CN112094832B - 一种突变的耐热耐碱造纸用木聚糖酶及其应用 - Google Patents

一种突变的耐热耐碱造纸用木聚糖酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种带CBM2木聚糖酶TfXyl10A的突变基因TfXyl10A_1，所述基因的突变位点为E51A，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述基因在制备木聚糖酶中的应用。实验证明，这种基因所编码的突变木聚糖酶活性可达到84.1U/μmol，比野生型酶提高了100％；且与野生型一样，最适温度为80℃，最适pH为9；该突变木聚糖酶具备结合在结晶纤维素表面快速清除纤维素表面带侧链木聚糖残留的作用，且具备耐高温、耐碱的特性，能够被广泛应用在纸浆漂白、寡糖生产以及木质纤维素预处理等众多领域。

Description

一种突变的耐热耐碱造纸用木聚糖酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种突变的木聚糖酶及其应用。
背景技术
植物生物质的生物降解对于环境和工业生产是非常重要的。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素等组分组成，纤维素表面通常被半纤维素和木质素覆盖，它们共同组成植物生物质的抗降解屏障。木聚糖是主要的半纤维素组分，含量仅次于纤维素，其主链由木糖分子经β-1,4-糖苷键连接组成，此外还包含阿拉伯糖、阿魏酸、糖醛酸、乙酰基团等组成的侧链。在造纸工业中，带侧链的木聚糖残基通常覆盖在纤维素表面，影响纸张的色度。而这些残留的去除通常由化学漂白剂，例如含氯的化学试剂，进行去除，这容易造成环境污染以及具有致癌致畸毒性。由生物酶驱动的生物漂白技术在替代化学漂白剂方面表现出明显优势。其中木聚糖酶在去除纤维素表面附着的木聚糖方面具有明显优势，其主要以内切方式切断木聚糖主链。在纸浆漂白工业应用中有广泛前景。
木聚糖酶在进化过程中出现了明显的基因扩增现象，表明其特异性和功能的差异。Cazy数据库中木聚糖酶广泛分布在GH5,7,8,10,11,26,30,43,51和98等多个家族，其中主要以GH10和GH11家族为主。GH11家族木聚糖酶拥有β-jelly roll结构，酶分子量较小，底物特异性高，对木聚糖主链降解效率高，已经广泛应用于食品、饲料等行业。GH10家族木聚糖酶是Tim桶结构，底物特异性较弱，但是对底物侧链的容纳能力较强，可以降解带侧链的木聚糖残留，在造纸业尤其是纸浆漂白过程中优势显著。
纸浆漂白等工业过程一般是在碱性和高温条件下进行，所以寻找能够满足工业应用的耐碱耐热木聚糖酶成为了研究热点之一。褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)是玉米秸秆堆肥中的优势功能细菌，是一株嗜热放线菌。其分泌的酶大多能忍受55℃以上的高温，并且具有良好的木聚糖降解活性。该菌在纤维素诱导条件下主要分泌一个带CBM2的GH10木聚糖酶TfXyl10A，该酶的最适反应温度为80℃，最适pH值为9，具有耐热耐碱的特性，说明它们在工业应用中具有广泛的应用价值。且CBM2可以快速结合纤维素表面，GH10可以清除带侧链的木聚糖残留，其在工业应用中具有清除纤维素表面带侧链木聚糖残留的功能，在纸浆漂白工业应用中具有明显优势。同时，纸浆漂白过程中木聚糖降解产生的木寡糖可以用来制备高值功能糖。
综上所述，TfXyl10A是一种理想的工业用酶，尤其是应用在纸浆漂白过程中优势明显。但是，在TfXyl10A的实际应用中，仍存在着需要解决的问题；缩短工艺流程，提高生产效益亟待具有更高活性木聚糖酶的出现。酶的基因工程改造是提高酶活性的一个重要手段，然而，目前还未见关于TfXyl10A增强酶活性及其相关突变基因的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐碱耐热的突变的木聚糖酶及其应用。
一方面，本发明提供了一种耐碱耐热的突变的木聚糖酶TfXyl10A-E51A，所述突变的木聚糖酶TfXyl10A-E51A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
另一方面，本发明还提供了所述突变的木聚糖酶TfXyl10A-E51A的编码基因；优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明还提供了包含所述突变的木聚糖酶的编码基因的重组载体；优选的，所述重组载体为重组表达载体；优选为blunt系列的载体，例如，pEASY blunt-e1，pEASY blunt-e2。
另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21。
另一方面，本发明还提供了所述突变的木聚糖酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在降解含有木聚糖的材料中的应用。应当理解，含有木聚糖的材料包括天然含有木聚糖的材料，或者经加工的含有木聚糖的材料。
另一方面，本发明还提供了所述突变的木聚糖酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在制备木聚糖寡糖中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种降解含有木聚糖或者含有木聚糖寡糖的材料的方法，所述方法包括利用所述突变的木聚糖酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株对含有木聚糖材料进行处理的步骤。应当理解，含有木聚糖的材料包括天然含有木聚糖的材料，或者经加工的含有木聚糖的材料。
