CN115820883A - 一种基于crispr的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针。所述引物根据如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的靶位点设计得到；crRNA探针根据如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的靶向位点设计得到。一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其由冻干试剂1，包括所述的引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列；缓冲液1；冻干试剂2，包括所述的Cas12蛋白；缓冲液2；基因组DNA提取试剂1、2；紫光手电组成。利用基因组DNA提取试剂处理菌液；通过引物、重组酶聚合酶和dNTP，扩增靶位点基因；借助Cas12蛋白，在crRNA探针指导下，结合猪链球菌靶位点双链DNA底物，激活非特异性切割单链DNA报告序列的特点而设计的一种高灵敏度、高特异性的快速、可视化检测猪链球菌的方法。

Description

一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及 探针

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌，猪链球菌病是国家规定的二类动物疫病。猪链球菌不仅能引起猪的淋巴结肿大，脑膜炎和败血症等，还能引起人感染的感染，脑膜炎和中毒性休克。猪感染猪链球菌的主要血清型是1型、2型、7型、9型、14型等。2型猪链球菌的流行性最广，致病性最强。猪链球菌在上世纪六十年代被发现，随后猪链球菌病开始在养猪行业中流行起来，引起世界范围的重视。仔猪抵抗力弱的猪易感。当气温变化、饲养密度大、卫生条件差等因素的养殖场会导致该病的暴发。猪呼吸道和扁桃体上广泛存在猪链球菌。猪链球菌和其他致病菌经常发生混合感染或继发性感染。猪链球菌的致病性主要和毒力因子有关，毒力因子主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、谷氨酸脱氢酶、粘附素等。

近些年，猪链球菌病的暴发越来越多。猪链球菌病是我国养殖业最重要的传染病之一，该致病菌还能感染人，对人类生命安全也造成了严重威胁。猪链球菌成为规模化养殖场的机会性致病菌，对猪链球菌的提前检测对于疾病的诊断与治疗相当重要。因此建立完善、准确的检测体系尤为重要。

目前我国国家卫生健康委员会在其编写的《人感染猪链球菌病诊断方案》中，推荐使用一般实验室检查和病原学鉴定的方法对可疑猪链球菌感染进行实验室诊断。猪链球菌的常规检测方法主要有形态学、血清学、免疫学和普通PCR。但这些检测方法繁琐而且对设备要求高，不利于基层推广和检测。近年来，等温扩增技术如环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)，重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)等因其不需要昂贵的设备、反应快速，灵敏度高等优点发展迅速，逐渐在临床上应用起来。RPA是一种恒温扩增技术。反应温度在37℃-42℃之间，不需要温度升降进行变性，RPA不需要依赖昂贵仪器，灵敏度、特异性都较好，RPA可以实现对病原菌便携式的快速检测。

CRISPR系统是细菌及古细菌利用Cas效应蛋白并在crRNA探针的引导下抵御外源核酸入侵的一种获得性免疫防御系统。其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸的威胁。CRISPR-Cas系统利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。S.pyogenes Cas9(SpCas9，一般简称Cas9)，因为其具有简单的PAM序列和在细胞内较高的基因编辑效率，因而是应用最广泛的Cas蛋白。 Cas12a(又称为Cpf1)是和Cas9不同的CRISPR系统。

Cas12a蛋白识别富含T的PAM位点，在靶序列的5'端形成5个核苷酸的粘性末端，同时其自身可加工形成成熟的crRNA。Cas12a具有即可切割双链DNA也可切割单链DNA的切割活性。它在切割序列特异性的目标双链DNA之后，它的单链DNA的酶活性被激活，变成一种单链DNA切碎机，将切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA 切割速度极快，达到大于1000个分子每秒，且可以持续数小时以上。因此，Cas12a识别一个特异性双链DNA序列，可以切割数以百万计的非特异性的单链DNA分子。利用此特性，可将发光分子通过单链DNA 与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起(简称为报告序列)。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA，这就移除了发光抑制分子，让发光分子发光，从而检测到光信号。

发明内容

本发明提供一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针，该方法通过设计RPA特异性引物，利用RPA扩增技术对核酸进行放大，将产物在crRNA探针的引导下，利用Cas12a酶切单链DNA报告序列，通过荧光信号进行猪链球菌检测，不仅能快速检测得到结果，并且解决了当前检测方法不敏感、时间长、成本高等缺点。

