKAYKTTSIDLKKLPATAQVIDQKSFNVLQHVPPPKEVNATTRFLWPGVTYESLTKQPFHVYDAEFLDIIGNDPTLTLIATSNTDPIFHEAVVWSPDTEEVFFAQNAGDPAAGTGLEKSSVVQKISLSDAEAVKNETHISEEVEVKIVDSTPQIINPNGGTNYKGQIIFAGEGQGDNIPSALYLMNPRSPHNTTILVNNYFGRQFNSINDVSVNPRNGDIYFTDTMYGYWQYFRPQPGLQNQVYRFNPETGSLTVVADGFVAPNGLTFSPDGQHAYVTDTGISNALFGLNFTRPASIYRFDVQKDGTWENRKTFAYVAARLPDGIHCDSKGNVYAGCGDGVHVWNSSGKLIGKIYTGVNAANFQFAGKGRMVIMGRTKLFYATLAASGAPLS。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述立体选择性酯酶的编码基因，具体的，所述大肠杆菌密码子优化后的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGCCTCGGAAGCGGGGTACATCGACGATAAAAAGCCCAGGCGACTCCAAACTTCGTGAGAAGGACAGAACCCAAGATGAAGGATCGAAAGAAACAAGAGGCTCACTTTGGAGTAACGTCGCTCTGGCGATAGGAGTACTTGCCGTTGGTGCATCAATCCCAATGATTCTTAGTCGCCTCGACAAAGCCTACAAGACCACCAGTATCGACCTCAAGAAGCTACCGGCCACTGCTCAAGTAATCGACCAGAAGAGCTTCAACGTTCTCCAACATGTTCCGCCGCCAAAAGAAGTCAATGCAACAACACGATTTCTGTGGCCAGGAGTCACGTACGAATCCCTCACCAAGCAGCCATTTCATGTCTATGACGCAGAATTCCTAGACATTATTGGCAACGATCCCACTTTGACCCTGATCGCTACTTCAAACACAGACCCAATCTTTCACGAAGCTGTTGTGTGGAGCCCTGACACCGAAGAGGTCTTTTTCGCCCAAAACGCAGGCGATCCTGCAGCTGGCACTGGCCTTGAAAAGTCCTCAGTTGTTCAGAAGATTTCCTTGAGTGACGCCGAAGCTGTAAAGAATGAGACTCATATATCTGAAGAAGTAGAGGTCAAGATTGTGGATTCAACACCACAAATTATTAACCCGAATGGCGGAACAAACTATAAAGGCCAAATCATCTTTGCAGGGGAAGGACAAGGAGACAATATCCCATCGGCTCTTTATCTGATGAACCCCAGGAGCCCGCATAATACAACAATACTGGTTAACAACTACTTTGGAAGACAGTTCAACTCAATCAACGACGTCTCTGTCAATCCCCGTAATGGCGACATTTACTTCACGGACACCATGTACGGCTACTGGCAGTATTTCCGCCCACAGCCAGGACTGCAGAACCAAGTATATCGCTTCAACCCGGAGACTGGATCTTTGACTGTTGTCGCTGATGGTTTTGTGGCCCCAAACGGCCTCACGTTCTCTCCAGATGGACAACATGCGTATGTGACAGATACTGGTATCAGCAATGCACTCTTCGGTTTGAACTTTACCCGTCCTGCTTCTATCTACCGTTTCGACGTCCAAAAAGATGGAACCTGGGAGAATCGAAAGACTTTCGCATACGTAGCAGCGCGTCTGCCTGATGGGATACACTGTGATTCCAAGGGTAATGTGTACGCGGGCTGTGGAGATGGTGTGCATGTTTGGAATTCTTCGGGGAAGCTCATTGGAAAGATCTATACAGGAGTCAACGCAGCCAACTTTCAGTTCGCTGGAAAGGGCCGCATGGTGATTATGGGGAGGACGAAGCTATTCTATGCCACGCTCGCGGCCTCTGGGGCACCCCTGAGCTGA。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌和该工程菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种酯酶基因核苷酸序列；该酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，再利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂催化拆分(R,S)-5-己内酯，可以生成(S)-5-己内酯，对映体过量值>98％和转化率达到49.6％。与手性胺结晶拆分法相比，具有收率和拆分效率高的优点。本发明生物催化的手性合成反应具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。

