CN105755120B - 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒 - Google Patents

固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105755120B
CN105755120B CN201610154440.1A CN201610154440A CN105755120B CN 105755120 B CN105755120 B CN 105755120B CN 201610154440 A CN201610154440 A CN 201610154440A CN 105755120 B CN105755120 B CN 105755120B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudomonas stutzeri
fixed nitrogen
pcr
seq
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610154440.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105755120A (zh
Inventor
周正富
张维
燕永亮
战嵛华
柯秀彬
林敏�
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN201610154440.1A priority Critical patent/CN105755120B/zh
Publication of CN105755120A publication Critical patent/CN105755120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105755120B publication Critical patent/CN105755120B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明设计了用于固氮施氏假单胞菌A1501的一对PCR检测引物。本发明还提供了包含所述引物的试剂盒。经实验证明，应用本发明的检测引物对转固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性的PCR定性检测，特异性显著。

Description

固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异性检测方法及试剂盒
技术领域：
本发明涉及固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异检测方法及试剂盒，特别涉及一种PCR检测方法及试剂盒。
背景技术：
固氮施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)是一株1980年分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌，属于变形细菌γ亚群，是目前假单胞菌属中发现的少数具有固氮特性的农业微生物菌株之一。固氮施氏假单胞菌A1501在微好氧条件下具有良好的固氮活性，而且固氮产物能够迅速被水稻直接吸收利用，具有良好应用潜力的农业微生物。2005年完成了该菌的全基因组测序及功能注释工作。该基因组全长4567418bp，编码4146个ORFs，是国际上第一例完成全基因组测序的联合固氮菌。
在生物固氮研究中，采用生物技术选育高效固氮菌是提高田间应用效果的可行途径。随着固氮菌在农业生产上的推广应用，定会与大量人群接触而将其散布到自然环境中。由于这些菌株是通过基因工程选育的，可能引入人工重组DNA，因此对其安全性必须认真对待。而对菌的检测保证其安全性的重要工作内容。目前尚未有任何关于农业微生物菌株固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测方法及试剂盒，本发明的直接目的，是提供合适的用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测引物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明根据固氮施氏假单胞菌A1501菌株基因组序列特征，设计了用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测引物。经实验证实，所设计的引物对具有极好的扩增效果，可以用于固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异性检测。
所述引物是引物对1，其核苷酸序列为：
引物对1：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
用本发明提供的PCR检测引物，与本常规PCR检测试剂盒的其它成分，可组合为一种用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测试剂盒。
一种固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用前述的PCR检测引物对1。
本发明所述的检测方法的具体操作步骤如下：
(1)提取待检测样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，用所述引物对1建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增；
(3)根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA片段的条带，鉴定被检测的样品是否为固氮施氏假单胞菌A1501菌株：
如果扩增出该条带，则确定是固氮施氏假单胞菌A1501；如果不能扩增出，则确定不是。
其中，所述提取待检测样品的DNA的方法，可以选用本领域从样本材料中提取DNA的任何方法，例如可以是CTAB法、溶菌酶法或SDS裂解法等。
本发明考察了PCR反应体系和扩增条件对检测效果有影响。发现PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度影响检测结果的特异性、灵敏度；在引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
本方法所述的PCR扩增体系为：反应体系的总体积为20.0μL，其中，10×PCR缓冲液2μL，dNTPs混合溶液2μL，10μmol/L SEQ ID No.1所示的引物1.0μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物1.0μL，5U/μL Go Taq酶0.2μL，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。
所述的PCR扩增条件优选为：96℃，5min；96℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。
本发明的效果：