本发明选择猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因gdh为检测靶基因。基于猪源链球菌NCTC 10234(ATCC 43765)的gdh基因参考序列，结合实验室已测序的23株猪链球菌的gdh基因序列和国家生物技术信息中心NCBI基因库中检索到的62株猪链球菌的靶标基因gdh并进行比对，选择gdh基因的保守区域设计RPA引物和crRNA探针。

优选地，所述RPA引物的序列为(F1) CATGTACGGTCAATACAAACGCCTCC，(R1)TATCAGTGAAGTAAACCAAACCGTAACCAG或(F2)TTTGATGCAGGTGTCTTGACTGGTAAACCTC，(R2)ACAGTTTGGTCTTTGAAGGATTTACCGTT或与其序列相似性大于 75％的序列。

优选地，所述RPA引物的序列如SEQ ID NO:5至6或SEQ ID NO:7至8所示。

在gdh基因的保守区域寻找PAM位点5'-TTTN-3'， CRISPR/Cas12a系统的靶向特异性由crRNA探针3'末端的20个核苷酸序列决定的，所需的靶序列必须紧接在5'-TTTN的PAM位点之后，并从中确定crRNA序列。

优选地，所述crRNA探针的指导序列为 AUGCAGGUGUCUUGACUGGU或GUUUACUUCACUGAUAACAU；所述crRNA探针的非指导序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU或与其序列相似性大于75％的序列。

优选地，所述crRNA探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10所示。

优选地，所述crRNA探针是可引导Cas12a剪切猪链球菌靶基因和单链DNA报告序列的RNA形式。

本发明实现目的所采用的方案是：一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其由冻干试剂1，包括所述的引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列；缓冲液1；冻干试剂2，包括所述的Cas12蛋白；缓冲液2；基因组DNA提取试剂1、2；紫光手电组成。

优选地，所述单链DNA报告序列为含有T和A或仅含有T的富集序列。

优选地，所述单链DNA报告序列含有TTT、ATT、TAT、TTA、 AAT、ATA、TAA、AAA中的至少一种。

优选地，所述单链DNA报告序列的5'端用Atto 425、BODIPY FL、FAM、Oregon Green488、TET、JOE、R6G、Yakima Yellow、 VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670和Cy5.5中的任意一种进行修饰；且所述单链DNA报告序列的3'端用BHQ1、BHQ2、BHQ3、 BBQ650、MGB和Dabcyl修饰。

更为优选地，所述单链DNA报告序列为：(1)在TTATT的5' 端用FAM修饰，3'端用Dabcyl修饰，即FAM-TTATT-Dabcyl；或(2) 在TTATT，5'端FAM修饰，3'端用MGB修饰，即FAM-TTATT-MGB。

优选地，所述Cas蛋白为Cas12、Cas13或Cas14；所述Cas12为 Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h或Cas12i。

更为优选地，所述Cas12a更具体为来自于Lachnospiraceae bacterium、Acidaminococcus sp.、Francisella tularensis subsp.、Prevotella disiens、Porphyromonas macacae、Lachnospiraceae bacterium MA2020、CandidatusMethanoplasma termitum、Moraxella bovoculi 237的Cas12a蛋白，如LbCas12a、AsCpf1、FnCpf1蛋白。最优选地，所述Cas12a蛋白是LbCas12a中的关键结构域。当本发明采用Cas13蛋白时，需要将单链报告序列改为RNA序列，需要在样品等温或PCR反应后进行RNA转录。当采用Cas14蛋白时，样品准备为单链DNA。

优选地，所述试剂盒的检测反应体系为：5-20μM上下游引物， 1×浓度的重组酶聚合酶，1×浓度的dNTP，10-100nM的crRNA探针，1-10μM单链DNA报告序列，10-100nM的Cas蛋白，缓冲液1为40μL，缓冲液2为400μL，基因组DNA提取试剂1为40μL，基因组DNA提取试剂2为40μL。另一优选地，所述试剂盒的检测反应体系为：5-10μM 上下游引物，1×浓度的重组酶聚合酶，1×浓度的dNTP，10-100nM 的crRNA探针，2-10μM的FAM-TTATT-Dabcyl报告序列，10-100nM 的Cas蛋白，缓冲液1为40μL，缓冲液2为400μL，基因组DNA提取试剂1为40μL，基因组DNA提取试剂2为40μL。

