CN107488670A

CN107488670A - 一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用

Info

Publication number: CN107488670A
Application number: CN201710700549.5A
Authority: CN
Inventors: 汪俊卿; 王瑞明; 修翔; 苏静; 杨晓慧; 彭健; 薛乐
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: CN107488670B

Abstract

一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用。所述热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因ctlpA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述长链脂肪酸转运蛋白CtLpA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现热带假丝酵母中的长链二元酸转运蛋白基因ctlpA为长链二元酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链二元酸由胞内到胞外的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

Description

一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

长链二元酸一般是指碳链中含有12个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。是一类重要原料，具有较高的工业应用价值，可用于合成特种尼龙、高级麝香、粘合剂、热熔胶、医药、农药等重要的化工中间体。长链二元酸不能从自然界直接获取，目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、不够环保，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法反应专一、反应条件温和等优势势必成为绿色化合成长链二元酸中一个重要的研究开发领域。微生物发酵法所用的原料是正构烷烃，利用热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。

目前微生物发酵法生产长链二元酸的技术特别是微生物育种方面日趋成熟，如中国专利文献CN105400796A(申请号201511003830)则公开了一种热带假丝酵母定位于过氧化物酶体膜上的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，并通过基因工程阻断该基因的合成实现长链二元酸产量的提升。中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN102839133A(申请号CN201110168672X)则菌种诱变育种筛选到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突变株，突变株对不同碳链长度的烷烃、脂肪酸等物质具有很高的转化性能。

然而，对于开发具更高长链二元酸生产能力的菌株及生产方法，仍然是目前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用。

本发明技术方案如下：

一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因ctlpA，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因ctlpA来源于热带假丝酵母，定位于热带假丝酵母细胞膜上，其表达可以促进长链脂肪酸衍生物长链二元酸由胞内到胞外的跨膜转运。

一种长链二元酸转运蛋白CtLpA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的长链二元酸转运的基因ctlpA。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或表达上述长链二元酸转运的基因ctlpA。

上述调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因ctlpA在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

构建长链二元酸转运的基因ctlpA的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链二元酸转运的基因ctlpA的过量表达。

通过构建长链二元酸转运的基因ctlpA的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链二元酸转运的基因ctlpA的过量表达，从而可以提高热带假丝酵母胞内长链二元酸向胞外转运速率，增加产物长链二元酸转出并减少内耗，进而提高热带假丝酵母长链二元酸的产率及产量。

有益效果

本发明首次发现热带假丝酵母中的长链二元酸转运蛋白基因ctlpA为长链二元酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链二元酸由胞内到胞外的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

附图说明

图1、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母突变菌生长曲线；

图2、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母突变菌长链二元酸发酵结果柱状图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

质粒pPIC9K购自宝生物有限公司；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；

实施例1热带假丝酵母ctlpA基因功能的验证

1、热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂ctlpA1，长度581bp，所述的PCR引物序列如下：

CtlpA F₁:GGAATTCCTATTATCATCCTTGGGGTT；

CtlpA R₁:ATAATAGGATTTAGCGGAGGCATGATACCTGCT；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CtlpA F₁ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CtlpA R₁ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，进行PCR扩增，得到Kan片段，长度1523bp，所述的PCR引物序列如下：

Kan F₂:TCTTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCA；

Kan R₂:ATTGTGTGAATTCAGTGAGTCAGTCATCAGG；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Kan-F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Kan-R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)将步骤(1)制得的ctlpA1片段与步骤(2)制得的kan片段进行重叠PCR，制得ctlpA1-kan片段，长度2104bp；所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

ctlpA1片段4μl；kan片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物CtlpA F₁2μl；下游引物Kan R₂ 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

2、制备热带假丝酵母感受态

(i)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)接种到含50ml菌体增殖培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm/min，摇床过夜培养；

所述菌体增殖培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g，pH自然；

(ii)将过夜培养的菌液涂布至固体YPD培养基，30℃培养1～2d，得到热带假丝酵母(Candida tropicalis)单菌落；用接种环挑取单菌落到50ml菌体增殖培养基中，30℃、200rpm/min培养12h，转接，培养10h；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g、琼脂2g，pH自然；

(iii)取1.5ml菌液到Ep管中，3000rpm/min，离心1min，收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞；

(iv)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml预冷的无菌水悬浮细胞；

(v)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml 1mol/L预冷的山梨醇悬浮细胞；

(vi)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用80μL预冷的山梨醇悬浮细胞，即制成热带假丝酵母电转化感受态；将制备好的感受态细胞置于-80℃保存备用。

