JP2019503688A - 多糖分解酵素を分泌するように遺伝子改変された乳酸利用細菌 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
第1の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたLA利用細菌の第1の亜集団と、
第2の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたLA利用細菌の第2の亜集団と、
第3の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたLA利用細菌の第3の亜集団と、
を含み、第1の多糖分解酵素はセルラーゼであり、第2の多糖分解酵素はヘミセルラーゼであり、第3の多糖分解酵素はアミラーゼである。一部の実施形態において、ヘミセルラーゼはキシラナーゼである。
(i)有機廃棄物を、多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された本発明のLA利用細菌または本発明のLA利用細菌の集団と、LA利用細菌による乳酸の消費ならびに多糖分解酵素の発現および活性に適した条件の下で接触させることによって有機廃棄物を処理して、廃棄物中に存在するD−乳酸、L−乳酸またはそれらの組み合わせを除去するとともに廃棄物中の多糖を少なくとも部分的に分解して可溶性の還元糖を遊離させることと、
(ii)LA利用細菌を不活性化することと、
(iii)D−乳酸およびL−乳酸のうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物を用いて、(i)で得られた可溶性の還元糖を発酵させて乳酸の個別のエナンチオマー(複数可)を得ることと、
(iv)発酵ブロスから個別の乳酸エナンチオマー(複数可)を回収することと、
を含む。
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、
少なくとも1つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド(SP)をコードする少なくとも1つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも1つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも1つの発現カセットと、
を含む。
LA利用細菌は、1種以上の外因性の多糖分解酵素を産生するように本発明に従って操作される。本明細書で使用される場合、外因性の多糖分解酵素に関しての「産生する」は、発現(細胞内でのタンパク質の生成)を、および必要に応じて分泌を、意味する。一部の実施形態において、1種以上の外因性の多糖分解酵素は、分泌性酵素として細菌に導入操作される。これらの実施形態によれば、LA利用細菌は、1種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変される。他の実施形態では、1種以上の外因性の多糖分解酵素は、LA利用細菌の細胞の溶解の後にのみ有機廃棄物中の多糖に対して活性があるように、非分泌性酵素として細菌に導入操作される。これらの実施形態によれば、LA利用細菌は、1種以上の外因性の多糖分解酵素を発現するように遺伝子改変される。
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、
少なくとも1つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド(SP)(またはそのホモログ)をコードする少なくとも1つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも1つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも1つの発現カセットと、
を含む。
発現ベクターが、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、
少なくとも1つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド(SP)をコードする少なくとも1つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも1つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも1つの発現カセットと、
を含む、
プロピオン酸菌が提供される。
一部の実施形態において、処理される有機廃棄物は、典型的には、内在性のD,L−乳酸を含む。
一部の実施形態において、有機廃棄物の還元糖(廃棄物中に元々見出されるもの、および多糖分解酵素の作用によって遊離したもの)は、LA生成微生物によって乳酸に発酵されてもよい。乳酸の一方の個別のエナンチオマーのみを生成するために、使用されるLA生成微生物は、D−乳酸とL−乳酸のエナンチオマーのうちの一方のみを産生する。LA生成微生物は、天然に一方のエナンチオマーのみを産生してもよいか、あるいは、例えば望ましくないエナンチオマーの合成に関与する1種以上の酵素をノックアウトすることによって、一方のエナンチオマーのみを産生するように遺伝子改変されてもよい。
工業用途に適しているPLAを生成するためには、重合プロセスは、一方のエナンチオマーのみを利用すべきである。不純物またはD−乳酸とL−乳酸のラセミ混合物の存在は、望ましくない特性(低い結晶化度および低い融解温度など)を有するポリマーをもたらす。従って、L−乳酸エナンチオマーのみ、またはD−乳酸エナンチオマーのみを産生する乳酸菌が必要とされる。
1.有機廃棄物を得るステップ。有機廃棄物は、住宅からの食品廃棄物、商業的食品廃棄物または工業的食品廃棄物から選択されてもよい。有機廃棄物は、供給元で分別されてもよいか、機械で分別されてもよい。
2.有機廃棄物のサイズを低減するステップ:均質な半固体の原料を達成するために、有機廃棄物の細分化および粉砕を適用してよい。さらに、超音波処理を用いて、それにより、サイズの低減と滅菌を1つにまとめることもできる。これは、同じ稼働ユニットにおいて行うことができる。
3.滅菌ステップ:例えば超音波処理、熱、UVおよび/または圧力を用いて、達成できる。これは、発酵槽稼働ユニット内でそのまま、または外部から、行うことができる。一部の実施形態では、上述のように、このステップは、サイズを低減するステップと1つにまとめることができる。
4.遺伝子操作されたLA利用細菌を播種するステップ:遺伝子操作されたLA利用細菌を種発酵槽稼働ユニットに植菌して酵素を産生させることができる。さらに、下流の処理からのラクテート副生成物を、このステップで原料として添加できる(以下でさらに詳述する)。LA利用細菌はまた、YELなど、合成培地で培養することもできる。
5.植菌および多糖分解酵素とCO2の同時産生およびラセミ体ラクテートの消費のステップ:LA利用細菌の種を生産発酵槽に植菌して、酵素をさらに産生させるとともに有機廃棄物中のラセミ体ラクテートを消費させる。
6.LA利用細菌を不活性化するステップ:発酵槽内の温度を(例えば、45〜55℃に)上昇させて、LA利用細菌の不活性化(滅菌)をもたらしてもよい。有利には、そのような上昇した温度が、それらの活性のために改善された条件(最適条件など)をもたらすLA利用細菌によって分泌された、分泌性多糖分解酵素の活性をさらに亢進してもよい。
