CN104962574B

CN104962574B - 一种节杆菌表达质粒与应用

Info

Publication number: CN104962574B
Application number: CN201510316768.4A
Authority: CN
Inventors: 谢婧婧; 王浩绮; 宋天顺
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Interesting Enzyme Biotechnology Co ltd; Shanghai Ren Enzyme Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN104962574A

Abstract

本发明公开了一种节杆菌表达质粒，属于基因工程技术领域。本发明公开的质粒为环状，质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，包含节杆菌启动子序列、多克隆位点序列、节杆菌中的复制起始序列、卡那霉素抗性基因序列、大肠杆菌复制起始序列、氨苄青霉素抗性基因序列，能在大肠杆菌和节杆菌中自主复制。利用该质粒在节杆菌CGMCC3584中表达ghprt基因，其cAMP的产量比出发菌株提高了65.2％。

Description

一种节杆菌表达质粒与应用

技术领域

本发明属于分子生物学与生物工程技术领域，具体涉及一种节杆菌表达质粒，及该质粒的构建方法与应用。

背景技术

节杆菌是一种在土壤中分布广泛的专性好氧微生物，在系统分类学上属于放线菌微球菌科(Micrococcaceae)。节杆菌细胞在生长过程中会产生显著的形态变化，早期培养物中的细胞呈不规则细杆状，部分杆菌按照一定的角度排列，进入稳定期后细胞呈球形，将其转接到新鲜的培养基中，细胞又会产生分支，形成不规则的杆状，如此循环是节杆菌最典型的形态特征。节杆菌既可以生存在与普通的土壤中，也可以生存在各种条件复杂的极端环境中，如有机溶剂、极寒地区，近些年的研究表明节杆菌除了具有以上抗逆性以外还能用于生产氨基酸和生物表面活性剂。因此，节杆菌具有重要的研究和工业应用价值。

但是，目前节杆菌可用的表达质粒很少，从而限制了节杆菌的基因研究和工业应用。目前已经报道的节杆菌质粒主要有如下几个：1988年Shaw等利用来源于谷氨酸棒杆菌的复制原点pBL100，以pULRS8为骨架构建了一种隐蔽质粒。2005年Sandu等利用来源于谷氨酸棒杆菌的复制原点pCG100构建了pART2和pART3两种质粒。其中pART2 可以用于基因的组成型表达，pART3可以用尼古丁诱导基因表达。以上所报道大肠杆菌 -节杆菌穿梭质粒都是利用系统发育相近物种的隐蔽质粒构建的。2008年Miteva等报道了以节杆菌隐蔽质粒p54为骨架的杂交载体(hybrid vector)pSVJ21。2011年Ruta等报道了以Arthrobacter rhombi隐蔽质粒pPRH为复制子来源的E.coli-Arthrobacter穿梭质粒 Prmu824Km。上述几种质粒，只有pART2和pART3可以用于在节杆菌中表达基因，其他的质粒仅限于用于研究质粒在节杆菌中的拷贝数及节杆菌的电转化实验。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：提供一种新型的节杆菌表达质粒。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种节杆菌表达质粒，该质粒为环状，该质粒包含SEQ ID NO：1中第152bp～261bp所示的核苷酸序列，该核苷酸序列具有启动子功能。

上述质粒作为基因载体在原核生物中的应用在本发明的保护范围之内。

作为优选，将上述质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。

一种节杆菌表达质粒，该质粒包含SEQ ID NO：1中第572bp～1976bp所示的核苷酸序列，该核苷酸序列具有起始质粒复制的作用。

作为优选，将上述质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。

一种节杆菌表达质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选，将上述质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。

有益效果：

1、本发明提供了一种新型的节杆菌表达质粒，提供了一种新型的节杆菌启动子和节杆菌中的复制子。

2、利用该节杆菌表达质粒表达绿色荧光蛋白基因，利用荧光显微镜能观察到明显的绿色荧光，说明gfp基因得到了表达。

3、利用本发明提供的质粒在节杆菌CGMCC3584中表达hgprt基因，其cAMP产量达到了7.80g/L，比出发菌株提高了65.2％。

附图说明

图1pA3质粒图。

图2ORF1比对结果。

图3pUAK3质粒构建电泳图；M1:DL5000marker M2:DL2000marker 1:MCS 序列部分2：REP1 3：kan基因 4：pUC18。

图4pUAK3质粒图。

图5pUAK4质粒构建电泳图；M1:DL5000marker M2:DL2000marker 1:MCS 序列部分3：kan基因 4：pUC18 2：REP2。

图6pUAK4质粒图。

图7pUAKP质粒构建电泳图；M1：DL 2000marker M2：DL 10000marker 1：P13-3 启动子片段酶切回收 2：pUAK4酶切回收 3：pUAKP质粒酶切验证。

