CN106119303A - 一种蛋白酶拆分制备手性3‑环己烯‑1‑甲酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白酶拆分制备手性3‑环己烯‑1‑甲酸的方法，所述方法为：以外消旋3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯为底物，以碱性蛋白酶为催化剂，以pH为7.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～60℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸和(R)‑3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯。本发明拆分反应条件温和、操作工艺简单、设备需求较低、反应不存在副反应、得到的手性化合物光学纯度高，(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的ee值从化学拆分法的98％提高到99.5％，得率高达32.8％；(R)‑3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯的ee值高达74.2％，得率高达41.1％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种手性3-环己烯-1-甲酸的制备方法，特别涉及一种蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法。
(二)背景技术
3-环己烯-1-甲酸作为手性化合物是一种重要的化学试剂和有机中间体，广泛应用于医药、化工等多个领域。(S)-3-环己烯-1-甲酸是凝血因子Xa的抑制剂依度沙班中间体3,4-二氨基环己烷羧酸衍生物的重要起始原料。而(R)-3-环己烯-1-甲酸也可以用于合成多种药物中间体，如抗肿瘤药物(+)-Phyllanthocin的中间体、FK 506(普乐可复：日本藤泽药品工业株式会社从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素)的C24-C34片段、Leustroducsin B(一种具有包括抗感染、抗癌症转移、促进血小板形成等多种生物活性的物质)的片段C、磷酸奥司他韦(特敏福：预防及治疗流行性感冒药物)的初始原料及(-)-cis-α-鸢尾酮(鸢尾油的主要成分，和紫罗兰一样作为重要香水材料)。
目前，关于手性3-环己烯-1-甲酸拆分制备的报导较少，关于蛋白酶水解拆分制备3-环己烯-1-甲酸更是没有。文献(Tanyeli,C and E.Turkut,Tetrahedron Asymmetry,2004,15(13):2057-2060)描述了一种利用商品化的猪肝酯酶(PLE)，马肝酯酶(HLE)和猪胰脂肪酶(PPL)水解外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯制备手性3-环己烯-1-甲酸。国内有文献(徐春秀,石玉,等,现代药物与临床,2013,28(2):126-128)报导通过化学拆分法以手性苯乙胺为手性拆分剂，外消旋3-环己烯-1-甲酸在丙酮中形成非对映体异构体并利用它们的溶解度差别来进行拆分。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，解决了化学法拆分产品光学纯度只有98％左右(小于99％)，操作繁琐(往往需要10次以上结晶操作)等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，所述方法为：以外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，以碱性蛋白酶为催化剂，以pH为7.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～60℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-环己烯-1-甲酸和(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯。
进一步，所述碱性蛋白酶，活性为5000～10万U/g，优选购自深圳绿微康生物工程有限公司及湖南利尔康有限公司的蛋白酶，或者购自丹麦Novo Nodisk公司的蛋白酶Alcalase 2.4L FG。
进一步，所述底物体积用量以反应介质体积计为1-5％，所述碱性蛋白酶用量以反应介质体积计为100万-200万U/L。
进一步，所述水解反应在20～60℃条件下反应0.5～8h。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：(1)反应完全后，将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收酶，滤液调节pH值至8-9，再加入有机溶剂A萃取，分液得到有机层A和水层A，将有机层A旋转蒸发至无液体流出，获得(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯；将1M氢氧化钠水溶液的反应瓶中加入(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，加热回流搅拌反应5h，反应结束后，反应液加1M盐酸水溶液调节pH为5-6，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机层B，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发得(R)-3-环己烯-1-甲酸；所述有机溶剂B同有机溶剂A；(2)将水层A调节pH值至3-6，加入等体积有机溶剂B萃取三次，收集有机层C，旋转蒸发至无液体流出，得到(S)3-环己烯-1-甲酸；所述有机溶剂C同有机溶剂A。
进一步，所述有机溶剂A为下列之一：乙酸乙酯、正己烷、甲苯或乙醚。
本发明是通过将3-环己烯-1-甲酸甲酯溶于磷酸盐缓冲液，然后加入酶，在酶的催化作用下，3-环己烯-1-甲酸甲酯发生选择性水解反应，获得具有较高光学活性的3-环己烯-1-甲酸，反应选择性好，转化率高，通过简单的萃取获得产物，拆分路线如图1所示。
本发明所述有机溶剂A、有机溶剂B和有机溶剂C均为有机溶剂，为了辨别不同步骤加入不同溶剂及用量而命名，字母本身没有含义。同理，所述有机层A-有机层C，水层A中字母本身没有含义。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明拆分反应条件温和、操作工艺简单、设备需求较低、反应不存在副反应、得到的手性化合物光学纯度高，(S)-3-环己烯-1-甲酸的ee值从化学拆分法的98％提高到99.5％，得率高达32.8％；(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的ee值高达74.2％，得率高达41.1％。
(四)附图说明
图1为手性3-环己烯-1-甲酸拆分路线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：蛋白酶选择性水解拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯
反应式如下：
向装有10mL pH为7.5的磷酸盐缓冲液的反应瓶中加入200μL 3-环己烯-1-甲酸甲酯，0.1g碱性蛋白酶(酶活为10万U/g，购自湖南利尔康生物有限公司)，反应温度控制在30～40℃，通过添加1M NaOH水溶液来恒定pH值为7.5，搅拌反应3h。