进一步的，所述处理的温度为30℃-90℃，优选，50℃-85℃，更优选，80℃；所述处理的pH为3-11，优选，5-10，更优选，9。
另一方面，本发明还提供了所述突变的木聚糖酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在造纸中的用途，优选，在纸浆漂白中的用途。
本发明具有的有益效果是：
本发明中突变基因TfXyl10A_1所编码的突变木聚糖酶TfXyl10A-E51A具有高酶活性，在80℃下酶活为84.1U/μmol，比野生型酶TfXyl10A提高了100％；与野生型一样，能够耐受80℃高温，并在pH5-10的缓冲体系中稳定。本发明突变的木聚糖酶在实际工业生产过程中，在工农业生产中具有更大的应用空间。由于其在高温条件下具有较高的水解活力和良好的热稳定性，因而有助于提升生化反应速率、减少微生物污染，从而降低成本提高效益。在作为医药、食品、生物技术、造纸等工业用酶时，能在更广泛的环境中保持较高活性，具体应用包括但不仅限于：
在造纸过程中，尤其是纸浆漂白过程中，此突变木聚糖酶可以作为化学漂白剂的替代品，降解纸浆表面附着的木聚糖，提高纸浆的白度，减少卡伯值，减少化学漂白剂的使用。在食品工业中，该突变木聚糖酶可以用于木寡糖的生产，可以作为益生元，增强免疫力。在饲料工业中，该突变木聚糖酶可以对饲料进行初步降解，增加适口性。
附图说明
图1为本发明的TfXyl10A-E51A蛋白表达的SDS-PAGE结果图，其中泳道M为Unstained Protein Marker(Thermo Scientific,MA,USA)，泳道1和2均为突变木聚糖酶TfXyl10A-E51A。
图2为本发明TfXyl10A-E51A与TfXyl10A在最适条件下的相对酶活性图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、木聚糖酶TfXyl10A的突变以及重组载体的构建
(1)从NCBI数据库中获取木聚糖酶TfXyl10A基因，将TfXyl10A基因和质粒blunt-e1(pEASY blunt-e1)连接，获得blunt-e1-TfXyl10A质粒，所述blunt-e1-TfXyl10A质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。以上述重组质粒为模板，设计突变引物，进行定点突变，引物序列如下：
E51A-sense：AGATGAAGTGGGCGTCGCTGGAG；
E51A-antisense：CCAGCGACGCCCACTTCATCTCG；
PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0002666786790000041
Figure BDA0002666786790000051
反应程序如下：
预热，94℃，5min；变性，94℃，30s；退火，55-65℃，30s；30cycles；延伸，72℃，2min；再延伸，72℃，10min；4℃，forever。
(2)取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，留下条带清晰的反应产物。用DpnI限制酶对产物中野生型的质粒进行消化，确保之后步骤中的转化子均为突变型。消化体系如下表，将体系充分混合，于37℃水浴反应15min；
Figure BDA0002666786790000052
(3)将消化后的PCR产物进行纯化，实验步骤参照北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司GV-High–Efficiency DNA Fragments Purification Kit；
(4)突变质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：
将10μL已纯化的上述突变质粒加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min；42℃热击90s；冰浴2min，加1mL液体LB，37℃摇床中培养1-1.5h；8000rpm离心2min，弃上清(留少许底部液体)。将剩余溶液涂布到含100μg/mL氨苄霉素的LB平板上，37℃过夜倒置培养；次日挑取单克隆，接种在5mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；
(5)提取质粒，实验步骤参照北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司GV-PlasmidDNA Mini Extraction Kit；
(6)取3μL质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，留下条带清晰的质粒；
(7)取10μL质粒溶液于灭菌EP管中进行测序。比对测序结果和原始序列，确认定点突变是否成功。测序正确的质粒即为含有木聚糖酶TfXyl10A的突变基因TfXyl10A_1的重组载体blunt-e1-TfXyl10A-E51A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2、构建含有上述突变基因TfXyl10A_1的重组工程菌
