CN101085984A

CN101085984A - 一种低温脂肪酶及其基因序列

Info

Publication number: CN101085984A
Application number: CN 200710013994
Authority: CN
Inventors: 林秀坤; 陈雷; 牛荣丽; 董平原; 王征; 宋春霞
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2007-04-07
Filing date: 2007-04-07
Publication date: 2007-12-12

Abstract

本发明公开了一种低温脂肪酶及其编码基因与应用。该低温脂肪酶的基因，是与序列表中SEQNo.1限定的DNA序列具有70％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。该低温脂肪酶基因编码的蛋白质，是具有序列表中SEQ No.2氨基酸序列的蛋白质或由序列2衍生的具有相同活性的蛋白质。本发明还公开了低温脂肪酶工程菌的构建方法和利用该工程菌生产低温脂肪酶的方法。本发明提供的低温脂肪酶在低温下具有较好的活性和稳定性，可以应用在洗涤剂工业、食品工业、生物制药、环境生物技术等领域，具有广泛的应用前景和经济意义。

Description

一种低温脂肪酶及其基因序列

技术领域

本发明涉及从海洋假单胞菌(Pseudomonas sp)中分离纯化的一种低温脂肪酶及其编码的基因序列，低温脂肪酶工程菌的构建，以及利用该工程菌制备低温脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又称甘油酯水解酶，是指分解高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酯酯键的酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物中。

脂肪酶作为一种重要的工业酶，可应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性、添加于洗涤剂和化妆品中等。特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。

微生物脂肪酶种类多且具有比动物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围和更多对底物的专一性类型，又便于工业生产以获取高纯度制剂，同时微生物脂肪酶在酶的理论研究和实际应用中也发挥着重要作用。

脂肪酶已从多种不同的微生物中得到分离研究，如青霉、白地霉、根霉、假丝酵母等。其中多数脂肪酶的最适作用温度在50℃左右，在低温时的酶活力很低。因而具有优良低温活性的低温脂肪酶成为酶学研究新的热点。低温脂肪酶具有下列4个特征：(1)在较低的温度下可以得到较多的脂肪酶。(Feller G，et al，Microbioz Biotechnol，1994(41)：477-479)(杨秀霞等，生命的化学，2003，23(3)：204-206)(2)低温脂肪酶的最适作用温度较低。(Arpigny JL，et al，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1997(3)：29-35)(3)低温脂肪酶的比活力高，热稳定性差。一般说来，酶的比活力是和热稳定性呈负相关。(4)低温脂肪酶的活化能低。(Arpigny JL，et al，Biochem Biophys Acta，1993(1171)：331-333)。应用基因工程技术克隆表达低温脂肪酶基因为新的酶产品的开发利用提供了广阔的前景。

关于脂肪酶基因已有一些文献报道和专利。如Raja等报道的热稳定脂肪酶(美国US2006/0062789)；Jeon J H等报道的来自深海的低温脂肪酶(韩国KR2006103045-A)；Mlasnikov A等报道的来自链霉素的脂肪酶(欧洲专利WO2006008653-A2)；Rey等报道的脂肪酶(美国US 2002/6423898)；Yuji等报道的脂肪酶(日本JP 1990/2174680)。

近年来脂肪酶的应用范围不断拓宽，已成为目前国际上最为重要的工业酶之一。不仅应用于人们的日常生活中，如洗衣粉、污水处理，还应用于精细化工、生物柴油、医药工业、食品工业等行业中。来源于不同脂肪酶的底物专一性、最适催化条件和稳定性都有差异。其中低温脂肪酶以其高度的低温稳定性而具有更广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温脂肪酶及其编码基因，其工程菌的构建方法和利用该工程菌生产低温脂肪酶的方法与应用。该低温脂肪酶在低温下具有较好的活性和稳定性，可以应用在洗涤剂工业、食品工业、生物制药、环境生物技术等。