(四)附图说明

图1为重组酯酶对映选择性水解拆分(R,S)-5-己内酯的反应示意图；

图2为以pET-28b(+)为载体，酯酶基因A1为目的片段构建的质粒图谱；

图3为(R,S)-5-己内酯标样气相色谱图；

图4为实施例5酯酶催化(R,S)-5-己内酯水解反应5h的气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

实施例1催化水解拆分(R,S)-5-己内酯的酯酶筛选

以数据库NCBI来源的酯酶基因为目的片段，将片段连接到pET28b载体上获得克隆载体并将其转化于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中，获得重组大肠杆菌，对(R,S)-5-己内酯效果进行筛选，结果如表1所示。实验条件：称取0.01g表1中工程菌冻干菌粉于2mLEP管中，加入1mLPB缓冲液(pH 7.0、0.2mM)作为反应溶剂，然后加入0.01g底物(R,S)-5-己内酯，以不加菌体为空白对照，置于35℃，1000rpm恒温混匀仪中反应10min。反应结束后，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡器振荡2min，充分萃取，离心(1200rpm，1min)，得到有机相。取700μL乙酸乙酯层通过气相色谱检测菌体的立体选择性及酶催化水解活性，结果如表1所示，筛选得到底物的对映体过量值>98％和转化率达到49.6％的工程菌A1，源自燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum，GenBank:KIL86940.1)。大肠杆菌表达系统密码子优化后获得基因序列SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为1359bp的开放阅读框(SEQ IDNO.2)。

表1筛选具有内酯水解活性的酯酶

具体气相分析条件：采用Agilent6890气相色谱仪，BGB-174手性毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm×0.25um)，FID检测器；检测条件为柱温从初始温度100℃(恒温保持2min)升温至180℃，升温速率2.5℃/min，进样温度250℃，检测器温度250℃，空气流量和氢气流量分别为300mL/min和30mL/min。载气为高纯N₂，柱头压98.7Kpa；尾吹气流量25.0mL·min^-1；分流比30:1，进样体积为1uL。如GC的结果所示，(R)-5-羟基己酸和(S)-5-己内酯的保留时间分别为20.877min和21.431min(如图3所示)。

实施例2酯酶工程菌蛋白表达诱导条件

将实施例1获得的重组大肠杆菌BL21(A1)接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至为0.5(大概培养2h)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h。300mL菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，10min，收集湿菌体。将收集的湿菌体用冻干机冻干得到酯酶A1粗酶粉，放于4℃冰箱保存。LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

实施例3酯酶A1水解催化拆分不同的内酯化合物

称取实施例2方法制备的0.01g酯酶A1粗酶粉于2mL EP管中，加入1mL PB(pH 7.0、0.2mM)作为反应溶剂，然后加入0.01g底物(表2)，以不加菌体为空白对照，置于35℃，1000rpm恒温混匀仪中反应10min。反应结束后，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡器振荡2min，充分萃取，离心(1200rpm，1min)，得到有机相。取700μL乙酸乙酯层通过气相色谱检测酯酶的立体选择性及酶催化水解活性，结果如表2所示。

表2酯酶A1催化拆分不同的内酯化合物

实施例4不同商品脂肪酶催化(R,S)-5-己内酯水解拆分的效果

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的不同脂肪酶(实施例2制备的酯酶A1粗酶粉、Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM、LipasePSIM)，0.01g(R,S)-5-己内酯，于恒温混匀仪35℃，1000rpm条件下反应5h，取反应液按实施例1方法检测(S)-5-己内酯的对映体过量值和转化率，结果见表3所示。结果显示，在35℃反应10min后，脂肪酶435、TL IM、RM IM和PSIM对底物都没有明显的水解拆分活性，而当酯酶A1催化反应时，产物(S)-5-己内酯的ee值>98％，转化率为49.6％。