更优选地，所述试剂盒的检测反应体系为：10μM上下游引物， 1×浓度的重组酶聚合酶，1×浓度的dNTP，25nM的crRNA探针，2μM 的FAM-TTATT-Dabcyl报告序列，60nM的LbCas12a，缓冲液1为40μL，缓冲液2为400μL，基因组DNA提取试剂1为40μL，基因组DNA提取试剂2为40μL。

利用Cas蛋白在crRNA探针的指导下切割猪链球菌靶位点双链DNA底物后释放PAM远端产物，激活非特异性切割单链DNA报告序列，在紫光手电照射下，通过肉眼观察荧光来判定结果的特点而设计的一种高灵敏度、高特异性的快速检测猪链球菌的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中基于引物对5、6的扩增实验结果；注：1：DL2000 Marker；2-7：不同浓度基因组DNA；8-9：Negative

图2为本发明实施例1中基于引物对7、8的扩增实验结果；注：1：DL2000 Marker；2-7：不同浓度基因组DNA；8-9：Negative

图3为本发明实施例1中基于引物对5、6扩增产物的crRNA 探针9的荧光报告实验结果；

图4为本发明实施例1中基于引物对5、6扩增产物的crRNA 探针10的荧光报告实验结果；

图5为本发明实施例3中使用试剂盒检测基因组DNA的荧光结果；

图6为本发明实施例3中使用试剂盒检测菌液的荧光结果；

图7为本发明实施例4中检测方法特异性的荧光结果。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

(1)Cas12a蛋白表达与纯化

将编码LbCas12a的DNA片段克隆到包含C端6个组氨酸标签的pET30c载体上构建表达质粒，BL21(DE3)转化后挑单克隆在37℃， 2×YT培养基(10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g的NaCl)中进行菌种过夜活化和扩大培养，待OD600达到0.6时，加入0.5mM的IPTG (异丙基硫代半乳糖苷)21℃诱导表达16小时后收菌。

表达得到的菌用裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl，pH 7.5，500 mM的NaCl，5％(v/v)甘油，1mM的TCEP，0.25mg/mL溶菌酶) 重悬超声破菌，破碎后得到的上清经0.22μm滤膜过滤，HisTrap HP 镍柱纯化，500mM咪唑洗脱，50KDa超滤管浓缩至500μL，经葡聚糖凝胶色谱(Superdex Increase 200)纯化，目标蛋白保存在储存缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH 7.5，200mM的NaCl，5％(v/v)甘油，1 mM的TCEP)中，并冻存于-80℃冰箱备用。

(2)单链DNA报告序列的制备

LbCas12a非特异性切割单链DNA有TA偏好性，单链DNA报告序列(5'-3')：TTATT，5'端FAM修饰，3'端Dabcyl修饰，即 FAM-TTATT-Dabcyl。

单链DNA报告序列由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。

(3)RPA引物的筛选和制备

1、候选靶序列的确定

基于猪源链球菌NCTC 10234(ATCC 43765)的gdh基因参考序列，结合实验室已测序的23株猪链球菌的gdh基因序列和国家生物技术信息中心NCBI基因库中检索到的62株猪链球菌的gdh基因序列并进行比对，gdh基因靶序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。

选择gdh基因的保守区域供后续研究。

2、候选RPA引物的筛选和制备

基于保守区域序列，限定引物长度为30-36bp，产物长度为 100-200bp，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的2对引物，引物序列如SEQ ID NO:5至6和SEQ ID NO:7至8所示。

RPA引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。

通过RPA扩增试验，基于扩增条带大小和产物含量来确定最优 RPA引物。

(4)crRNA探针的筛选和制备

1、候选crRNA探针序列的确定

由于LbCas12a特异性切割双链DNA需要识别PAM序列 (5'-TTTN-3')，PAM序列下游20个核苷酸即为crRNA探针与靶位点双链DNA互补配对并识别的区域。在gdh基因的保守区域寻找PAM位点(5'-TTTN-3'或5'-NAAA-3')，确定crRNA靶向序列。选取评分较高的2个crRNA探针，探针序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

2、候选crRNA探针的制备

在crRNA探针对应的DNA序列前加T7启动子序列，后与其互补序列，缓慢退火形成双链DNA序列，并以此作为体外转录的模板，加入T7RNA聚合酶，在37℃下孵育16小时，使用DNaseⅠ消化DNA模板，后经RNA纯化试剂盒回收得到crRNA探针。