3、将ctlpA1-kan片段转化热带假丝酵母细胞

(i)将制得的ctlpA1-kan片段用限制性内切酶EcoR I酶切，酶切体系如下，总体系40μL：

(ii)浓缩纯化酶切产物

(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，离心5min得沉淀；

(3)300μL体积百分比为70％的乙醇重悬沉淀；

(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重悬DNA，并置于-20℃保存。

(iii)电转化

利用核酸超微量分光光度计(BioFuture MD2000)测定ctlpA1-kan片段浓度，达到浓度500μg/ml后进行电转化，电转化条件为1500V、5ms，然后在含1mol/L山梨醇的复苏液中培养，得到的细胞复苏后取100μL涂布在含1mg/mLG418(遗传霉素)的YPD固体培养基上，在30℃培养3天，筛选具有G418抗性的转化子；

所述复苏液为1mol/L的山梨醇；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g、琼脂2g，pH自然。

4、阳性重组菌的培养及鉴定

将上述筛选获得的转化子接种到含G418抗性的YPD液体培养基中培养过夜，吸取1mL菌液，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，CtlpA F₁和Kan R₂为引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳证明外源片段ctlpA1-kan转化到基因组上。

所述YPD液体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g，pH自然。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证敲除ctlpA基因对细胞吸收油脂速率的影响的方法，步骤如下：

将热带假丝酵母原始菌和上述重组菌种子液分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养20小时；每两小时测一次OD₆₀₀，即得热带假丝酵母原始菌和重组菌的生长曲线，结果如图1所示。

所述发酵培养基组分如下：

蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L，水配制，pH 7.0

根据图1的OD₆₀₀值可知重组后的热带假丝酵母的生长速率与热带假丝酵母原始菌类似，表明该基因的敲除不影响热带假丝酵母的葡萄糖碳源的代谢。

实施例2热带假丝酵母ctlpA基因多拷贝菌株构建

在获得ctlpA全长基因的基础上，设计特异性引物克隆目的基因，通过无缝克隆技术将载体和目的基因配置重组反应体系，进行重组反应。转化入DH5α感受态中，筛选阳性克隆子。测序正确后提取质粒电转入热带假丝酵母感受态中。发酵验证增加ctlpA基因拷贝数对细胞吸收油脂速率的影响的。其技术核心是利用同源重组原理，将载体进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在无缝交换酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达95％以上。具体步骤如下：

(i)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ctlpA基因，长度4167bp，所述的PCR引物序列如下：

CtlpA F₂:ctcactatagggagagcggccgcATAGAAGAGTTATTAAAATG；

CtlpA R₂:catccggaagatctggcggccgcATACCACACAGAGAGAATACAT；

其中，下划线标识为Not I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×PhantaMaster Mix25μl，浓度10μmol/L的引物CtlpA F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CtlpA R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

(ii)将质粒载体用限制性内切酶Not I酶切，酶切体系如下，总体系50μL：

所述的载体为实验室已构建的带有G418抗性标签的pZERO-Blunt克隆载体；

(iii)酶切产物使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒柱纯化，柱纯化产物去磷酸化后配置重组体系进行重组反应，反应产物转化、涂板，挑取单菌落采用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子；送至上海博尚测序。

所述的去磷酸化体系如下：

所述的重组体系如下：

所述的PCR引物序列如下：

CtlpA F₂:ctcactatagggagagcggccgcATAGAAGTCTTATTAAATAC；

CtlpA R₂:catccggaagatctggcggccgcATACCAGACAGAGTGAATACTA；

(iv)确认序列的信息正确后，抽提相应的质粒，电转入热带假丝酵母感受态中，步骤如实施例1-(iii)所述，阳性重组菌的培养及鉴定如实施例1所述。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证增加ctlpA基因拷贝数对二元酸产量影响的方法，步骤如下：

将多拷贝重组热带假丝酵母菌和热带假丝酵母原始菌以及热带假丝酵母基因工程重组菌分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取10ml多拷贝重组菌菌液和10ml原始菌菌液以及10ml重组菌菌液分别接种到100ml发酵培养基中，培养12h后分别加入5ml油脂，进入产酸期；在产酸期，每12h或24h调节pH到7.5，产酸期4～5天。

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖64g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB₁ 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L，水配制，pH 7.0；