采用本发明建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR定性检测方法对多个菌株进行了检测，检测的菌株的包括：施氏假单胞菌P.stutzeri RCH2、施氏假单胞菌P.stutzeri CCUG29243、铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1、恶臭假单胞菌P.putida、荧光假单胞菌P.Fluorescens、大肠杆菌E.coli K12、枯草芽孢杆菌B.subtilis、耐辐射异常球菌D.radiodurans进行了定性检测。
定性PCR扩增结果表明，仅在固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(836bp)；并且通过测序分析证实转固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。而在其它所有菌株基因组中均没有扩增得到目的片段大小的片段。
以上实验结果表明：本发明所建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。
附图说明
图1PCR反应体系中引物1终浓度和退火温度优化结果：M：Trans 2K plus II DNAMarker；1-5引物终浓度为0.1μM/L；1：55℃；2：56℃；3：58℃；4：60℃；5：62℃；6-10引物终浓度为0.2μM/L；6：55℃；7：56℃；8：58℃；9：60℃；10：62℃；11-15引物终浓度为0.5μM/L；11：55℃；12：56℃；13：58℃；14：60℃；15：62℃；16-20引物终浓度为1.0μM/L；16：55℃；17：56℃；18：58℃；19：60℃；20：62℃。
图2转化体方法特异性检测；M：Trans 2K plus II DNAMarker；1：空白对照；2：阴性对照；3：A1501样品；4-11：分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8。
实施例1基于固氮施氏假单胞菌A1501菌株基因组序列建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法
一、固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性检测引物的设计
根据固氮施氏假单胞菌A1501基因组特异性序列为靶序列设计4对转化体特异性引物，引物序列如下：
引物1：扩增产物片段大小为836bp
1-F：CGATTTCGGCTTCATCAATT(SEQ ID No.1)
1-R：TGCTGGCTCTGTTTCTCTGC(SEQ ID No.2)
二、菌株基因组DNA的提取与检测
1菌株DNA提取
(1)取细菌培养液1-5ml，离心去上清；
(2)1ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合，65℃水浴40min，期间颠倒混匀数次；
(3)12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酚、氯仿-异戊醇(24：1)，充分混合。重复本操作1次；
(4)12000r/min离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20℃放置2小时或更长时间；
(5)12000r/min离心10min，弃上清，加入500μL，70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。离心，弃上清，充分挥发乙醇，干燥DNA。
(6)加100μl水溶解DNA，用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。
备注：CTAB提取缓冲液的配制
600mL蒸馏水中加入81.7g NaCl和20g CTAB,再加入100mL的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液，100mL的0.5M EDTA(pH 8.0)溶液，调pH至8.0，加水定容至1000mL。高温高压(103.4kPa/121℃)条件下灭菌20min后使用。
2 DNA检测
取5ul提取的DNA溶液，以1.0％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。
三、检测引物
所使用的检测引物为引物对1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。四、PCR反应体系和条件优化
调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0.1μM、0.2μM、0.5μM、1.0μM等4个浓度梯度，并以55℃、56℃、58℃、60℃、62℃为退火温度进行PCR反应的扩增。
结果表明，在所设的不同引物浓度和不同退火温度条件下均能扩增出预期大小的片段，但在引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃时效果最好(图1)。
经过优化，固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测的体系见表1，PCR反应程序见表2。
表1固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测体系
表2固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR反应程序
实施例2固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法的特异性分析
一、实验材料
样品1：施氏假单胞菌P.stutzeri RCH2。
样品2：施氏假单胞菌P.stutzeri CCUG29243。
样品3：铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1。
样品4：恶臭假单胞菌P.putida。
样品5：荧光假单胞菌P.Fluorescens。
样品6：大肠杆菌E.coli K12。
样品7：枯草芽孢杆菌B.subtilis。
样品8：耐辐射异常球菌D.radiodurans。
以上实验材料由中国农科院生物技术研究所提供。
二、实验方法及结果
以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检测引物对，按照实施例2所建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法对各种材料进行扩增。结果表明，固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(836bp)，在其他样品基因组中均未扩增得到目的片段大小的片段(图2)。通过测序分析表明固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株异性定性PCR检测方法具有高度特异性。

Claims (7)