7.乳酸生成生物(純粋なL体または純粋なD体の生産者)を植菌するステップ:結果として、発酵培地は、ラセミ体ラクテートが枯渇し、(分泌された分解酵素によって生じた)還元糖は、乳酸発酵プロセスに利用可能となる。
8.乳酸を回収および精製するステップ:様々な精製方法(またはそれらの組み合わせ)を利用して鏡像異性的に純粋な乳酸を精製できる。そのような方法には、例えば、マイクロ/ナノ濾過、遠心分離、イオンクロマトグラフィー、沈殿、結晶化等が包含される。
9.PLLAまたはPDLAに重合させるステップ:精製された乳酸のPLAへの重合は、ラクチド(ジ−乳酸)の形成を介した重合および乳酸モノマーの直接縮合を含む、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
E.coli−P.freudenreichiiシャトルベクターの構築:
構築されるベクターは、E.coliおよびP.freudenreichiiの両方において使用できる。
以下のようにpOWR3ベクター(図2Aに概略図を示す)を調製した:プロピオン酸菌の複製タンパク質の配列(配列番号84)とクロラムフェニコール耐性遺伝子(Corynebacterium striatum pT10プラスミドに由来するcmx(A)(配列番号85)とcml(A)(配列番号86))をタンデムに合成して、E.coliの複製開始点(ori)とアンピシリン耐性カセット(AmpR)とを含むベクターに導入した。これは、E.coliおよびP.freudenreichiiの両方において複製可能な約5.6kbpのプラスミドをもたらす。このベクターは、PBの複製開始点の配列をさらに含む。得られたpOWR3ベクターは、他の公知のP.freudenreichii用発現ベクターよりも小さく(5.6kbp対6.2〜8kbp)、これは、(例えばエレクトロポレーションによる)細菌細胞への形質転換をより容易にするとともに、制限酵素によらない方法によるクローニングのために使用することをより容易にする。さらに、pOWR3のAmpR遺伝子の配列の領域は、(以下で詳述するように)発現カセットを挿入するためのクローニング部位として使用される。この領域は、極性効果の干渉を妨げるとともに細菌細胞内で産生される(多糖分解酵素の)mRNA転写物を安定化させる、終結シグナルによって(上流および下流の)境界が定められている。
エレクトロポレーションによってpOWR3をP.freudenreichiiに形質転換した。P.freudenreichiiの混濁培養液を1:125の希釈となるように新鮮なYEL培地(10g/lの酵母エキス、10g/lのペプトン、10g/lのラクテート)に加え、好気性条件下で30℃において一晩培養した。この培養液(O.D600=0.2〜1.9)を氷上に30分間置いた後、同じ体積の氷冷水で2回洗浄した(3000rpm、10分)。3回目の洗浄は、同じ体積の冷10%グリセロールでおこなった(3000rpm、10分)。ペレットを冷10%グリセロール中に濃縮した(元の培養液の0.01%)。50μlのエレクトロコンピテントのP.freudenreichiiをチューブ内で1000ngのpOWR3ベクターと混合した。この細菌とベクターの混合物を0.1cmの間隙のキュベット(Biorad)に移し、以下の条件を用いてエレクトロポレーションした。電界強度:20000V/cm、抵抗:500オーム、コンデンサ:25μF。900μlのYEL培地を添加し、細菌を好気性条件下で30℃において3時間インキュベートした後、YEL培地+10μg/mlのクロラムフェニコールの寒天プレート上に広げた。
・Propionibacterium frudenreichii ATCC 9614由来のPFREUD_04850プロモーター(配列番号27);
・Propionibacterium frudenreichii BIA118由来のPFRUD_04850プロモーター(配列番号28);
・Propionibacterium frudenreichii ATCC 9614由来のPFREUD_22150プロモーター(配列番号29);
・Propionibacterium frudenreichii ATCC 9614由来のPFREUD_08450プロモーター(配列番号30);
・Propionibacterium frudenreichii ATCC 9614由来のPFREUD_18290(配列番号31);
・pGROプロモーター(Propionibacterium acidipropionici由来のpgroプラスミド)(配列番号32)。
>CBL57338 surface layer protein A(S−layer protein A) PFREUD_18290[Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号87(アミノ酸配列)、配列番号180(ヌクレオチド配列))。
>CBL56016.1 cell−wall peptidases, NlpC/P60 family secreted protein PFREUD_04850[Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号88(アミノ酸配列)、配列番号181(ヌクレオチド配列))。
>CBL56360.1 DSBA oxidoreductase[Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号89(アミノ酸配列)、配列番号182(ヌクレオチド配列))。
CBL57333.1 Hypothetical protein PFREUD_18250[Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号90(アミノ酸配列)、配列番号183(ヌクレオチド配列))
gi|296921799|emb|CBL56359.1| thiredoxine like membrane protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号91(アミノ酸配列)、配列番号184(ヌクレオチド配列))
>gi|296923311|emb|CBL57911.1| drug exporters of the RND superfamily [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号92(アミノ酸配列)、配列番号185(ヌクレオチド配列))
>gi|296921405|emb|CBL55958.1| Putative carboxylic ester hydrolase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1(配列番号93(アミノ酸配列)、配列番号186(ヌクレオチド配列))。
gi|296921680|emb|CBL56237.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号94(アミノ酸配列)、配列番号187(ヌクレオチド配列))。
>gi|296922532|emb|CBL57105.1| S−layer domain protein domain protein precursor [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号95(アミノ酸配列)、配列番号188(ヌクレオチド配列))。