发酵结束后采用酸碱滴定的方法测量二元酸的产量，结果如图2所示。

根据图2的长链二元酸产量可知重组后的热带假丝酵母菌的长链二元酸(DCA)产量较热带假丝酵母原始菌相比大大减少，多拷贝重组热带假丝酵母菌的长链二元酸产量较热带假丝酵母原始菌相比提高了150％，且菌体并未因拷贝数增加而表现出生长不良的现象。由此可知，ctlpA基因拷贝数增加后酵母分泌产物长链二元酸的能力增强，表明ctlpA基因为热带假丝酵母油脂转运的关键基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3690

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 1

atgaaggcag aaattgatga gaaagagcct tttcctgaaa ctgatgcaga taaccttgag 60

gtagatgtta gtaaaaatgt tttcatgttc gtggaattat caaaagactg gcctattatc 120

atccttgggg ttttattaat ggccgcttca gcagccgcta caccaattaa cacctatgta 180

tatgggaaaa ttatgggaca attatccgag ttctatataa atggttcatc atatcacctt 240

ttcataaacc aaatcggaag actttgcggt gtacttatag gagtgggggg agcaaagttg 300

atcttggtat ggatgggtat gtttatatgg cttaaatttg gagaaatcca acaacatcga 360

gcacgtgaag agatcttcga caaaatatta aaggagccaa cttcctggta tgatttgaac 420

actaatttga tgggagagat gacccaagtc aaccgttgta tcgaagaatt aagaagtggg 480

aatggtgaga taatggctaa cattgtccaa acatgcggat tggtcatttc attgataatt 540

atgtcatttt atcaatcatg gcagattaca cttatagtca tggcttccgc acctgttatg 600

gcagtcgttg gttggtattt cgggaaactt acttacaagg cacaggaaca agaaaatgag 660

tacacttcac aagcttcaaa gattttggac tggtgtttgg ttaacccaat ctcagtacga 720

attttcaacg gtaaatatat agaattgtcc aagtttaacc atatagtgaa tacctccgct 780

aaatcctatt ataaagtagc taacgccata gcagccaaca gtggtgtttt gaagttcctt 840

acattgatga tgttcgtgca gggtttctgg ttcggtgttt acttaatgca aaaaggtcgt 900

gttaccatcg gtcagctttt cactactttt tccagtactc ttatgcttgg acagacaatc 960

tcaggtgtaa caagtttact tgccgtgctt aacactagtc atgccgcagc cggtaagatc 1020

gccaagtact tgcaaactga agaagaacca caattagcta cttgttaccc ttcttattca 1080

gttgacaaca tagaattcga taacgttacc tttaaatatc cttcacgaga tgagatcata 1140

ttaaaaggag ttacattcaa gatacagcag aaccgtttca actacatcat cggaaagagt 1200

ggtgcaggta aatcaactat tccattaata atcatgaatt tatatcctac aatcgggggg 1260

gccgtgcgaa ttgatgggat tcctatccaa taccttgacc caaaatacat tgctcagaac 1320

attacattgt tgcaacaaaa ccctgtcatg tttaataaca agaccatctt ggaaaacata 1380

gcccttggag taatagacga ctatgacact ttggaagaca ttcctcgtca cttggtagaa 1440

aaggcagcca agttctcctt acttttggac ttagacttag atatgaaggt atccgggttg 1500

tctctttcag gaggtcagca acaaagaatt tccattgctc gagcctacct taaggactcc 1560

cctgtattga ttatggacga atctttctca gcattagaca atcagaacaa acaggtactt 1620

ttccaacgta ttaagaagtg gcgtaacggt aagacaacca tcttcataac tcatgaatac 1680

gataacatag aagacgacga cttcgtaatc attatggagc acggtaacgt gaaagatcaa 1740

ggtgaattca taaaatttaa aaacgacgaa gtcgttactt catacaaggc acaagcatac 1800

gaagaggtga aggagcctga ggtaacaaaa gaaaaggccc atacaaatta cgattacaag 1860

acaaatccat acattttaaa agacttggag tcagcctcca tagacgaaga caaagaggag 1920

gagaaattaa tgggtgtcat agccatctta aagtattgca gttcttcaat aacccgtaag 1980

tggcttttgg ccttaggtgt tttaatatct cttcttgaag gtgctgctaa cccaatattc 2040

agttattgct tttccaagtt gttagccatc agtatggagg cttctatagg ggttaacgta 2100

acatcaaaaa tagttgtatg gtcttgtatt tcattgtcaa tcgccgggtt tactgggatt 2160

tccacttatt tgagtgaatt catacttcag tactgctcag agaattggat tgtgtcactt 2220

agacaaatgt ccttcgataa aattaataat caggatatga gttactttaa cagtaagctt 2280

gaaccagcag agataacaac attgcttatg aacgacacta gagatcttcg ttctttagtc 2340

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agtattgtga caggatggaa attagcactt gtaggaatag cttttgtgcc acttgtattg 2460