1.一种固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括有特异性PCR检测引物对1，所述引物对1的核苷酸序列分别为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
2.一种固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的引物对1。
3.权利要求2所述的方法，操作步骤如下：
(1)提取待检测样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，用所述引物对1建立PCR反应体系，并进行PCR扩增；
(3)根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA片段的条带，鉴定被检测的样品是否为固氮施氏假单胞菌A1501菌株：如果扩增出该条带，则确定是固氮施氏假单胞菌A1501；如果不能扩增出，则确定不是。
4.权利要求3所述的方法，所述PCR反应体系为：总体积20.0μL，其中，10×PCR缓冲液2μL，dNTPs混合溶液2μL，10μmol/L SEQ ID No.1所示的引物0.5μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物0.5μL，5U/μL Go Taq酶0.2μL，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。
5.权利要求3所述的方法，PCR扩增条件为：96℃，5min；96℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。
6.权利要求3所述的方法，所述提取待检测样品的DNA的方法，选自CTAB法、溶菌酶法或SDS裂解法。
7.SEQ ID No.3所示序列的核苷酸在检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性中的应用。
CN201610154440.1A 2016-03-17 2016-03-17 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒 Active CN105755120B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610154440.1A CN105755120B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610154440.1A CN105755120B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105755120A CN105755120A (zh) 2016-07-13
CN105755120B true CN105755120B (zh) 2019-04-30

Family

ID=56333447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610154440.1A Active CN105755120B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755120B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000253886A (ja) * 1999-03-11 2000-09-19 Taisei Corp 環境浄化関連遺伝子検出用ｄｎａマイクロアレイ及び環境浄化方法
CN104862315A (zh) * 2015-06-02 2015-08-26 中国农业科学院生物技术研究所 一种维持菌株高效固氮能力的基因

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000253886A (ja) * 1999-03-11 2000-09-19 Taisei Corp 環境浄化関連遺伝子検出用ｄｎａマイクロアレイ及び環境浄化方法
CN104862315A (zh) * 2015-06-02 2015-08-26 中国农业科学院生物技术研究所 一种维持菌株高效固氮能力的基因

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501;Yongliang Yan, et al.;《 PNAS》;20080527;第105卷(第21期);第7564页右栏倒数第1段-第7565页左栏第1段，图1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105755120A (zh) 2016-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109504799A (zh) 一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法
Anabestani et al. Identification of putative effector genes and their transcripts in three strains related to ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’
CN109554362A (zh) 一种基因组dna提取试剂盒和方法
Van Dillewijn et al. Effect of a Sinorhizobium meliloti strain with a modified putA gene on the rhizosphere microbial community of alfalfa
CN110172526A (zh) 一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用
CN107400736A (zh) 鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
CN113046476A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒n501y突变的引物组合物及试剂盒
CN105755120B (zh) 固氮施氏假单胞菌a1501菌株的特异性检测方法及试剂盒
CN111850153A (zh) 检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒
CN109680087B (zh) 一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重pcr检测方法及其引物组
CN106957923B (zh) 一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物及检测方法
Pavlova et al. Genome of Linaria dalmatica contains Agrobacterium rhizogenes RolC gene homolog
CN104946637B (zh) 一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重dpo‑pcr检测试剂盒及其应用
JP3525259B2 (ja) ペクチネータス属菌の検出
CN114480690A (zh) 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒
CN104328205A (zh) 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立
CN105463105B (zh) 鉴定北京泛菌的方法及其所用成对dna分子
CN109371172A (zh) 一种甘蔗白叶病植原体的pcr检测方法
CN114438257B (zh) 一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、试剂盒及其应用
CN116083449B (zh) 一种旋柄腐霉的特异性检测靶标Phe_g13067及其应用
CN110079624B (zh) 一种特异性检测解淀粉芽孢杆菌tf28的引物对、检测方法及应用
KR101983456B1 (ko) 네스티드 pcr을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법
RU2608505C1 (ru) Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei
CN115820883A (zh) 一种基于crispr的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针
CN116926170A (zh) 基于硫修饰核酸及硫修饰核酸识别蛋白的核酸检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220629

Address after: 101405 Beijing city Huairou District Bohai town Huai Sha Road No. 536

Patentee after: Zhongnongchuangda (Beijing) Environmental Protection Technology Co.,Ltd.

Address before: 100081 No. 12 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun

Patentee before: BIOTECHNOLOGY Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220927

Address after: Room 303-30, 3rd Floor, Building 4, No. 9, Yike Road, Life Science Park, Changping District, Beijing 102200 (cluster registration)

Patentee after: Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 101405 Beijing city Huairou District Bohai town Huai Sha Road No. 536

Patentee before: Zhongnongchuangda (Beijing) Environmental Protection Technology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right