本实施例中构建含有上述突变基因TfXyl10A_1的重组工程菌，具体步骤如下：将2μL测序正确的上述突变质粒blunt-e1-TfXyl10A-E51A加入50μL大肠杆菌BL-21感受态细胞，冰浴30min；42℃热击90s；冰浴2min，加入1mL液体LB，37℃摇床中培养1-1.5h；8000rpm离心2min，弃上清(留少许底部液体)。将剩余溶液涂布到含100μg/mL氨苄霉素的LB平板，涂布均匀至干燥，37℃过夜倒置培养；次日挑取单克隆，接种在5mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中，37℃200rpm过夜培养，即得到含有突变基因TfXyl10A_1的重组工程菌。
实施例3：突变基因TfXyl10A_1的重组表达
发酵表达并纯化上述突变基因TfXyl10A_1所编码的突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A，具体步骤如下：
(1)重组蛋白的异源表达：
取实施例2得到的含有上述突变基因TfXyl10A_1的重组工程菌，于5mL LB培养基中(含100μg/mL氨苄霉素)37℃200rpm过夜培养；
将培养过夜的菌液转接到装有300mL LB培养基的1L三角瓶中(含100μg/mL氨苄霉素)，37℃下培养约3h，至OD600＝0.6-0.8；加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃诱导培养20h；8000rpm，4℃离心10min，得到菌体沉淀；
用pH 8.0的NaH2PO4-NaCl缓冲液重悬菌体，将菌液置于100mL离心管中；将离心管置于冰上，超声破碎细胞，时间设置为9s ON，10s OFF，共90次；11000rpm，4℃离心30min；用0.22μm的滤头过滤上清液，把柱子的填料与滤液结合，准备进行亲和纯化。
(2)重组蛋白的纯化：
使用GE Healthcare公司Ni Sepharose 6Fast Flow亲和柱对含有6×His tag的目的蛋白进行亲和纯化。将上一步获得的粗酶液与填料混合，于4℃转动结合2h，使填料上的镍与蛋白上的His标签充分结合；
用pH 8.0的NaH2PO4-NaCl缓冲液配制浓度为1M的咪唑母液，然后分别稀释到5mM，20mM，60mM，100mM，250mM，用以上浓度的咪唑洗脱蛋白，分别收集至10mL EP管中；
蛋白洗脱后镍柱再生，镍柱再生时按照如下顺序加入对应溶液：50mM EDTA→蒸馏水→1M NaCl→蒸馏水→0.1M硫酸镍→蒸馏水→70％乙醇→20％乙醇保存备用；
将收集的酶液进行SDS-PAGE：将样品与SDS buffer按4:1混匀(样品取16μL，buffer取4μL)，Marker取10μL，105℃处理10min；点样时样品点12μL，Marker点5μL。用80V电压进行电泳，待蛋白样品呈一条直线时把电压调成180V。电泳结束后考马斯亮蓝R-250染液染色30min，脱色液脱色约2h，用扫描仪扫胶观察；
找出目的蛋白条带较纯的几管，加pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，4900rpm于4℃超滤，至滤出的缓冲液pH为6.0；
用无菌的0.22μm滤头将超滤后的酶液过滤到灭菌的10mL离心管中，4℃保存。如要长期保存，需置于-80℃。
(3)重组蛋白的含量测定：
将目的蛋白稀释到合适的浓度(测定时不超过标准曲线的量程)；对照组加入0.1mL pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，实验组加入0.1mL稀释后的目的蛋白溶液。每管再分别加入1mL考马斯亮蓝染色液，摇匀。静置10min后测定OD595；每组三个平行，测定三次，共九组重复；根据标准曲线算出蛋白量和蛋白浓度。
如图1所示，SDS-PAGE电泳显示，突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A的条带为53kDa左右的标准蛋白，与预期大小相似。此结果显示，本发明成功获得了目标蛋白TfXyl10A_E51A。
TfXyl10A_E51A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因序列如SEQ IDNo.1所示。
按照上述方法同样制备含有野生型基因TfXyl10A的重组载体blunt-e1-TfXyl10A，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，并进行蛋白的表达和纯化。
实施例4：突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A与野生型酶TfXyl10A的酶学性质比较
突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A和野生型酶TfXyl10A在最适条件下的酶活性：
将突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A和野生型酶TfXyl10A稀释到0.1μmol/mL；在对照组管中加入10μL pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，实验组管中加入10μL稀释过的酶液，每管再分别加入90μL浓度为1％(w/v)的玉米芯木聚糖(其溶于pH 6.0的50mM Na2HPO4-柠檬酸缓冲液)，80℃反应10min；
每管各加入80μL DNS，沸水浴10min；迅速冷却，摇匀，离心，取上清，测定OD550；每种酶做三次重复实验；根据标准曲线算出还原糖量，再根据公式算出比酶活；比较两种蛋白的酶活性。
