CN102839133A - 一种长链二元酸生产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长链二元酸生产菌株——热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145，其保藏号为CCTCC M 2011192。本发明还公开了所述菌株的应用以及一种利用所述菌株生产二元酸的方法。本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，对于不同碳链长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物都具有很高的转化性能，而且杂酸含量低，适用性非常广泛，从而可以大大简化发酵过程控制，易于提取纯化，具有非常好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，是关于一种长链二元酸生产菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145及其用于发酵生产长链二元酸的应用。
背景技术
长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂、医药和农药等的重要原料。特别是十二碳二元酸(DC12)和十四碳二元酸(DC14)，它们分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。十二碳以上的长链二元酸，自然界中不存在，目前化工上也没有经济可行的合成方法，因此，利用微生物的特异性转化能力，在常温常压下转化正烷烃或脂肪酸生成相应的长链二元酸，是目前业内研究的重点。
目前，用于转化正烷烃或脂肪酸生成相应长链二元酸的微生物主要是热带假丝酵母(Candida tropicalis)，虽然转化生产二元酸的能力各有千秋，但没有关于一株菌种对不同碳链都具有较强转化能力的报道，例如：
申请号为97103876.7的中国发明专利申请，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于同步发酵正十三烷生产相应的十一烷1，11-二羧酸；
申请号为02100215.0的中国发明专利申请中，公开的热带假丝酵母(Candidatropicalis)可用于同步发酵正十四烷生产十二烷1，12-二羧酸；
申请号为02145431.0的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于生产α、ω-正长链十四碳二元酸；
申请号03105127.8的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于同步发酵正十四烷生产十四碳二元酸；
申请号200610127968.6的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于生产十二碳二元酸；
申请号89102548.0的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于发酵正烷烃生产十七碳二羧酸；
申请号94100594.1的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于发酵正烷烃生产十五碳二羧酸；
申请号95117436.3的中国发明专利申请中，公开了一种热带假丝酵母(Candidatropicalis)，可用于同步发酵生产十二碳二羧酸。
发明内容
本申请的发明人通过以现有长链二元酸生产菌株NP-6-5为出发菌株，通过常规诱变方法进行诱变育种后，筛选得到了一株新的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145，其能够将不同长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物高效转化为相应的二元酸。
因此，本发明的一个方面，提供了一种长链二元酸生产菌株——热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其对于不同碳链长度的二元酸具有广泛的适用性。
本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为CCTCC M2011192。
与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其pox4基因的325位、901位和1886位碱基为A，其fao基因的539位碱基为G，其CYP52A18基因在170位和813位的碱基分别为的T和C。
根据本发明，所述pox4基因的序列如SEQ ID NO：2所示，所述fao基因的序列如SEQ ID NO：4所示，所述CYP52A18基因的序列如SEQ ID NO：6所示。
根据本发明，所述长链二元酸包括C9～18的长链二元酸。
本发明的另一个方面，提供了所述菌株CAT N145用于转化正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生产相应的二元酸的应用。
本发明的第三个方面，提供了一种长链二元酸的生产方法。
根据本发明，所述长链二元酸的生产方法是通过发酵菌株CAT N145转化C9～18正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生成相应的长链二元酸。
根据本发明的优选实施例，所述菌株CAT N145的发酵培养基如下：
玉米浆1～5g/L，酵母膏1～5g/L，KH2PO4 4～12g/L，NaCl 0～3g/L，KNO3 4～12g/L，蔗糖10～40g/L，尿素0.5～3g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物400～300mL/L，pH至7.5～7.6。
优选的，其发酵过程描述如下：取甘油管种子接入种子培养基，在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，当种子液的OD620达到0.8以上(水稀释30倍)时，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，发酵周期90～120hours。
本发明中，培养基中加入的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物的碳链长度需要与所需生产的二元酸的碳链长度相对应。
本发明的第四个方面，提供了一种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的pox4基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第五个方面，提供了一种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的fao基因，其序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的第六个方面，提供了一种来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CATN145的CYP52A18基因，其序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明的长链二元酸生产菌株——热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，对于不同碳链长度的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物都具有很高的转化性能，适用性非常广泛，具有非常好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明的菌株CAT N145的pox4基因与热带假丝酵母ATCC 20336的pox4基因的序列比对示意图，其中POX4为ATCC 20336的pox4基因，POX4-1为本发明的菌株CAT N145的pox4基因。