cttgttacat gcgcctacgg tatcattttg gaaatagccg aaaataagta taagacttca 2520

gtcgtggatg ttgagactca gattcatcag accatgacct caattaaaac catacgactt 2580

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gtagggacct accgagcctt ccagaccgga atcgggtttg caatttccga cttatgctct 2700

gccatttcac agggaataat cttattttac ggaatgcaat tagccggtaa gtttcaatac 2760

tcctacttcc agcttcttga agttataacc cttcttacct tcaccatcag taatgcttct 2820

cttttgataa accatttgcc tgatatagct agaggtcaac gagcaggtac atttgtagtc 2880

aaacttttgg agtcaacacc tatatcaaaa gtggagactg agggtaaaat catccctaga 2940

ccatcagaca aggccatatc ctttaataac gttacttttg cttatccttc cgaccttttg 3000

gagcctaagt tgaagaatgt aactttcgat attaacatca acgaaactgt tggtcttgtg 3060

ggagagagtg gatccggtaa gtcaaccatt atatcaattt tattgagatt atatggggca 3120

aagagtgtga agttattcaa tgaggacatc tcccagatcg atatcgactg gttacgtgaa 3180

accatcggaa tagtcccaca gttccctaaa tttttcgatg gaagtattta tgacaatttg 3240

ttatacggta tgaatcctat tcgaattgtc tccgagcagg aggtcactaa cgtattaaag 3300

ttagtgaaca tgtacgagtt catagtctcc cttcctgagg gtattcagac atgcattggt 3360

gaagggagta attctttagt gtctgggggg caattacagc gtttaagtat tgcccgtgca 3420

atccttagaa atcctaaaat cttgatattc gacgaatgca cttccaatct tgatccaatt 3480

aactctaagc agatcataaa gttgatcgag tcccttaatg ggaaatttac aatattgttt 3540

attacccatg ataaagagat gatgcgtatt gccgacaact taatcgtctt aaaaaacgga 3600

aaattggtcg agcaggggtc ataccttcaa ttgatttcat ccaaaggaga attgagtgaa 3660

attactaagt cccctgatat ttttttataa 3690

<210> 2

<211> 1229

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 2

Met Lys Ala Glu Ile Asp Glu Lys Glu Pro Phe Pro Glu Thr Asp Ala

1 5 10 15

Asp Asn Leu Glu Val Asp Val Ser Lys Asn Val Phe Met Phe Val Glu

20 25 30

Leu Ser Lys Asp Trp Pro Ile Ile Ile Leu Gly Val Leu Leu Met Ala

35 40 45

Ala Ser Ala Ala Ala Thr Pro Ile Asn Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Ile

50 55 60

Met Gly Gln Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Asn Gly Ser Ser Tyr His Leu