>gi|296922233|emb|CBL56805.1| ABC transporter [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1] MRLARRVAAVLLASVLALTVASCAGAARSAPSL(配列番号96(アミノ酸配列)、配列番号189(ヌクレオチド配列))。
>CBL57324.1 Hypothetical protein PFREUD_18170 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号97)。
>CBL57805.1 polar amino acid ABC transporter, binding protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号98)。
>CBL57413.1 Sortase family protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号99)。
>CBL57271.1 Probable multidrug resistance transporter, MFS superfamily [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号100)。
>CBL57337.1 Hypothetical protein PFREUD_18280 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号101)。
gi|296922302|emb|CBL56874.1| Putative peptidyl−prolyl cis−trans isomerase, FKBP−type (Precursor) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1] CIRM−BIA1(配列番号102)。
gi|296923259|emb|CBL57856.1| Extracellular solute−binding protein precursor [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号103)。
gi|296923146|emb|CBL57733.1| Hypothetical protein PFREUD_22300 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号104)。
gi|296921378|emb|CBL55931.1| Hypothetical protein PFREUD_03980 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号105)。
gi|296921927|emb|CBL56487.1| Hypothetical membrane protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1] (配列番号106)。
gi|296922947|emb|CBL57529.1| carboxypeptidase (serine−type D−Ala−D−Ala carboxypeptidase) (D−alanyl−D−alanine−carboxypeptidase) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号107)。
>gi|296923326|emb|CBL57926.1| ABC transporter, substrate−binding protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号108)。
>gi|296923322|emb|CBL57922.1| Hypothetical protein PFREUD_24060 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号109)。
>gi|296922617|emb|CBL57194.1| Hypothetical protein PFREUD_16830 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号110)。
>gi|296922915|emb|CBL57497.1| secreted glycosyl hydrolase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号111)。
>gi|296921377|emb|CBL55930.1| Hypothetical protein PFREUD_03970 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号112)。
>gi|296922301|emb|CBL56873.1| peptidyl−prolyl cis−trans isomerase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号113)。
>gi|296922866|emb|CBL57446.1| Hypothetical protein PFREUD_19530 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号114)。
>gi|296922346|emb|CBL56918.1| Hypothetical protein PFREUD_14190 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号115)。
>gi|296921344|emb|CBL55897.1| Hypothetical protein PFREUD_03630 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号116)。
>gi|296922653|emb|CBL57230.1| Hypothetical protein PFREUD_17190 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号117)。
>gi|296921113|emb|CBL55660.1| extracellular protein without function [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号118)。
>gi|296921687|emb|CBL56244.1| Hypothetical protein PFREUD_07130 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号119)。
>gi|296921593|emb|CBL56147.1| Hypothetical protein PFREUD_06170 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号120)。
>gi|296922523|emb|CBL57096.1| Hypothetical protein PFREUD_15980 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号121)。