图2为本发明的菌株CAT N145的fao基因与热带假丝酵母ATCC 20336的fao基因的序列比对示意图，其中，fao1为ATCC 20336的fao1基因，fao为本发明的菌株CATN145的fao1基因。
图3为本发明的菌株CAT N145的CYP52A18基因与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因的序列比对示意图，其中，CYP52A18为ATCC 20336的CYP52A18基因，CYP18为本发明的菌株CATN145的CYP52A18基因。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145已于2011年6月9日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2011192。
以下实施例中所使用的培养基如下：
1、活化培养基/甘油罐培养基：YPD培养基
配方(w/v)：
葡萄糖2.0％，酵母膏1.0％，蛋白胨2.0％，琼脂2.0％，加自来水至所需体积，
pH 7.0～7.2。
2、种子培养基：
配方(w/w)：
蔗糖10～20g/L，玉米浆2～4g/L，酵母膏3～8g/L，KH2PO4 4～12g/L，尿素0.5～4g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物0～30mL/L(做不同链长的二元酸，用不同链长的烷烃或脂肪酸)。
培养基在121℃灭菌20分钟。
30mL种子培养基接种到500mL摇瓶，在28～31℃培养。摇床转速200～250rpm培养时间36～48hours。当种子液的OD620在0.8以上(水稀释30倍)，将3.5ml种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。
3、发酵培养基：
配方(w/w)：
玉米浆1～5g/L，酵母膏1～5g/L，KH2PO4 4～12g/L，NaCl 0～3g/L，KNO3 4～12g/L，蔗糖10～40g/L，尿素0.5～3g/L(115℃，20min单独灭菌)，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物(做不同链长的二元酸，用不同链长的烷烃或脂肪酸)400～300mL/L，用1N NaOH溶液调节pH至7.5～7.6。
以下实施例中所使用的二元酸测定方法：
1、二元酸样品的制备：发酵终了，在500mL三角瓶中，用6mol/LHCl调pH值至3.0，每瓶加入120mL乙醚，摇动100次，放置30min以上，静置分层，取出40mL乙醚提取液，加到100mL烧杯中，除去乙醚，得到白色固体，然后进行二元酸的测定。
2、二元酸产量的测定：将提取得到的二元酸用中性热乙醇(95％)溶解，加入一滴酚酞，用标准NaOH溶液滴定，记录消耗的NaOH体积，计算DC12产量。
实施例1
本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，经传代实验验证，经多次传代后菌落形态及生产长链二元酸的能力均未出现明显变化。可见本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145的传代稳定性良好。
实施例2
利用TaKaRa公司的Yeast DNAiso Kit试剂盒提取菌株的基因组DNA，以基因组为模板进行PCR扩增，PCR所用的酶为Biomad公司的Pfu酶，PCR体系及条件按照说明书进行操作。
PCR扩增pox4、fao和cyp52a18基因，所用引物如下表所示。
pox4s AACGACATAATGACNTTNAC
pox4a TTATTTGGACAAAATAGCAG
faos AAAGGCDTATGAAWCCCAGG
faoa CATTCAAACAATCTACCATC
a18s GyGCTGCTCCwrTCACAAAC
a18a CTArTCrAwCTTGACAATAG
PCR完成后加入2μL的dNTP和0.5μL的rTaq酶，72℃反应30min。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒将PCR产物进行回收。将回收的产物与pMD18-T载体进行连接，连接操作按照产品说明书进行。连接产物转化大肠杆菌TOP10或DH5α，挑取阳性克隆子送Invitrogen公司测序。
将测序结果与GeneBank公布的ATCC 20336的相应基因：POX4(Genebank号为M12160)，FAO1(Genebank号为AY538780)，CYP52A18(Genebank号为AY230505)进行比对，以下位置均按照ATCC 20336相应基因的atg开始计算，结果显示，CAT N145pox4基因在图1所示的325位、901位和1886位的G突变为A，相对应的氨基酸由301位的缬氨酸和629位的精氨酸分别突变为异亮氨酸和赖氨酸；fao基因在图2所示的539位的A突变为G，相对应的氨基酸由180位的谷氨酸突变为甘氨酸；cyp18基因在图3所示的170位的C变为T，813位的G变为C，相对应的氨基酸由57位的丙氨酸和271位的谷氨酰胺分别突变为缬氨酸和组氨酸。可见本发明的热带假丝酵母(Candidatropicalis)CAT N145的二元酸相关基因在序列上与现有报道的相应基因存在差异，此外从发酵性能表现来看，本菌株也与现有报道的菌株具有明显的不同，本发明的菌株CAT N145是新的菌株。
实施例3
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)，其中，正烷烃为C12。500mL摇瓶装入30mL种子培养基，在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，培养时间36～48hours。当种子液的OD620达到0.8以上(水稀释30倍)时，将3.5ml种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。
发酵培养基中所加的正烷烃为C12，培养基在121℃灭菌20分钟，500ml装15mL培养基。在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，发酵周期90～120hours。
发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为151.2g/L。
实施例4
按实施例3的方法，将C12替换为C13，其余相同。
结果显示，测定发酵液中的二元酸DC13的含量为124.4g/L。
实施例5
按实施例3的方法，将C12替换为C14，其余相同。
结果显示，测定发酵液中的二元酸DC14的含量为166.9g/L。
实施例6
按实施例3的方法，将C12替换为C16，其余相同。
结果显示，测定发酵液中的二元酸DC16的含量为109.7g/L。
实施例7