表3不同商品脂肪酶催化(R,S)-5-己内酯的水解拆分效果

实施例5反应时间对酶动力学水解拆分(R,S)-5-己内酯的影响

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的实施例2方法制备的酯酶A1粗酶粉，0.01g(R,S)-5-己内酯，于恒温混匀仪35℃，1000rpm条件下反应不同时间(1h-5h)，取反应液按实施例1方法检测(S)-5-己内酯的对映体过量值和转化率，结果见表4所示。

结果表明，反应5h后，产物(S)-5-己内酯的对映体过量值已达到最高，对映体过量值>98％，转化率为49.6％。

表4反应时间对酶催化反应的影响

实施例6反应温度对酶动力学水解拆分(R,S)-5-己内酯的影响

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的实施例2方法制备的酯酶A1粗酶粉，0.01g(R,S)-5-己内酯，于恒温混匀仪不同温度(25-50℃)，1000rpm条件下反应相同时间5h，取反应液按实施例1方法检测(S)-5-己内酯的对映体过量值和转化率，结果见表5所示。

结果说明，在反应温度为35℃时，(S)-5-己内酯的对映体过量值最高，其ee值>98％。当反应温度高于35℃或者低于35℃时，(S)-5-己内酯的对映体过量值都会下降，说明温度对酯酶A1的光学选择性具有很大的影响。

表5反应温度对反应的影响

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)

<400> 1

Met Pro Arg Lys Arg Gly Thr Ser Thr Ile Lys Ser Pro Gly Asp Ser

1 5 10 15

Lys Leu Arg Glu Lys Asp Arg Thr Gln Asp Glu Gly Ser Lys Glu Thr

20 25 30

Arg Gly Ser Leu Trp Ser Asn Val Ala Leu Ala Ile Gly Val Leu Ala

35 40 45

Val Gly Ala Ser Ile Pro Met Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Ala Tyr

50 55 60

Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Lys Lys Leu Pro Ala Thr Ala Gln Val

65 70 75 80

Ile Asp Gln Lys Ser Phe Asn Val Leu Gln His Val Pro Pro Pro Lys

85 90 95

Glu Val Asn Ala Thr Thr Arg Phe Leu Trp Pro Gly Val Thr Tyr Glu

100 105 110

Ser Leu Thr Lys Gln Pro Phe His Val Tyr Asp Ala Glu Phe Leu Asp

115 120 125

Ile Ile Gly Asn Asp Pro Thr Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asn Thr

130 135 140

Asp Pro Ile Phe His Glu Ala Val Val Trp Ser Pro Asp Thr Glu Glu

145 150 155 160

Val Phe Phe Ala Gln Asn Ala Gly Asp Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu

165 170 175

Glu Lys Ser Ser Val Val Gln Lys Ile Ser Leu Ser Asp Ala Glu Ala

180 185 190

Val Lys Asn Glu Thr His Ile Ser Glu Glu Val Glu Val Lys Ile Val

195 200 205

Asp Ser Thr Pro Gln Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Lys

210 215 220

Gly Gln Ile Ile Phe Ala Gly Glu Gly Gln Gly Asp Asn Ile Pro Ser

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Leu Met Asn Pro Arg Ser Pro His Asn Thr Thr Ile Leu