图8pUAKP质粒图。

图9 pUAKP-GFP质粒图。

图10荧光显微镜观察结果图。

图11节杆菌空菌、pAK-Arth、pUK-Arth发酵结果比较；1:节杆菌空菌 2： pAK-Arth3：pUK-Arth。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：节杆菌复制子的获取。

通过在GenBank中检索节杆菌的天然质粒，发现pA3质粒(GenBank登记号为AJ131246.1)的全长为2205bp，含有5个ORF(如图1所示)全序列。为研究该质粒的复制子，将pA3质粒的基因序列交由苏州金唯智生物技术有限公司合成进行全基因合成。

pA3大小为2205bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，G+C含量为59.86％，含有5个ORF，每一个ORF的。将GenBank中标注的5个ORF编码的氨基酸序列在 NCBI中BLAST，比对结果见表1所示，结果表明ORF1氨基酸序列与Propionibacterium acnes的复制起始因子有30％相似性(见图2)说明ORF1最可能就是pA3的复制起始因子但是其余ORF的氨基酸序列在NCBI中没有找到相似的基因序列，无法确定其余各ORF的功能。

表1pA3质粒ORF功能预测

根据启动子预测结果和BLAST结果，确定ORF1可能是pA3质粒的复制起始位点，于是将ORF1连同其上游150bp一起克隆下来，记为REP1，通过一步克隆的方法将 REP1、卡那霉素抗性基因克隆到pUC18质粒上得到pUAK3质粒，其基因PCR结果见图3。

pUAK3质粒的构建方法如下：以pUC18为模板，Puc18-F和Puc18-R为引物对扩增得到pUC18-p序列；以pART2质粒为模板，MCS-F和MCS-R为引物对扩增得到MCS 序列；以pUC57-pA3质粒(克隆有pA3质粒的pUC57质粒)为模板，REP-F1和REP-R 为引物对扩增得到REP-1，以pART2为模板；Kan-F和Kan-R为引物对，PCR得到Kan 片段。按照表2所示的PCR反应体系扩增各个片段。上述各引物序列如表3所示。

表2PCR反应体系

表3引物设计序列

将得到的PCR片段通过切胶回收，以凝胶成像系统带有的浓度估算程序计算片段浓度，利用南京诺唯赞生物科技有限公司多片段克隆试剂盒进行一步克隆。按照南京诺唯赞生物科技有限公司多片段克隆试剂盒说明书计算各个片段的添加量，一步克隆体系如表4所示。

表4一步克隆体系

反应体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀个组分，避免产生气泡。置于37℃反应30min。待反应完成后将反应罐置于冰水浴中冷却5min。将20μl的反应液加入200μl高效大肠杆菌感受态中，按照正常大肠杆菌感受态的转化过程进行转化，转化后涂布卡那霉素的LB平板。待转化平板上长出单菌落后，将单菌落挑到5ml液体LB 培养基中，然后通过提质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒大小来判断所有片段是否都连接上。将得到的阳性克隆质粒命名为pUAK3(图4)。

将测序正确的pUAK3质粒转化节杆菌，培养36h，观察平板上是否长出菌落，能长出菌落的说明该复制子在节杆菌中可用。

将pUAK3质粒转化节杆菌，培养36h，发现平板上没有长出单菌落，说明仅仅有993bp这一段序列pUAK3质粒不能在节杆菌中自主复制。

利用与以上步骤相同的方法，以pUC57-pA3质粒(克隆有pA3质粒的pUC57质粒) 为模板，以REP2-F和REP-R为引物，PCR获得SEQ ID NO：1中第572～1976所示的序列(图5)，命名为REP2，将REP2片段、MCS片段、卡那霉素抗性片段利用一部克隆的方法克隆到pUC18质粒上，得到pUAK4质粒(图6)。pUAK4转化节杆菌并涂布卡那霉素浓度为150μg/ml的LB平板，培养36h后，平板上可以长出单菌落。将单菌落用牙签挑到液体节杆菌培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏 10g/L，pH7.2)中，30℃、200rpm培养18h提质粒，并用该质粒溶液作为PCR模板PCR 扩增质粒上卡那霉素抗性基因，实验结果表明，pUAK4质粒可以在节杆菌中自主复制。REP2具有起始质粒复制的功能。

实施例2：新型节杆菌质粒pUAKP的构建与功能验证。

将P13-3启动子(SEQ ID NO：1中152～261所示的序列，该启动子由本实验室筛选得到)通过酶切连接的方法克隆到pUAK4质粒的BamHⅠ位点处(图7)，得到pUAKP 质粒(图8)。

在pUAKP质粒的多克隆位点处插入gfp基因(绿色荧光蛋白)得到pUAKP-gfp质粒(图9)，以pARK-gfp(在多克隆位点处连入了gfp基因的pARK质粒)质粒为对照，利用荧光显微镜在同等的曝光时间下观察各菌株的荧光强度，如图10所示，中A、B、 C分别是节杆菌空菌(本发明中用到的节杆菌为CGMCC3584，该菌株的具体信息已经在申请号为201010191515.6的中国专利中详细公开)、含有pARK-gfp质粒的节杆菌、含有pUAKP-gfp质粒的节杆菌观察照片。从图中可以看出在同等的条件下节杆菌空菌看不到绿色荧光，pART2-gfp可以观察到微弱的绿色荧光，pUAKP-gfp-Arth质粒可以观察到最强的绿色荧光，实验结果直观地表明表明pUAKP质粒可以调控基因的表达，且 P13-3启动子具有较强的启动子能力。

实施例3：pUAKP质粒的应用。

将次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(简写为hgprt基因，201310248615.1已经公开该基因的序列)克隆到pARK(201510186254.1中已经公开该质粒的核苷酸序列)质粒和 pUAKP质粒的多克隆位点处，分别得到pARK-hgprt质粒和pUAKP-hgprt质粒。将上述两种质粒分别转化节杆菌CGMCC 3584，得到的菌株分别命名为pAK-Arth、pUK-Arth，按照如下方法发酵产cAMP：

1、菌株活化：节杆菌CGMCC 3584、pAK-Arth、pUK-Arth三株菌分别在节杆菌固体培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏10g/L，琼脂20g/L pH7.2， 121℃高压蒸汽灭菌15min)上划线活化36h。

2、种子液：从活化平板上分别挑取三株菌的单菌落到节杆菌液体培养基中，30℃、220rpm培养24h，得到种子液。

3、cAMP发酵：将种子液按2％的接种量转接到发酵培养基中(葡萄糖40，K₂HPO₄ 18，KH₂PO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 0.1，尿素10，CoCl₂ 0.005，NaF 0.4，生物素0.01，次黄嘌呤6，pH7.0)，在30℃2、40rpm条件下培养72h，得到发酵产物，用HPLC分析发酵液中cAMP的产量。

以pARK-hgprt和pUAKP-hgprt质粒构建的重组菌pAK-Arth、pUK-Arth发酵结果如图5-10所示，节杆菌空菌、pAK-Arth、pUK-Arth的产量分别为4.72g/L、6.51g/L、 7.80g/L。实验结果表明，在Arthrobacter CGMCC3584中表达hgprt基因可以提高节杆菌cAMP的产量。利用重组菌pAK-Arth的cAMP产量比出发菌提高了37.9％，以新型表达质粒pUAKP构建的重组菌pUK-Arth的cAMP产量比出发菌提高了65.2％。由此可见，相比pARK质粒，新型节杆菌过表达质粒pUAKP能够明显提高基因的表达量，提高目的产物的产量。

Claims

1.一种节杆菌表达质粒，其特征在于，该质粒启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第152bp～261bp所示。

2.权利要求1所述的质粒作为基因载体在节杆菌中的应用。

3.一种节杆菌表达质粒，其特征在于，该质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.权利要求3所述的质粒作为基因载体在节杆菌中的应用。