>gi|296921018|emb|CBL55556.1| large surface protein A [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号122)。
>gi|296922853|emb|CBL57433.1| Penicillin−binding protein (Transglycosylase/transpeptidase) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号123)。
>gi|296921190|emb|CBL55739.1| Hypothetical protein PFREUD_02240 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号124)。
>gi|296922847|emb|CBL57427.1| multicopper oxidase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号125)。
>gi|296923003|emb|CBL57585.1| Regulator of chromosome condensation [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号126)。
>gi|296923209|emb|CBL57803.1| polar amino acid ABC transporter, binding protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号127)。
>gi|296923210|emb|CBL57804.1| polar amino acid ABC transporter, binding protein component [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号128).
>gi|296921884|emb|CBL56444.1| ABC−transporter metal−binding lipoprotein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号129)。
>gi|296921649|emb|CBL56206.1| iron ABC transport system, solute−binding protein precursor [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号130)。
>gi|296922500|emb|CBL57073.1| Peptidase M23B family / metalloendopeptidase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号131)。
>gi|296922061|emb|CBL56625.1| transporter [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号132)。
>gi|296921977|emb|CBL56539.1| Hypothetical protein PFREUD_10150 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号133)。
>gi|296921310|emb|CBL55863.1| Hypothetical protein PFREUD_03320 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号134)。
>gi|296921967|emb|CBL56527.1| ABC transporter, substrate binding protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号135)。
>gi|296921196|emb|CBL55745.1| Hypothetical protein PFREUD_02300 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号136)。
>gi|296921666|emb|CBL56223.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号137)。
>gi|296921230|emb|CBL55780.1| ABC transporter, binding lipoprotein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号138)。
>gi|296923102|emb|CBL57689.1| polar amino acid ABC transporter, binding protein component [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号139)。
>gi|296923079|emb|CBL57663.1| Sulfate−binding protein precursor [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号140)。
>gi|296921569|emb|CBL56123.1| solute binding protein of the ABC transport system [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号141)。
>gi|296922906|emb|CBL57488.1| Phosphate−binding transport protein of ABC transporter system [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号142)。
>gi|296920974|emb|CBL55511.1| membrane protein (s−layer) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号143)。
>gi|296922551|emb|CBL57124.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号144)。
>gi|296923279|emb|CBL57879.1| penicillin−binding protein (peptidoglycan glycosyltransferase) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号145)。
>gi|296921112|emb|CBL55659.1| ATP−binding region, ATPase−like:Histidine kinase, Histidine kinase A−like precursor [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号146)
>gi|296922314|emb|CBL56886.1| Cobalt permease [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号147)。