65 70 75 80

Phe Ile Asn Gln Ile Gly Arg Leu Cys Gly Val Leu Ile Gly Val Gly

85 90 95

Gly Ala Lys Leu Ile Leu Val Trp Met Gly Met Phe Ile Trp Leu Lys

100 105 110

Phe Gly Glu Ile Gln Gln His Arg Ala Arg Glu Glu Ile Phe Asp Lys

115 120 125

Ile Leu Lys Glu Pro Thr Ser Trp Tyr Asp Leu Asn Thr Asn Leu Met

130 135 140

Gly Glu Met Thr Gln Val Asn Arg Cys Ile Glu Glu Leu Arg Ser Gly

145 150 155 160

Asn Gly Glu Ile Met Ala Asn Ile Val Gln Thr Cys Gly Leu Val Ile

165 170 175

Ser Leu Ile Ile Met Ser Phe Tyr Gln Ser Trp Gln Ile Thr Leu Ile

180 185 190

Val Met Ala Ser Ala Pro Val Met Ala Val Val Gly Trp Tyr Phe Gly

195 200 205

Lys Leu Thr Tyr Lys Ala Gln Glu Gln Glu Asn Glu Tyr Thr Ser Gln

210 215 220

Ala Ser Lys Ile Leu Asp Trp Cys Leu Val Asn Pro Ile Ser Val Arg

225 230 235 240

Ile Phe Asn Gly Lys Tyr Ile Glu Leu Ser Lys Phe Asn His Ile Val

245 250 255

Asn Thr Ser Ala Lys Ser Tyr Tyr Lys Val Ala Asn Ala Ile Ala Ala

260 265 270

Asn Ser Gly Val Leu Lys Phe Leu Thr Leu Met Met Phe Val Gln Gly

275 280 285

Phe Trp Phe Gly Val Tyr Leu Met Gln Lys Gly Arg Val Thr Ile Gly

290 295 300

Gln Leu Phe Thr Thr Phe Ser Ser Thr Leu Met Leu Gly Gln Thr Ile

305 310 315 320

Ser Gly Val Thr Ser Leu Leu Ala Val Leu Asn Thr Ser His Ala Ala

325 330 335

Ala Gly Lys Ile Ala Lys Tyr Leu Gln Thr Glu Glu Glu Pro Gln Leu

340 345 350

Ala Thr Cys Tyr Pro Ser Tyr Ser Val Asp Asn Ile Glu Phe Asp Asn

355 360 365

Val Thr Phe Lys Tyr Pro Ser Arg Asp Glu Ile Ile Leu Lys Gly Val

370 375 380

Thr Phe Lys Ile Gln Gln Asn Arg Phe Asn Tyr Ile Ile Gly Lys Ser

385 390 395 400

Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Pro Leu Ile Ile Met Asn Leu Tyr Pro

405 410 415

Thr Ile Gly Gly Ala Val Arg Ile Asp Gly Ile Pro Ile Gln Tyr Leu

420 425 430

Asp Pro Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Ile Thr Leu Leu Gln Gln Asn Pro