本发明从海洋假单胞菌(Pseudomonas sp)分离的低温脂肪酶，其基因序列是由1131bp组成的DNA片段，编码一个由376个氨基酸组成的蛋白质。该酶的分子量为37000KDa，反应温度为0-30℃，最适作用温度为25℃，在0℃仍可保持37％的相对酶活，反应pH为6-9，最适pH为8.0。

本发明提供一种编码低温脂肪酶的基因，该基因具有下列核苷酸序列：

①序列表中SEQ No.1所示的核苷酸序列。

②不同于SEQ No.1，但编码的氨基酸序列与SEQ No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。

③与序列表中SEQ No.1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

④在中度严谨条件下能与序列表SEQ No.1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供一种低温脂肪酶，该酶具有下列氨基酸序列：

①权利要求2所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

②SEQ No.2所示的氨基酸序列。

③或者是将SEQ No.2的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ No.2的氨基酸序列相同活性的由SEQ No.2衍生的蛋白质。

本发明中生产低温脂肪酶的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞：

①序列表中的SEQ No.1。

②编码序列表中的SEQ No.2氨基酸序列的多核苷酸。

③与序列表中的限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

其中所述原核细胞或真核细胞优选为大肠杆菌、枯草杆菌和酵母细胞。

本发明中所述的工程菌是含有如上所述的表达载体的重组大肠杆菌BL21LIP。

同时本发明还通过分子生物学的方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达该脂肪酶。因此本发明同时提供一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它更有利于在生产应用的受体菌上，由其它菌株或在其它培养条件下产生本发明所涉及的脂肪酶。

具体方法如下：从海洋假单胞菌中提取总DNA，经PCR得到含有脂肪酶基因的DNA片段，经双酶切和连接构建含有该基因的重组质粒pL-1，转化大肠杆菌BL21，获得含有低温脂肪酶基因的工程菌BL21LIP。工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃振荡培养16h后，转接发酵罐。当菌体的OD值达到0.6-1.0时，加入终浓度为0.6mM的ITPG诱导表达。

附图说明

图1为pL-1重组质粒的构建示意图

具体实施方式

实施例1海洋假单胞杆菌总DNA的提取

1.采用从海洋中分离的假单胞菌(Pseudomonas sp)，取其新鲜的湿菌体20g，悬于10ml50mM Tris缓冲液中(pH8.0)。

2.加入少量溶菌酶和8ml 0.25mM EDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min。

3.加入2ml 10％SDS，55℃放置5min。

4.分别用等体积酚和氯仿各抽提一次。

5.取最后一次的上清液，加入2倍体积的乙醇，回收DNA。

6.分别用70％乙醇和无水乙醇洗。

7.沉淀溶于0.5ml TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mM EDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1h。

8.分别用等体积酚和氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积的乙醇，回收DNA。

9.分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤沉淀。

10.将沉淀溶于TE缓冲液(pH8.0)中，-20℃保存备用。

实施例2低温脂肪酶基因的克隆

1.取海洋假单胞菌的总DNA溶液0.5μl作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物(包含BamHI和HindIII的酶切位点)，经常规PCR技术扩增得到所要的DNA片段。

引物序列如下：

引物1：5’-CTAAGCTTGTATCATTTTCGCGTCGT-3’

引物2：5’-AGGGATCCGATGACTGATACATCGGC-3’

2.回收PCR产物，经过限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-28a的DNA在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组的质粒pL-1。

4.用重组的质粒转化感受态大肠杆菌BL21。涂于含50μg/ml Kan(卡那霉素)和橄榄油的LB固体培养基上。37℃培养12h，再在60℃培养1-5h，菌落周围有明显的透明圈即为阳性克隆。

5.对阳性菌落用碱法提取重组质粒，经限制性酶水解重组质粒，根据电泳结果证实为该DNA片段(序列表中的SEQ No.1核苷酸序列)正确插入质粒。含有该DNA片段的重组质粒为pL-1，含有此重组质粒pL-1的重组大肠杆菌为BL21LIP。