>gi|296922614|emb|CBL57191.1| Hypothetical protein PFREUD_16800 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号148)。
>gi|296921959|emb|CBL56519.1| Secreted protease with a PDZ domain [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号149)。
>gi|296921835|emb|CBL56395.1| membrane protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号150)。
>gi|296921079|emb|CBL55620.1| secreted transglycosydase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号151)。
>gi|296922047|emb|CBL56611.1| Leucine−, isoleucine−, valine−, threonine−, and alanine−binding protein [Precursor] (LIVAT−BP) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号152)。
>gi|296922667|emb|CBL57244.1| Hypothetical protein PFREUD_17340 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号153)。
>gi|296922395|emb|CBL56967.1| Hypothetical protein PFREUD_14680 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号154)。
>gi|296921224|emb|CBL55774.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号155)。
>gi|296921129|emb|CBL55676.1| ABC transporter permease [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1] (配列番号156)。
>gi|296921974|emb|CBL56536.1| Exopolysaccharide biosynthesis protein precursor (related to N−acetylglucosamine−1−phosphodiester alpha−N−acetylglucosaminidase precursor) [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号157)。
>gi|296921168|emb|CBL55717.1| Hypothetical protein PFREUD_02020 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号158)。
>gi|296921340|emb|CBL55893.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号159)。
>gi|296923123|emb|CBL57710.1| Hypothetical membrane protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号160)。
>gi|296922282|emb|CBL56854.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号161)。
>gi|296921324|emb|CBL55877.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号162)。
>gi|296922572|emb|CBL57145.1| ABC transporter glycine betaine [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号163)。
>gi|296922949|emb|CBL57531.1| Hypothetical protein PFREUD_20380 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号164)。
>gi|296921638|emb|CBL56194.1| ABC transport system component [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号165)。
>gi|296922507|emb|CBL57080.1| Hypothetical protein PFREUD_15820 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号166)。
>gi|296921133|emb|CBL55680.1| Hypothetical protein PFREUD_01650 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号167)。
>gi|296921157|emb|CBL55704.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号168)。
>gi|296921592|emb|CBL56146.1| ABC transporter−associated permease [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号169)。
>gi|296923131|emb|CBL57718.1| Hypothetical protein PFREUD_22150 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号170)。
>gi|296921360|emb|CBL55913.1| Hypothetical outer membrane protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号171)。
>gi|296921416|emb|CBL55969.1| Hypothetical protein PFREUD_04350 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号172)。
>gi|296923120|emb|CBL57707.1| Hypothetical protein PFREUD_22040 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号173)。
>gi|296921006|emb|CBL55544.1| Hypothetical protein PFREUD_00440 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号174)。