按实施例3的方法，将C12替换为十四碳脂肪酸甲酯，其余相同。
结果显示，测定发酵液中的二元酸DC14的含量为133.9g/L。
Claims (24)
1.一种长链二元酸生产菌株CAT N145，其特征在于，所述菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，其保藏号为CCTCC M 2011192。
2.根据权利要求1所述的菌株CAT N145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的pox4基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的pox4基因在325位、901位和1886位碱基为A。
3.根据权利要求2所述的菌株CAT N145，其特征在于，所述pox4基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的菌株CAT N145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的fao1基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的fao基因在539位碱基为G。
5.根据权利要求4所述的菌株CAT N145，其特征在于，所述fao基因的序列如SEQID NO：4所示。
6.根据权利要求1所述的菌株CAT N145，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的CYP52A18基因在170位的碱基为T，813位的碱基为C。
7.根据权利要求6所述的菌株CAT N145，其特征在于，所述CYP52A18基因的序列如SEQ ID NO：6所示。
8.根据权利要求1所述的菌株CAT N145，其特征在于，所述长链二元酸包括9～18碳二元酸。
9.权利要求1～8中任一项所述的菌株CAT N145用于生产长链二元酸的应用，其特征在于，用于发酵转化的原料为正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物，生产相应的长链二元酸。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述长链二元酸包括9～18碳二元酸。
11.一种长链二元酸的生产方法，其特征在于，通过发酵热带假丝酵母(Candidatropicalis)CAT N145转化正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物生成相应的长链二元酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述长链二元酸包括9～18碳二元酸。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述菌株CAT N145的发酵培养基如下：
玉米浆1～5g/L，酵母膏1～5g/L，KH2PO4 4～12g/L，NaCl 0～3g/L，KNO3 4～12g/L，蔗糖10～40g/L，尿素0.5～3g/L，正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物400～300mL/L，pH 7.5～7.6。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其发酵过程描述如下：取甘油管种子接入种子培养基，在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，当种子液的OD620达到0.8以上(水稀释30倍)时，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在28～31℃培养，摇床转速200～250rpm，发酵周期90～120hours。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，培养基中加入的正烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物与所需生产的二元酸的碳链长度相对应。
16.一种pox4基因，其特征在于，其与热带假丝酵母ATCC 20336的pox4基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的pox4基因在325位、901位和1886位碱基为A。
17.根据权利要求16所述的基因，其特征在于，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为CCTCC M 2011192。
18.根据权利要求17所述的pox4基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
19.一种fao基因，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC 20336的fao1基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的fao基因在539位碱基为G。
20.根据权利要求19所述的pox4基因，其特征在于，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为CCTCC M 2011192。
21.根据权利要求20所述的pox4基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
22.一种CYP52A18基因，其特征在于，与热带假丝酵母ATCC 20336的CYP52A18基因相比，以其ATG起始密码子开始计算，本菌株的CYP18基因在170位的碱基为T，813位的碱基为C。
23.根据权利要求22所述的基因，其特征在于，所述基因来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145，其保藏号为CCTCC M 2011192。
24.根据权利要求23所述的CYP52A18基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQID NO：6所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Strain producing long chain dibasic acid, and application thereof Effective date of registration: 20140624 Granted publication date: 20140219 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Jining hi tech Industrial Development Zone sub branch Pledgor: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd.|SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.|SHANDONG CATHAY BIOTECHNOLOGICAL MATERIAL Co.,Ltd. Registration number: 2014990000503 |