245 250 255

Val Asn Asn Tyr Phe Gly Arg Gln Phe Asn Ser Ile Asn Asp Val Ser

260 265 270

Val Asn Pro Arg Asn Gly Asp Ile Tyr Phe Thr Asp Thr Met Tyr Gly

275 280 285

Tyr Trp Gln Tyr Phe Arg Pro Gln Pro Gly Leu Gln Asn Gln Val Tyr

290 295 300

Arg Phe Asn Pro Glu Thr Gly Ser Leu Thr Val Val Ala Asp Gly Phe

305 310 315 320

Val Ala Pro Asn Gly Leu Thr Phe Ser Pro Asp Gly Gln His Ala Tyr

325 330 335

Val Thr Asp Thr Gly Ile Ser Asn Ala Leu Phe Gly Leu Asn Phe Thr

340 345 350

Arg Pro Ala Ser Ile Tyr Arg Phe Asp Val Gln Lys Asp Gly Thr Trp

355 360 365

Glu Asn Arg Lys Thr Phe Ala Tyr Val Ala Ala Arg Leu Pro Asp Gly

370 375 380

Ile His Cys Asp Ser Lys Gly Asn Val Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly

385 390 395 400

Val His Val Trp Asn Ser Ser Gly Lys Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr

405 410 415

Gly Val Asn Ala Ala Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys Gly Arg Met Val

420 425 430

Ile Met Gly Arg Thr Lys Leu Phe Tyr Ala Thr Leu Ala Ala Ser Gly

435 440 445

Ala Pro Leu Ser

450

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> 燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)

<400> 2

atgcctcgga agcggggtac atcgacgata aaaagcccag gcgactccaa acttcgtgag 60

aaggacagaa cccaagatga aggatcgaaa gaaacaagag gctcactttg gagtaacgtc 120

gctctggcga taggagtact tgccgttggt gcatcaatcc caatgattct tagtcgcctc 180

gacaaagcct acaagaccac cagtatcgac ctcaagaagc taccggccac tgctcaagta 240

atcgaccaga agagcttcaa cgttctccaa catgttccgc cgccaaaaga agtcaatgca 300

acaacacgat ttctgtggcc aggagtcacg tacgaatccc tcaccaagca gccatttcat 360

gtctatgacg cagaattcct agacattatt ggcaacgatc ccactttgac cctgatcgct 420

acttcaaaca cagacccaat ctttcacgaa gctgttgtgt ggagccctga caccgaagag 480

gtctttttcg cccaaaacgc aggcgatcct gcagctggca ctggccttga aaagtcctca 540

gttgttcaga agatttcctt gagtgacgcc gaagctgtaa agaatgagac tcatatatct 600

gaagaagtag aggtcaagat tgtggattca acaccacaaa ttattaaccc gaatggcgga 660

acaaactata aaggccaaat catctttgca ggggaaggac aaggagacaa tatcccatcg 720

gctctttatc tgatgaaccc caggagcccg cataatacaa caatactggt taacaactac 780

tttggaagac agttcaactc aatcaacgac gtctctgtca atccccgtaa tggcgacatt 840

tacttcacgg acaccatgta cggctactgg cagtatttcc gcccacagcc aggactgcag 900

aaccaagtat atcgcttcaa cccggagact ggatctttga ctgttgtcgc tgatggtttt 960

gtggccccaa acggcctcac gttctctcca gatggacaac atgcgtatgt gacagatact 1020

ggtatcagca atgcactctt cggtttgaac tttacccgtc ctgcttctat ctaccgtttc 1080

gacgtccaaa aagatggaac ctgggagaat cgaaagactt tcgcatacgt agcagcgcgt 1140

ctgcctgatg ggatacactg tgattccaag ggtaatgtgt acgcgggctg tggagatggt 1200

gtgcatgttt ggaattcttc ggggaagctc attggaaaga tctatacagg agtcaacgca 1260

gccaactttc agttcgctgg aaagggccgc atggtgatta tggggaggac gaagctattc 1320

tatgccacgc tcgcggcctc tggggcaccc ctgagctga 1359

Claims

1.一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述酯酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以(R,S)-5-己内酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在25-50℃、1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-5-己内酯。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于反应时间为1-5h。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应条件为35℃、1000rpm反应5h。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH7.0、0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含酯酶编码基因的工程菌接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集湿菌体，冻干，得到湿菌体冻干粉。