>gi|296921415|emb|CBL55968.1| Carboxylic ester hydrolase [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号175)。
>gi|296922150|emb|CBL56718.1| ABC transporter substrate−binding protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号176)。
>gi|296921167|emb|CBL55716.1| Hypothetical secreted protein [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号177)。
>gi|296923127|emb|CBL57714.1| Hypothetical protein PFREUD_22110 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号178)。
>gi|296921375|emb|CBL55928.1| Hypothetical protein PFREUD_03950 [Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii CIRM−BIA1](配列番号179)。
プライマー1と2(以下の表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー3と4(表2)を用いてグルコアミラーゼを増幅した。グルコアミラーゼは全て、それらの増幅のために共通のリバースプライマー(プライマー4)を使用することを可能にするために、終止コドンの後に21ヌクレオチドを加えて合成した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号33によって表される通りである。
プライマー1と5(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー6と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号34によって表される通りである。
プライマー1と7(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー8と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号35によって表される通りである。
プライマー1と9(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー10と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号36によって表される通りである。
プライマー1と11(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー12と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号37によって表される通りである。
プライマー1と13(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー14と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号38によって表される通りである。
プライマー15と16(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー3と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。グルコアミラーゼは全て、それらの増幅のために共通のリバースプライマー(プライマー4)を使用することを可能にするために、終止コドンの後に21ヌクレオチドを加えて合成した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号39によって表される通りである。
プライマー15と17(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー6と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号40によって表される通りである。
プライマー15と18(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー8と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号41によって表される通りである。
プライマー15と19(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー10と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号42によって表される通りである。
プライマー15と20(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー12と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号43によって表される通りである。
プライマー15と21(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー14と4を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号44によって表される通りである。
プライマー22と23(表2)を用いてPFREUD_08450プロモーターの配列をP.freudenreichiiから増幅した。増幅されたオリゴ配列を、制限酵素によらないクローニング方法を用いて、PFREUD_04850シグナルペプチドとグルコアミラーゼの配列を既に含むpOWR3ベクター(実施例3.8のもの)にクローニングする。得られたベクターをDH5α細菌に挿入して増幅する。その後、メチル化されていないベクターを生産するために、dam/dcm−のE.coli株に移し、増やし、精製する。インサートのDNA配列は、配列番号45によって表される通りである。
プライマー24と25(表2)を用いてPFREUD_18250シグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。増幅されたオリゴ配列を、制限酵素によらないクローニング方法を用いて、PFREUD_04850プロモーターとグルコアミラーゼの配列を既に含むpOWR3ベクター(実施例3.8のもの)にクローニングする。得られたベクターをDH5α細菌に挿入して増幅する。その後、メチル化されていないベクターを生産するために、dam/dcm−のE.coli株に移し、増やし、精製する。インサートのDNA配列は、配列番号46によって表される通りである。
プライマー15と26(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー27と28を用いてキシラナーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号47によって表される通りである。
プライマー15と29(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー30と31を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号48によって表される通りである。