6.经Sanger双脱氧法进行DNA片段的测序，结果表明插入片段含有一个长1131bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由376个氨基酸组成的蛋白质。

实施例3低温脂肪酶基因在工程菌BL21LIP中的高效表达

工程菌BL21LIP在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃振荡培养16h后，转接发酵罐。当菌体的OD值达到0.6-1.0时，加入终浓度为0.6mM的ITPG诱导表达。

实施例4重组脂肪酶的纯化和特性

收集菌体悬于磷酸缓冲液中，用超声波破碎细胞，离心后的上清液为重组脂肪酶的粗酶液。粗酶液用截留分子量为10KDa的切向流超滤膜包浓缩和部分纯化，浓缩液经离子交换柱和Sephadex G100柱层析等步骤纯化，经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组脂肪酶的分子量为37000KDa。

重组脂肪酶的特性：①反应温度为0-30℃，最适温度为25℃，在0℃仍可保持37％的相对酶活。②反应pH为6.0-9.0，最适pH为8.0。③该酶对短链的脂肪类物质具有较高的酶活性，具有较为广泛的应用前景。

本领域的普通研究人员都知道，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

SEQ No.1

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种低温脂肪酶及其基因序列

<130>1

<140>1131

<150>DNA

<160>Pseudomonas sp

ATGACTGATA CATCGGCAAT GACAAAATCA GGGGCAAAAC TTTTAGCGAA AGACGTATAC 60

GCCGTTTGGT TGGGTTGGTC GTTGGGTGGG TTGTGCGCTA CTCATTTTGC GCTAGTGCAT 120

AATCGTTTTT TAGCCATTCA AGCGATGGGC AGTGAAACGG CTAAACAAGA CATTAAACAA 180

ATAATGACAA CTGGAGGATT TGGACCTGTT CCTTATACTT ATATGTTGAT TTATGGATTA 240

CGTTATCTAC CGCAATCACC GAGTCTTATA TTTAAAGCTT CTTCTCATGC GCCTTTTATT 300

CATATAGCGC GCAGCAAAGC CAATGCAGCA CTAGATAACA TTGCTGATGA CACCGTCGGC 360

GTGACTAATA CATTGGGGCC TTATGTAGTT GAGTTTAAAA GCCGTCATCC CTCATTTTAT 420

GGCTTTAGCG GCTTTCGGAT GGATGCCATT GCCCATGTCG ATACCGACTT TACCCGCGAC 480

TGGATCAATC ATGTGCAGTG GGCTACCAGC GAAGACGTGT TCTTTGTGGC GGAAGCCTGG 540

GTCAGTGATA TCAACGGTTA TCTGGATGCC GTCAATACGC CGCACTTACG CGCCTTCGAC 600

TTTAATCTGC GCGAAGATTT TGTCGCCTTA AGTAGTGGCA GCAAAGATAT GCGTTGGTGG 660

ATGCTGATGT CGGGTCGTAA CTGGGGTGGC CAGCAGTCTT TTAGCATCAA CAGCCACCAG 720

GCCAATACCA CCTTCTATGA TTACACCGGC AATTCAGCTG GCACGGTGAC CACCAATGCG 780

CAGGGTTATG GCAGCTTCCC GGTCAATATG ACGGAAAGTA CCGGTTGGTC AGTCTGGGTA 840

GGCAGCTTCT ACCCGTCCGG CAACGGCTAC CTGGCGCTGT ACGGGTGGAC CTCGAACCCG 900

CTCGTCGAGT ACTACATCGT CGACAACTGG GGCAACTACC GGCCCACCGG AACGTACAAG 960

GGCACGGTCA CCAGCGGCGG CGGCTACTAC ATGATCCTCG CCACCGAGGG CTACCAGAGC

1020

TCGTGGACGA ACTGCGGGAA CACCGACGGC GGGGGTTTCG GCTACTGGAG CGTCCGGCAG

1080

GGCTACCTGG CGTACAAGGG CACGGGCGGC ACCATCACGA CGCGAAAATG A

1131

SEQ No.2

<210>2

<220>376

<230>PRT

<240>Pseudomonas sp

Met Thr Asp Thr Ser Ala Met Thr Lys Ser Gly Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asp Val Tyr 20