反应结束后，反应液通过常规有机溶剂萃取方法：(1)将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收酶，滤液调节pH值至9.0，再加入乙酸乙酯萃取，分液得到有机层A和水层A，将有机层A旋转蒸发至无液体流出，获得(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯；1mL(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入10mL1M氢氧化钠水溶液的反应瓶中，加热回流搅拌反应5h。反应结束后，反应液加1M盐酸水溶液调节pH为5.0，加入3×10mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发得(R)-3-环己烯-1-甲酸。(2)将水层A调节pH值至5.0，加入等体积乙酸乙酯萃取三次，收集有机层，旋转蒸发至无液体流出，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。最终得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值为99.2％，得率28.6％。(R)-3-环己烯-1-甲酸的e.e.值为74.2％，得率41.1％。(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯产品光学纯度要高于化学法拆分产品98.0％左右，更有利于产品下游合成应用。
3-环己烯-1-甲酸甲酯和3-环己烯-1-甲酸的气相色谱手性分析检测条件如下：气相色谱柱：B-DM(0.25mm×30m)；载气为N2(70kPa)，进样口温度：250℃；空气流量300mL/min，尾吹气流量25mL/min；分流比50:1，进样量1.5μL。柱箱升温程序：初始温度100℃保持2min，2℃/min升温至150℃，保持2min。FID检测器温度：250℃。
实施例2：碱性蛋白酶选择性水解拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯
向装有10mL pH为7.5的磷酸盐缓冲液的反应瓶中加入200μL 3-环己烯-1-甲酸甲酯，0.1g碱性蛋白酶(酶活为10万U/g，购自深圳绿微康生物工程有限公司)，反应温度控制在30～40℃，通过添加1M NaOH水溶液来恒定pH为7.5，搅拌反应3h。反应结束后，反应液按实施例1处理方法分离提取。最终得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值为99.1％，得率32.8％。(R)-3-环己烯-1-甲酸的e.e.值为54.2％，得率40.5％。
实施例3：碱性蛋白酶选择性水解拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯
向装有10mL pH为7.5的磷酸盐缓冲液的反应瓶中加入200μL 3-环己烯-1-甲酸甲酯，0.1g蛋白酶Alcalase 2.4L FG(酶活为10万U/g，购自丹麦Novo Nodisk公司)，反应温度控制在30～40℃，通过添加1M NaOH水溶液来恒定pH为7.5，搅拌反应4h。反应结束后，反应液按实施例1处理方法分离提取。最终得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值为99.5％，得率22.1％。(R)-3-环己烯-1-甲酸的e.e.值为65.2％，得率38.2％。
实施例4：不同碱性蛋白酶用量的3-环己烯-1-甲酸甲酯拆分结果
向装有10mL pH为7.5的磷酸盐缓冲液的反应瓶中加入200μL 3-环己烯-1-甲酸甲酯，添加不同质量的碱性蛋白酶(酶活为10万U/g，购自深圳绿微康生物工程有限公司)，反应温度控制在30～40℃，通过添加1M NaOH水溶液来恒定pH为7.5，搅拌反应3h。反应结束后，反应液按实施例1处理方法分离提取。最终得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值和得率由表1所示。
表1不同碱性蛋白酶用量的3-环己烯-1-甲酸甲酯拆分结果
| 序号 | 碱性蛋白酶添加量U/L | 底物e.e.值 | 得率 |
| 1 | 50万 | 82.5％ | 45.2％ |
| 2 | 100万 | 99.1％ | 32.8％ |
| 3 | 150万 | 99.5％ | 31.2％ |
| 4 | 200万 | 99.5％ | 30.5％ |
| 5 | 250万 | 99.5％ | 25.2％ |
实施例5：其他水解酶对于3-环己烯-1-甲酸甲酯拆分结果
向装有10mL pH为7.5的磷酸盐缓冲液的反应瓶中加入200μL 3-环己烯-1-甲酸甲酯，添加0.1g其他水解酶(蛋白酶、酯酶和脂肪酶)，反应温度控制在30～40℃，通过添加1MNaOH水溶液来恒定pH为7.5，搅拌反应3h。反应结束后，反应液按实施例1处理方法分离提取。最终得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值和得率由表2所示。
表2其他水解酶对3-环己烯-1-甲酸甲酯拆分结果
| 序号 | 酶类型 | 底物e.e.值 | 得率 |
| 1 | 猪肝酯酶 | 40.5％ | 40.2％ |
| 2 | 木瓜蛋白酶 | 56.1％ | 32.8％ |
| 3 | Novozyme 435脂肪酶 | 28.4％ | 25.2％ |
| 4 | Lipozyme TL IM脂肪酶 | 35.5％ | 20.5％ |
| 5 | 猪胰脂肪酶 | 56.5％ | 45.2％ |
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，其特征在于所述方法为：以外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，以碱性蛋白酶为催化剂，以pH为7.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～60℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-环己烯-1-甲酸和(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯。
2.如权利要求1所述蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，其特征在于所述底物体积用量以反应介质体积计为1-5％，所述碱性蛋白酶用量以反应介质体积计为100万-200万U/L。
3.如权利要求1所述蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，其特征在于所述水解反应在20～60℃条件下反应0.5～8h。
4.如权利要求1所述蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：(1)反应完全后，将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收酶，滤液调节pH值至8-9，再加入有机溶剂A萃取，分液得到有机层A和水层A，将有机层A旋转蒸发至无液体流出，获得(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯；然后将(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1MNaOH水溶液加热回流搅拌反应5h，再加1M盐酸水溶液调节pH为5-6，加入等体积有机溶剂B萃取3次，合并有机层B，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发得(R)-3-环己烯-1-甲酸；所述有机溶剂B同有机溶剂A；(2)将水层A调节pH值至3-6，加入有机溶剂C萃取，收集有机层C，旋转蒸发至无液体流出，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸；所述有机溶剂C同有机溶剂A。
5.如权利要求4所述蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，其特征在于所述有机溶剂A为下列之一：乙酸乙酯、正己烷、甲苯或乙醚。
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