プライマー15と32(表2)を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をP.freudenreichiiから増幅した。プライマー33と34を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット(すなわち、インサート)のDNA配列は、配列番号49によって表される通りである。
実施例3(実施例3.1〜3.17)の様々な増幅されたヌクレオチド配列(発現カセット)を、制限酵素によらないクローニング方法(Peleg Y, Unger T. 「Application of the Restriction−Free(RF) cloning for multicomponents assembly」 Methods Mol Biol. 2014;1116:73−87)を用いてpOWR3ベクターにクローニングした。得られたベクターをDH5α細菌に挿入して増幅した後、メチル化されていないベクターを生産するために、dam/dcm−のE.coli株に移し、増やし、精製した。
実施例3.11において説明される発現カセット(配列番号43)を、上述のように、pOWR3ベクターにクローニングしてP.freudenreichiiに形質転換した。
逐次的な稼働様式で、有機廃棄物において乳酸を利用し多糖類を糖化するために、LA利用細菌を使用する。
有機廃棄物において乳酸の利用と多糖の糖化を同時に生じさせるために、LA利用細菌を使用する。
Claims (45)
- 1種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸(LA)利用細菌であって、前記1種以上の外因性の多糖分解酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む、LA利用細菌。
- 前記多糖分解酵素が、細菌の酵素である、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記細菌の多糖分解酵素が、好熱性細菌に由来する、請求項2に記載のLA利用細菌。
- 前記好熱性細菌が、クロストリジウム属の種(Clostridium sp.)、パエニバチルス属の種(Paenibacillus sp.)、サーモビフィダ・フスカ(Thermobifida fusca)、バチルス属の種(Bacillus sp.)、ゲオバチルス属の種(Geobacillus sp.)、クロモハロバクター属の種(Chromohalobacter sp.)およびロドサーマス・マリナス(Rhodothermus marinus)からなる群より選択される、請求項3に記載のLA利用細菌。
- 前記細菌の多糖分解酵素が、中温細菌に由来する、請求項2に記載のLA利用細菌。
- 前記中温細菌が、クレブシエラ属の種(Klebsiella sp.)、コーネラ属の種(Cohnella sp.)、ストレプトマイセス属の種(Streptomyces sp.)、アセチビブリオ・セルロリチカス(Acetivibrio cellulolyticus)、ルミノコッカス・アルブス(Ruminococcus albus)、バチルス属の種(Bacillus sp.)およびラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)からなる群より選択される、請求項5に記載のLA利用細菌。
- 前記多糖分解酵素が、真菌の酵素である、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記真菌の酵素が、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、ペニシリウム・フェルタナム(Penicillium fellutanum)およびサーモマイセス・ラヌギノス(Thermomyces lanuginosu)からなる群より選択される真菌に由来する、請求項7に記載のLA利用細菌。
- 前記多糖分解酵素が、前記LA利用細菌の増殖に適しているのと同じ温度とpHの範囲において好適な活性を有する、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記多糖分解酵素が、前記LA利用細菌の好適な増殖温度よりも高い温度において好適な活性を有する、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記多糖分解酵素が、前記LA利用細菌の好適な増殖pHよりも高い、または低い、pHにおいて好適な活性を有する、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記LA利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種(Propionibacterium species)、メガスフェラ属の種(Megasphaera species)、セレノモナス属の種(Selenomonas species)およびベイロネラ属の種(Veillonella species)からなる群より選択される、請求項1に記載のLA利用細菌。
- 前記LA利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種である、請求項12に記載のLA利用細菌。
- 前記プロピオニバクテリウム属の種が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)である、請求項13に記載のLA利用細菌。
- セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む複数の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸(LA)利用細菌の集団であって、前記集団は、LA利用細菌の亜集団を複数含み、各亜集団は、異なる多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されている、LA利用細菌の集団。
- 前記多糖分解酵素が、細菌の酵素である、請求項15に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記多糖分解酵素が、好熱性細菌に由来する、請求項16に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記好熱性細菌が、クロストリジウム属の種、パエニバチルス属の種、サーモビフィダ・フスカ、バチルス属の種、ゲオバチルス属の種、クロモハロバクター属の種およびロドサーマス・マリナスからなる群より選択される、請求項17に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記多糖分解酵素が、中温細菌に由来する、請求項16に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記中温細菌が、クレブシエラ属の種、コーネラ属の種、ストレプトマイセス属の種、アセチビブリオ・セルロリチカス、ルミノコッカス・アルブス、バチルス属の種およびラクトバチルス・ファーメンタムからなる群より選択される、請求項19に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記多糖分解酵素が、真菌の酵素である、請求項15に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記真菌の酵素が、トリコデルマ・リーゼイ、フミコーラ・インソレンス、フサリウム・オキシスポラム、アスペルギルス・オリゼ、ペニシリウム・フェルタナムおよびサーモマイセス・ラヌギノスからなる群より選択される真菌に由来する、請求項21に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記亜集団が、同じ細菌種の亜集団である、請求項15に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記亜集団が、異なる細菌種の亜集団である、請求項15に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記LA利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種から選択される、請求項15に記載のLA利用細菌の集団。