3、最优crRNA探针的筛选

以相同浓度的靶基因双链DNA为底物，加入crRNA探针和单链DNA报告序列，通过比较荧光信号的强弱来筛选特异性强、灵敏度高的crRNA探针。

实施例2：试剂盒的制备

将RPA引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA 报告序列冻干于PCR管底部，获得冻干试剂1，并用锡箔袋抽真空密封保存。使用时将缓冲液1加入PCR管中，复溶。缓冲液1的成分如表 1所示。

将Cas12蛋白冻干于西林瓶中，使用时加入缓冲液2，复溶。

基因组DNA提取试剂1和2的成分如表2所示。

将上述试剂、空白离心管和紫光手电封装在包装盒中，即为试剂盒。

表1缓冲液1与缓冲液2成分

表2基因组DNA提取试剂1和2成分

实施例3：荧光检测猪链球菌

取100μL待测菌液至空白离心管，加入40μL的基因组DNA提取试剂1，轻弹混匀约1分钟左右。

继续加入40μL的基因组DNA提取试剂2进行中和，轻轻混匀。

取2μL的提取液，加入已复溶好的PCR管中，吹打混匀。

将4μL的Cas12a复溶液点在PCR管的管盖上，慢慢盖好PCR管盖。

置于37℃恒温处，反应20分钟。

离心，使Cas12a蛋白进入反应体系中，37℃恒温反应30分钟。

紫光手电照射PCR离心管底部，观察荧光颜色，即可判读结果。

实施例4：检测的特异性

以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌、肠球菌和猪链球菌为样本，使用试剂盒进行检测，分析该方法的特异性。

Claims (13)

1.一种基于CRISPR的检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：包括引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列、缓冲液、Cas蛋白及基因组DNA提取试剂。

2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列为含有T和A或仅含有T的富集序列。

3.如权利要求2所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列含有TTT、ATT、TAT、TTA、AAT、ATA、TAA、AAA中的一种。

4.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列的5'端用Atto 425、BODIPY FL、FAM、Oregon Green 488、TET、JOE、R6G、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670和Cy5.5中的一种进行修饰；且所述单链DNA报告序列的3'端用BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB和Dabcyl修饰。

5.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述Cas蛋白为Cas12、Cas13或Cas14；所述Cas12为Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h或Cas12i；所述试纸盒包括冻干试剂1、缓冲液1、冻干试剂2、缓冲液2、基因组DNA提取试剂1和2、紫光手电。

6.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应体系为：5-20μM上、下游引物，1×浓度的重组酶聚合酶，1×浓度的dNTP，10-100nM的crRNA探针，1-10μM的FAM-TTATT-Dabcyl报告序列，1×浓度的缓冲液1，10-100nM的Cas12a，1×浓度的缓冲液2，1×浓度的基因组DNA提取试剂1，1×浓度的基因组DNA提取试剂2。

7.一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的引物，其特征在于：所述引物根据如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的靶位点设计得到。

8.如权利要求7所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的引物，其特征在于：所述引物的序列为(F1)CATGTACGGTCAATACAAACGCCTCC，(R1)TATCAGTGAAGTAAACCAAACCGTAACCAG或(F2)TTTGATGCAGGTGTCTTGACTGGTAAACCTC，(R2)ACAGTTTGGTCTTTGAAGGATTTACCGTT或与其序列相似性大于75％的序列。

9.如权利要求7所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的引物，其特征在于：所述引物的序列如SEQ ID NO:5至6或SEQ ID NO:7至8所示。

10.一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的crRNA探针，其特征在于：所述crRNA探针根据如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的靶向位点设计得到。

11.如权利要求10所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的crRNA探针，其特征在于：所述crRNA探针的指导序列为AUGCAGGUGUCUUGACUGGU或GUUUACUUCACUGAUAACAU；所述crRNA探针的非指导序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU或与其序列相似性大于75％的序列。

12.如权利要求10所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的crRNA探针，其特征在于：所述crRNA探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。

13.如权利要求10至12任一项所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的crRNA探针，其特征在于：所述crRNA探针是可引导Cas蛋白剪切猪链球菌靶基因和单链DNA报告序列的RNA形式。

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