突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A与野生型木聚糖酶TfXyl10A在最适条件下的酶活性如图2所示。突变木聚糖酶TfXyl10A_E51A的酶活性是野生型木聚糖酶TfXyl10A的2倍，这证明突变木聚糖酶对于木聚糖聚糖具有较强的酶活性，具有潜在的应用价值。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种突变的耐热耐碱造纸用木聚糖酶及其应用
<130> 111
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> Thermobifida fusca
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gccatcaccc acgaaaacga gatgaagtgg gcgtcgctgg agccgcagcg gggccagtac 180
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cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc 6420
agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc 6480
ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg 6540
caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc 6600
acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc 6660
cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac 6720
gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc 6780
agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata 6840
ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc 6900
cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc 6960
gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt 7020
tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat g 7051

Claims (19)

1.一种耐碱耐热的突变的木聚糖酶TfXyl10A-E51A，所述突变的木聚糖酶TfXyl10A-E51A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述突变的木聚糖酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID No.1所示。
4.包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体选自pEASY blunt-e1，pEASY blunt-e2。
7.包含权利要求4-6任一所述重组载体的重组菌株。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌BL21。
10.权利要求1所述的突变的木聚糖酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株在降解含有木聚糖的材料中的应用。
11.权利要求1所述的突变的木聚糖酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株在造纸中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用为在纸浆漂白中的应用。
13.权利要求1所述的突变的木聚糖酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株在制备木聚糖寡糖中的应用。
14.一种降解含有木聚糖的材料的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的突变的木聚糖酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株对含有木聚糖的材料进行处理的步骤；
所述权利要求1所述的突变的木聚糖酶、权利要求2-3任一所述的基因、权利要求4-6任一所述的重组载体或权利要求7-9任一所述的重组菌株用于降解所述含有木聚糖的材料中的木聚糖。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为30℃-90℃。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为50℃-85℃。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为80℃。
18.根据权利要求14-17任一所述的方法，其特征在于，所述处理的pH为3-11。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述处理的pH为5-10。
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