- 前記プロピオニバクテリウム属の種が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである、請求項25に記載のLA利用細菌の集団。
- 有機廃棄物を処理するための方法であって、
前記方法は、前記有機廃棄物を、請求項1に記載のLA利用細菌と、または請求項15に記載の乳酸利用細菌の集団と、前記LA利用細菌によって乳酸が消費される条件であって前記多糖分解酵素の発現および活性に適している条件の下で接触させることを含み、
前記処理は、前記有機廃棄物からD−乳酸、L−乳酸またはその両方を除去し、且つ前記廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させる、
方法。 - 前記廃棄物からの乳酸の除去が、可溶性の還元糖への多糖の分解と同時に行われる、請求項27に記載の方法。
- 前記廃棄物からの乳酸の除去が、可溶性の還元糖への多糖の分解の前に行われる、請求項27に記載の方法。
- 前記多糖分解酵素が、前記LA利用細菌の好適な増殖温度よりも高い温度において好適な活性を有し、
前記方法が、(i)前記LA利用細菌の増殖および前記多糖分解酵素の発現に適している第1の温度において前記有機廃棄物を、前記廃棄物からD−乳酸、L−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、前記LA利用細菌と接触させることと、(ii)前記多糖分解酵素の活性に適している第2の温度まで温度を上昇させることと、を含む、
請求項29に記載の方法。 - 前記多糖分解酵素が、前記LA利用細菌の好適な増殖pHよりも高い、または低い、pHにおいて好適な活性を有し、
前記方法が、(i)前記LA利用細菌の増殖および前記多糖分解酵素の発現に適している第1のpHにおいて前記有機廃棄物を、前記廃棄物からD−乳酸、L−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、前記LA利用細菌と接触させることと、(ii)前記多糖分解酵素の活性に適している第2のpHにpHを調整することと、を含む、
請求項29に記載の方法。 - 前記接触の前に前記有機廃棄物中のデンプン、セルロースおよびヘミセルロースのうちの少なくとも1つのパーセンテージを決定することと、前記有機廃棄物と接触させるLA利用細菌またはLA利用細菌の集団を、決定されたパーセンテージに応じて選択することと、をさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記決定が、可溶性の還元糖のパーセンテージを決定することをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 前記処理が、1つの容器内で実施される、請求項27に記載の方法。
- 有機廃棄物から個別の乳酸エナンチオマーを生産するための方法であって、
(i)前記有機廃棄物を、請求項1に記載のLA利用細菌と、または請求項15に記載のLA利用細菌の集団と、前記LA利用細菌による乳酸の消費ならびに前記多糖分解酵素の発現および活性に適した条件の下で接触させることによって前記有機廃棄物を処理して、前記廃棄物中に存在するD−乳酸、L−乳酸またはそれらの組み合わせを除去するとともに前記廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させることと、
(ii)前記LA利用細菌を不活性化することと、
(iii)D−乳酸およびL−乳酸のうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物を用いて、(i)で得られた可溶性の還元糖を発酵させて個別の乳酸エナンチオマーを得ることと、
(iv)発酵ブロスから前記個別の乳酸エナンチオマーを回収することと、
を含む、方法。 - 前記廃棄物中に存在するD−乳酸、L−乳酸またはそれらの組み合わせの除去が、前記廃棄物中の多糖の分解と同時に、または逐次に、行われる、請求項35に記載の方法。
- 有機廃棄物からポリ乳酸を生産するための方法であって、請求項35に記載の方法によって個別の乳酸エナンチオマーを生産することを含み、前記個別の乳酸エナンチオマーをポリ乳酸に重合することをさらに含む、方法。
- プロピオン酸菌による外因性の多糖分解酵素の発現および分泌のための発現ベクターであって、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、
少なくとも1つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド(SP)をコードする少なくとも1つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも1つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも1つの発現カセットと、
を含む発現ベクター。 - プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号84の核酸配列を含む、請求項38に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターの核酸配列が、配列番号27〜32およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項38に記載の発現ベクター。
- 前記SPのアミノ酸配列が、配列番号87〜179の配列からなる群より選択される、請求項38に記載の発現ベクター。
- 前記多糖分解酵素の配列が、配列番号14〜26およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項38に記載の発現ベクター。
- 前記発現カセットが、配列番号33〜49またはそれらのホモログのうちのいずれか1つによって表される核酸配列を含む、請求項38に記載の発現ベクター。
- 前記発現カセットが、配列番号33〜49のうちのいずれか1つによって表される核酸配列からなる、請求項38に記載の発現ベクター。
- 請求項38〜44のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む、プロピオニバクテリウム属の乳酸(LA)利用細菌。
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