Ala Val Trp Leu Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Cys Ala Thr His Phe Ala Leu Val His 40

Asn Arg Phe Leu Ala Ile Gln Ala Met Gly Ser Glu Thr Ala Lys Gln Asp Ile Lys Gln 60

Ile Met Thr Thr Gly Gly Phe Gly Pro Val Pro Tyr Thr Tyr Met Leu Ile Tyr Gly Leu 80

Arg Tyr Leu Pro Gln Ser Pro Ser Leu Ile Phe Lys Ala Ser Ser His Ala Pro Phe Ile 100

His Ile Ala Arg Ser Lys Ala Asn Ala Ala Leu Asp Asn Ile Ala Asp Asp Thr Val Gly 120

Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Val Glu Phe Lys Ser Arg His Pro Ser Phe Tyr 140

Gly Phe Ser Gly Phe Arg Met Asp Ala Ile Ala His Val Asp Thr Asp Phe Thr Arg Asp 160

Trp Ile Asn His Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Asp Val Phe Phe Val Ala Glu Ala Trp 180

Val Ser Asp Ile Asn Gly Tyr Leu Asp Ala Val Asn Thr Pro His Leu Arg Ala Phe Asp 200

Phe Asn Leu Arg Glu Asp Phe Val Ala Leu Ser Ser Gly Ser Lys Asp Met Arg Trp Trp 220

Met Leu Met Ser Gly Arg Asn Trp Gly Gly Gln Gln Ser Phe Ser Ile Asn Ser His Gln 240

Ala Asn Thr Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ser Ala Gly Thr Val Thr Thr Asn Ala 260

Gln Gly Tyr Gly Ser Phe Pro Val Asn Met Thr Glu Ser Thr Gly Trp Ser Val Trp Val 280

Gly Ser Phe Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Ser Asn Pro 300

Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Asn Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys 320

Gly Thr Val Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Tyr Met Ile Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser 340

Ser Trp Thr Asn Cys Gly Asn Thr Asp Gly Gly Gly Phe Gly Tyr Trp Ser Val Arg Gln 360

Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Arg Leu 376

Claims

1.一种从海洋假单胞菌(Pseudomonas sp)中分离纯化的低温脂肪酶。

2.一种编码低温脂肪酶的基因，该基因具有下列核苷酸序列：

①序列表中SEQ No.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的编码低温脂肪酶的基因，其特征是该基因具有SEQ No.1所示的核苷酸序列。

4.一种低温脂肪酶，该酶具有下列氨基酸序列：

①权利要求2所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

②SEQ No.2所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的低温脂肪酶，其特征是该酶具有SEQ No.2所示的氨基酸序列。

6.一种生产低温脂肪酶工程菌的构建方法，包括以下步骤：

①构建含有低温脂肪酶基因的表达质粒。

②将其转化到宿主细胞中。

③经抗性培养基筛选得阳性克隆。

7.生产低温脂肪酶的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一原核细胞或真核细胞：

①序列表中的SEQNo.1。

②编码序列表中的SEQ No.2蛋白质序列的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的工程菌是含有权利要求6所述的表达载体的重组大肠杆菌BL21LIP。

9.一种生产低温脂肪酶的方法步骤，包括：

(1)按照权利要求8所述的重组菌

(2)按照权利要求8所述的重组菌是一种含有重组质粒pL-1的重组大肠杆菌BL21LIP，

(3)重组菌通过微生物发酵和酶工程制备低温脂肪酶的方法。