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| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 201204 Building 5, Cai Lun Road, Zhangjiang hi tech park, Pudong New Area, Shanghai, China, 1690 Co-patentee after: SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee after: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Co-patentee after: Shandong source biological Greenway Technology Materials Co. Address before: 201204 Building 5, Cai Lun Road, Zhangjiang hi tech park, Pudong New Area, Shanghai, China, 1690 Co-patentee before: SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Co-patentee before: SHANDONG CATHAY BIOTECHNOLOGICAL MATERIAL Co.,Ltd. |
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Date of cancellation: 20180802 Granted publication date: 20140219 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Jining hi tech Industrial Development Zone sub branch Pledgor: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd.|SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.|Shandong source biological Greenway Technology Materials Co. Registration number: 2014990000503 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PM01 | Change of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PM01 | Change of the registration of the contract for pledge of patent right |
Change date: 20180801 Registration number: 2014990000503 Pledgor after: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Pledgor after: SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Pledgor after: Shandong source biological Greenway Technology Materials Co. Pledgor before: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Pledgor before: SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Pledgor before: SHANDONG CATHAY BIOTECHNOLOGICAL MATERIAL Co.,Ltd. |
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Effective date of registration: 20180831 Address after: 201203 Shanghai Pudong New Area Zhangjiang hi tech park, Cai Lun Road, No. 5, 5 building, 4 floor. Patentee after: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Address before: 201204 Building 5, Cai Lun Road, Zhangjiang hi tech park, Pudong New Area, Shanghai, China, 1690 Co-patentee before: SHANGHAI CATHAY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Co-patentee before: Shandong source biological Greenway Technology Materials Co. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Strain producing long chain dibasic acid, and application thereof Effective date of registration: 20181211 Granted publication date: 20140219 Pledgee: Bank of China Limited Jinxiang Branch Pledgor: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Registration number: 2018310000078 |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 201203 floor 4, building 5, No. 1690, Cailun Road, Shanghai free trade Experimental Zone, Pudong New Area, Shanghai Patentee after: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Address before: 201203 Shanghai Zhangjiang High Tech Park of Pudong New Area Cailun Road No. 1690 Building 5 Floor 4 Patentee before: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230621 Granted publication date: 20140219 Pledgee: Bank of China Limited Jinxiang Branch Pledgor: CATHAY R&D CENTER Co.,Ltd. Registration number: 2018310000078 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |