CN104862315B - 一种维持菌株高效固氮能力的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明首次发现了一种可转录的有功能性的非编码RNA基因，具有可维持菌株固氮活性的能力。本发明发现该基因可特异响应外界氮信号，参与固氮施氏假单胞菌的固氮酶活性调控，维持菌株高效固氮能力，因而可用于获得具有高效固氮能力的基因工程菌株。

Description

一种维持菌株高效固氮能力的基因
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可维持菌株高效固氮能力的基因及其应用。
背景技术：
细菌非编码RNA通常位于蛋白编码基因间区，大小通常在40-500个核苷酸，可转录出RNA序列，但不翻译成蛋白质。近年来，研究发现细菌非编码RNA在原核生物如环境胁迫、物质代谢、群体感应以及细菌毒力等诸多生命活动过程中发挥了重要的调控功能。
在固氮细菌中，越来越多的非编码RNA得以鉴定和研究。这些已经阐明的小RNA的功能大多集中在保守的持家功能、固氮菌对环境信号的响应、对逆境胁迫的抵御以及根瘤菌的共生结瘤过程。本发明对细菌小非编码RNA是否直接参与生物固氮的调控过程进行了初步探索。
固氮施氏假单胞菌的非编码RNA ArsZ序列(RNA序列为SEQ ID NO:1)中，由对应的arsZ基因编码(DNA序列为SEQ ID NO:2)，该基因编码区不具有微生物中典型的始密码子和终止密码子，现有技术中尚未发现其能转录并翻译成有功能的蛋白质，也没有其用途方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的是发现能特异响应氮信号的基因，并探索其序列特征以及遗传特性和作用模式。
本发明人在进行施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)转录组分析过程中，首次发现了一种可转录的有功能性的非编码RNA基因，并命名为arsZ基因(铵响应小RNA，Ammonium-Responsive Small RNA，ArsZ)。
所述非编码RNA ArsZ(RNA序列为SEQ ID NO:1)是经核苷酸序列为SEQ ID NO:2的DNA转录而成的。
本发明发现该基因可特异响应氮信号，参与固氮施氏假单胞菌固氮调控，能够维持菌株高效固氮能力，可以应用于获得具有高效固氮活性的工程菌株。
本发明进一步发现，所述参与固氮施氏假单胞菌固氮调控，是在转录水平上延长固氮酶结构组分nifD mRNA的半衰期，稳定固氮酶，从而维持固氮施氏假单胞菌高效的固氮能力。
具体来讲，本发明进行了如下工作：
1、发现固氮施氏假单胞菌A1501中arsZ基因的功能
本发明人进行了非编码RNA编码基因arsZ对特异信号的响应表达分析，发现arsZ基因能够特异的响应氮信号。
将施氏假单胞菌A1501菌在以下几个时相中培养：有氮有氧条件(CNO，K培养基)、无氮有氧条件(CN-O，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟，然后注入0.5％的氧气)，并收集菌体，提取RNA后进行反转录合成cDNA，通过Real-time PCR方法对arsZ基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析。
结果显示，固氮施氏假单胞菌A1501的全基因组中含有arsZ基因的DNA序列，与有氮有氧条件(CNO)相比，在无氮有氧条件下(CN-O)arsZ的转录水平显著提高了近2.5倍，说明arsZ基因能够特异的感应氮信号。表明固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)中arsZ基因能对氮信号做出响应。
2、arsZ基因的遗传特性研究
进行arsZ基因生物信息学分析Rfam数据库和GenBank数据库中的BLASTN比对分析，表明arsZ基因(DNA序列如SEQ ID NO:2所示)基因属于一类具有种特异性，功能仍未确定的基因家族。
arsZ基因生物信息学分析：
将NCBI数据库中下载的arsZ的核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)的转录产物(如SEQ ID NO:1所示)在Rfam数据库中进行比对，发现转录出的RNA ArsZ的序列与数据库中的RNA家族中的任何成员不存在同源性，这表明ArsZ可能属于一类新的功能仍未确定的RNA家族；
与GenBank数据库中的BLASTN比对，进一步显示该非编码RNA的编码基因arsZ的同源序列仅仅在四株施氏假单胞菌和棕色固氮菌中存在(如图2)，这说明arsZ是一类功能未知的具有种特异性的功能单元。
3、获得具有高效固氮活性的工程菌株
1)构建arsZ基因突变株
分别将包含该非编码RNA上下游同源基因序列和抗性盒筛选标记的自杀载体转至P.stutzeri A1501中，利用同源重组的原理获得arsZ的缺失突变株ΔarsZ。
2)构建arsZ回补质粒
首先通过PCR扩增获得完整的arsZ DNA片段，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII双酶切，插入到广宿主表达载体pLAFR3的多克隆位点处，最后将arsZ表达载体转入到大肠杆菌感受态细胞Trans109中获得具有四环素抗性的重组表达菌株E.coli Trans109(parsZ)。