435 440 445

Val Met Phe Asn Asn Lys Thr Ile Leu Glu Asn Ile Ala Leu Gly Val

450 455 460

Ile Asp Asp Tyr Asp Thr Leu Glu Asp Ile Pro Arg His Leu Val Glu

465 470 475 480

Lys Ala Ala Lys Phe Ser Leu Leu Leu Asp Leu Asp Leu Asp Met Lys

485 490 495

Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Ile Ser Ile

500 505 510

Ala Arg Ala Tyr Leu Lys Asp Ser Pro Val Leu Ile Met Asp Glu Ser

515 520 525

Phe Ser Ala Leu Asp Asn Gln Asn Lys Gln Val Leu Phe Gln Arg Ile

530 535 540

Lys Lys Trp Arg Asn Gly Lys Thr Thr Ile Phe Ile Thr His Glu Tyr

545 550 555 560

Asp Asn Ile Glu Asp Asp Asp Phe Val Ile Ile Met Glu His Gly Asn

565 570 575

Val Lys Asp Gln Gly Glu Phe Ile Lys Phe Lys Asn Asp Glu Val Val

580 585 590

Thr Ser Tyr Lys Ala Gln Ala Tyr Glu Glu Val Lys Glu Pro Glu Val

595 600 605

Thr Lys Glu Lys Ala His Thr Asn Tyr Asp Tyr Lys Thr Asn Pro Tyr

610 615 620

Ile Leu Lys Asp Leu Glu Ser Ala Ser Ile Asp Glu Asp Lys Glu Glu

625 630 635 640

Glu Lys Leu Met Gly Val Ile Ala Ile Leu Lys Tyr Cys Ser Ser Ser

645 650 655

Ile Thr Arg Lys Trp Leu Leu Ala Leu Gly Val Leu Ile Ser Leu Leu

660 665 670

Glu Gly Ala Ala Asn Pro Ile Phe Ser Tyr Cys Phe Ser Lys Leu Leu

675 680 685

Ala Ile Ser Met Glu Ala Ser Ile Gly Val Asn Val Thr Ser Lys Ile

690 695 700

Val Val Trp Ser Cys Ile Ser Leu Ser Ile Ala Gly Phe Thr Gly Ile

705 710 715 720

Ser Thr Tyr Leu Ser Glu Phe Ile Leu Gln Tyr Cys Ser Glu Asn Trp

725 730 735

Ile Val Ser Leu Arg Gln Met Ser Phe Asp Lys Ile Asn Asn Gln Asp

740 745 750

Met Ser Tyr Phe Asn Ser Lys Leu Glu Pro Ala Glu Ile Thr Thr Leu

755 760 765

Leu Met Asn Asp Thr Arg Asp Leu Arg Ser Leu Val Ser Gln Tyr Ile

770 775 780

Ser Leu Val Thr Thr Leu Val Thr Met Val Leu Ile Gly Val Ile Trp

785 790 795 800

Ser Ile Val Thr Gly Trp Lys Leu Ala Leu Val Gly Ile Ala Phe Val

805 810 815

Pro Leu Val Leu Leu Val Thr Cys Ala Tyr Gly Ile Ile Leu Glu Ile

820 825 830

Ala Glu Asn Lys Tyr Lys Thr Ser Val Val Asp Val Glu Thr Gln Ile

835 840 845

His Gln Thr Met Thr Ser Ile Lys Thr Ile Arg Leu Phe His Met Asn

850 855 860

Arg Tyr Phe Lys Glu Ser Tyr Asp Glu Ala Leu Val Gly Leu Lys Ser

865 870 875 880

Val Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Gln Thr Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ser

885 890 895

Asp Leu Cys Ser Ala Ile Ser Gln Gly Ile Ile Leu Phe Tyr Gly Met

900 905 910

Gln Leu Ala Gly Lys Phe Gln Tyr Ser Tyr Phe Gln Leu Leu Glu Val

915 920 925

Ile Thr Leu Leu Thr Phe Thr Ile Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ile Asn

930 935 940

His Leu Pro Asp Ile Ala Arg Gly Gln Arg Ala Gly Thr Phe Val Val

945 950 955 960

Lys Leu Leu Glu Ser Thr Pro Ile Ser Lys Val Glu Thr Glu Gly Lys

965 970 975

Ile Ile Pro Arg Pro Ser Asp Lys Ala Ile Ser Phe Asn Asn Val Thr

980 985 990

Phe Ala Tyr Pro Ser Asp Leu Leu Glu Pro Lys Leu Lys Asn Val Thr

995 1000 1005

Phe Asp Ile Asn Ile Asn Glu Thr Val Gly Leu Val Gly Glu Ser

1010 1015 1020

Gly Ser Gly Lys Ser Thr Ile Ile Ser Ile Leu Leu Arg Leu Tyr

1025 1030 1035

Gly Ala Lys Ser Val Lys Leu Phe Asn Glu Asp Ile Ser Gln Ile

1040 1045 1050

Asp Ile Asp Trp Leu Arg Glu Thr Ile Gly Ile Val Pro Gln Phe

1055 1060 1065

Pro Lys Phe Phe Asp Gly Ser Ile Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr Gly

1070 1075 1080

Met Asn Pro Ile Arg Ile Val Ser Glu Gln Glu Val Thr Asn Val

1085 1090 1095

Leu Lys Leu Val Asn Met Tyr Glu Phe Ile Val Ser Leu Pro Glu

1100 1105 1110

Gly Ile Gln Thr Cys Ile Gly Glu Gly Ser Asn Ser Leu Val Ser

1115 1120 1125

Gly Gly Gln Leu Gln Arg Leu Ser Ile Ala Arg Ala Ile Leu Arg

1130 1135 1140

Asn Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asp Glu Cys Thr Ser Asn Leu Asp

1145 1150 1155

Pro Ile Asn Ser Lys Gln Ile Ile Lys Leu Ile Glu Ser Leu Asn

1160 1165 1170

Gly Lys Phe Thr Ile Leu Phe Ile Thr His Asp Lys Glu Met Met

1175 1180 1185

Arg Ile Ala Asp Asn Leu Ile Val Leu Lys Asn Gly Lys Leu Val

1190 1195 1200

Glu Gln Gly Ser Tyr Leu Gln Leu Ile Ser Ser Lys Gly Glu Leu

1205 1210 1215

Ser Glu Ile Thr Lys Ser Pro Asp Ile Phe Leu

1220 1225

Claims

1.一种调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因ctlpA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种长链二元酸转运蛋白CtLpA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的长链二元酸转运的基因ctlpA。

4.一种重组细胞，该重组细胞包含有权利要求3所述重组表达载体或表达权利要求1所述长链二元酸转运的基因ctlpA。

5.权利要求1所述调控热带假丝酵母的长链二元酸转运的基因ctlpA在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：