3)验证arsZ基因的功能
采用乙烯还原法测定野生型A1501菌株和arsZ缺失突变株的固氮酶活性。
结果表明，与野生型菌株相比，ΔarsZ菌株的固氮酶活能力降低50％，而回补菌株的固氮酶活性则与野生型相当。
Real-time PCR结果进一步证明arsZ的缺失能够降低固氮相关基因的转录水平，推测arsZ可能通过对氧信号的响应参与到了固氮施氏假单胞菌A1501生物固氮的调控过程。
本发明的有益效果：本发明首次发现了能转录成有功能性的非编码RNA基因arsZ，且该基因的转录产物(基因序列为SEQ ID NO:1)可维持菌株的高效固氮能力，可应用于获得具有高效固氮活性的工程菌。
本发明还提供了一种维持菌株高效固氮能力的方法，特征在于应用arsZ基因的功能进行遗传转化。
所述方法具体包括克隆完整的arsZ基因的DNA片段序列和构建具有高效固氮能力的重组菌株的步骤。
克隆完整的arsZ基因的DNA片段的优选方法是从核苷酸序列为SEQ ID NO:2的DNA转录而成的非编码RNA基因。
为验证和对比arsZ基因的功能，本发明还构建了arsZ基因的缺失突变株和回补株，其中，缺失突变株的构建步骤为：
(1)克隆出含有基因组同源序列和替换arsZ基因的抗性盒筛选标记的DNA片段；
(2)将(1)得到的DNA片段酶切后插入到自杀载体中，得到重组载体；
(3)将步骤(2)得到的重组载体转化到野生型菌株中，筛选缺失突变株，即arsZ基因完全敲除的菌株。
优选的方法如下：
步骤(1)中，所述克隆是利用融合PCR方法；
步骤(2)中，所述插入到自杀载体，是将arsZ基因插入到自杀载体的多克隆位点；
所述自杀载体是自杀载体pK18mobsacB；
步骤(3)中，所述野生型菌株为固氮施氏假单胞菌。
步骤(3)中，所述转化是通过三亲接合的方法，所述筛选是通过同源重组筛选arsZ基因敲除菌株。
序列表说明
非编码RNA ArsZ的RNA序列SEQ ID NO:1。
非编码RNA ArsZ的编码基因arsZ的DNA序列SEQ ID NO:2。
arsZ基因PCR扩增特异性引物序列Pst_2408BamHIF，SEQ ID NO:3。
arsZ基因PCR扩增特异性引物序列Pst_2409HindIIIR，SEQ ID NO:4。
附图说明
图1为arsZ基因对特异信号响应的分析。其中，两个直方图分别为野生型菌株在有氮的K培养基和无氮的K培养基中培养时，arsZ基因相对表达量的比较。
图2为固氮施氏假单胞菌A1501中arsZ基因的同源性比对及上下游基因分布分析。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限定本发明的范围。
本发明中未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规技术条件。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明做更为详细地阐述；实施例仅用于举例说明本发明，而不用于限制本发明的范围。具体操作过程中，在发明的基础上，本领域的技术人员可以根据实际需要做一些非实质性地修改，这些修改都应属于本发明保护的范围。
实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 arsZ基因的表达特异响应环境氮信号的功能验证
实验步骤如下：
(1)将施氏假单胞菌A1501菌在LB液体培养基中活化，30℃过夜培养；
(2)次日4000rpm/10min离心菌体，用生理盐水洗涤菌体两次；
(3)用生理盐水悬浮菌体，调OD600≈1.0；
(4)分别将菌体在以下几个时相中培养：有氮有氧条件(CNO，K培养基)、无氮有氧条件(CN-O，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟，然后注入0.5％的氧气)，调OD600≈0.5；
(5)培养液30℃震荡培养0.5h后，8000rpm离心5min，收集菌体；
(6)采用Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品RNA进行单链DNA(cDNA)反转。
(7)通过Real-time PCR方法对arsZ基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析，结果如图1所示：纵坐标表示arsZ基因在mRNA水平上的相对表达量，横坐标代表arsZ基因。
实验结果：
固氮施氏假单胞菌A1501的全基因组中含有arsZ基因的DNA序列，从图1中可以看出，与有氮有氧条件(CNO)相比，在无氮有氧条件下(CN-O)arsZ的转录水平显著提高了近2.5倍。
实验结论：
arsZ基因的表达特异的响应外界环境中的氮信号。
实施例2固氮施氏假单胞菌野生型菌株、arsZ缺失突变株及回补菌株固氮酶活比较
一、固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)中arsZ基因缺失突变株的构建：
首先利用融合PCR技术将目的基因的上游同源片段、氯霉素抗性盒基因以及目的基因的下游同源片段融合成一大小约为2.1kb的融合片段，然后将克隆片段进行BamH I和Hind III双酶切，连接到自杀载体pk18mobsacB上。将构建好的自杀重组质粒通过三亲结合的方法导入到野生型A1501菌中，通过与染色体上基因的同源重组将自杀质粒整合到了染色体上，利用抗性筛选和PCR验证得到单交换菌株，然后根据sacB基因在10％蔗糖选择压下致死的特性，将经过PCR验证的单交换克隆按照10-3、10-4和10-5的稀释梯度分别涂布在含有10％蔗糖的氯霉素抗性的LB平板，进行双交换的筛选，经PCR验证得到目的基因arsZ的缺失突变菌株ΔarsZ。
二、固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)中arsZ基因回补菌株的构建：
首先PCR扩增获得完整的arsZ DNA片段，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII酶切，插入到广宿主表达载体pLAFR3的多克隆位点处，最后将arsZ表达载体转入到大肠杆菌感受态细胞Trans109中获得具有四环素抗性的重组表达菌株E.coli Trans109(parsZ)。将构建好的E.coli Trans109(parsZ)供体质粒，同样通过三亲结合的方法导入到arsZ的缺失突变菌株中。
本实施例中，所述arsZ基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。
本实施例中，所述克隆完整的arsZ基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组中通过PCR扩增出完整的arsZ基因的DNA片段序列，PCR扩增特异性引物序列为：Pst_2408BamHIF-SEQ ID NO:3和Pst_2409HindIIIR-SEQ ID NO:4。
三、野生型菌株和arsZ缺失突变株及回补菌株固氮酶活的测定
实验步骤如下：
(1)将待测的各菌株同时活化，并保持生长状态一致。
(2)将活化后的各菌株分别接入20ml液体限制性K培养基，30℃，200rpm振荡过夜培养。
(3)将20ml菌液转移至50ml离心管，4℃，4000×g离心10min，然后用0.85％的NaCl洗涤1次，4℃，4000×g离心10min，再用无氮限制性K培养基将菌液稀释到OD600为1.0。
(4)向每个三角瓶中(盐酸过夜浸泡后灭菌)加入9ml的A15无氮限制性培养基，再加入1ml稀释后的菌液。盖上胶塞，用密封条将瓶口与瓶身结合处缠紧，以防漏气，并做好标记。每个菌株做四个重复。
(5)向加入菌液的三角瓶注入氩气以排出空气，排气4min后，向瓶注入总体积0.5％的氧气和10％乙炔(三角瓶总体积为70ml，加入10ml液体，剩余空气体积为60ml，所以应注入300μl的氧气和6ml乙炔)，在塞子针孔处贴上胶布以防漏气。30℃，200rpm振荡培养。
(6)每隔1小时取一次样，每次取样用微量进样器从瓶中抽气250μl，注入气相色谱(SP-2100型气相色谱仪)中检测乙烯含量，并记录乙烯峰面积。
(7)利用公式计算固氮酶的活性：
在测得乙烯含量和蛋白含量的基础上，根据如下公式计算固氮酶活性。固氮酶活(nmol C2H4/mg protein hr)的计算公式为：
实验结果：
缺失突变株ΔarsZ的固氮与野生型菌株相比，酶活降低50％，而回补菌株的固氮酶活性则与野生型相当。具体固氮酶活数值如下表所示：
实验结论：
arsZ基因的突变降低菌株固氮酶活近50％，采用arsZ基因回补突变株可获得与野生型菌株相似水平的固氮酶活性。
推测arsZ基因可能通过某种机制参与了施氏假单胞菌A1501固氮酶活性调控。
实施例4野生型和arsZ缺失突变株中固氮酶编码基因nifD mRNA的半衰期测定
实验步骤如下：
(1)从平板上挑取单菌落接种到含有相应抗生素的LB新鲜液体培养基中，30℃，220rpm，摇床过夜培养。
(2)将菌液转接到新鲜的测固氮酶活的无氮K培养基中，使得初始OD600为0.3。
(3)固氮条件下诱导培养6h后，测定并记录固氮酶活数值，同时向菌液中加入终浓度为200μg/ml的利福平来抑制RNA的合成。利福平分别处理0、1、3、5、7分钟后，12000g，2min迅速离心去上清。
(4)加入2倍利福平体积的RNA later(Sigma公司)，悬浮，室温下处理5分钟后，迅速离心，去上清，液氮速冻。置于-80℃保存备用。
(5)提取样品RNA，反转录合成cDNA，通过Real-time PCR检测mRNA的半衰期。以看家基因recA的半衰期做参考对照。
实验结果：
从固氮酶钼铁蛋白结构基因nifD mRNA的稳定性来看，在野生型菌株中其半衰期大约在第3－5min之间，而在缺失突变株ΔarsZ中nifD mRNA的半衰期，在第5－7min之间。(见下表)
实验结论
非编码RNA ArsZ作为稳定因子在维持nifD mRNA的稳定性及固氮过程优化中发挥了重要作用。

Claims (5)

1.一种维持菌株固氮能力的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的功能RNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的维持菌株固氮能力的基因在固氮施氏假单胞菌中获得具有固氮活性的工程菌中的应用。
3.含权利要求1所述维持菌株固氮能力的基因的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒在固氮施氏假单胞菌中获得具有固氮活性的工程菌中的应用。
5.一种维持菌株固氮能力的方法，特征在于应用SEQ ID NO:2所示序列的基因在固氮施氏假单胞菌中进行遗传转化。
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