CN111549182B

CN111549182B - 用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒

Info

Publication number: CN111549182B
Application number: CN202010452547.0A
Authority: CN
Inventors: 刘华勇; 刘孝礼; 陈翀
Original assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd; Bioisland Laboratory
Current assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd; Bioisland Laboratory
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111549182A

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS‑CoV‑2的探针及试剂盒。所述探针包括用于检测N基因的探针和/或用于检测ORFlab基因的探针。本发明提供的试剂盒用于检测鼻咽拭子样本中的新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)RNA，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，在新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)临床检测中具有重要意义。

Description

用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒。

背景技术

现行主流的新型冠状病毒肺炎核酸检测方法为荧光定量PCR法，需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。

随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，环介导核酸扩增技术(LAMP)、解旋酶依赖等温核酸扩增技术(HDA)等均可在等温条件下扩增DNA。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

发明内容

本发明涉及用于检测SARS-CoV-2的探针，其选自SEQ ID NO：1所示序列表示的用于检测N基因的a探针，和/或SEQ ID NO：5所示序列表示的用于检测ORFlab基因的b探针。

根据本发明的再一方面，本发明涉及一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其含有如上所述探针。

本发明还涉及如上所述探针、或如上所述的试剂盒在检测SARS-CoV-2中的用途。

本发明的有益效果为：

本发明提供的试剂盒用于检测鼻咽拭子样本中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)临床检测中具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中SARS-CoV-2的N基因种内序列保守性比对结果。

图2为本发明实施例1中SARS-CoV-2的ORFlab基因种内序列保守性比对结果。

图3为本发明实施例1中SARS-CoV-2的N基因种间序列特异性比对结果。

图4为本发明实施例1中SARS-CoV-2的ORFlab基因种间序列特异性比对结果。

图5为本发明实施例1中SARS-CoV-2的N基因荧光特异性探针筛选结果。

图6为本发明实施例1中SARS-CoV-2的ORFlab基因荧光特异性探针筛选结果。

图7为本发明实施例2中试剂盒对临床样本中SARS-CoV-2的N基因检测结果。

图8为本发明实施例2中试剂盒对临床样本中SARS-CoV-2的ORFlab基因检测结果。

图9为本发明实施例4中试剂盒对SARS-CoV-2的N基因灵敏度测试结果。

图10为本发明实施例4中试剂盒对SARS-CoV-2的ORFlab基因灵敏度测试结果。

图11为本发明实施例5中试剂盒对SARS-CoV-2的N基因特异性测试结果。

图12为本发明实施例5中试剂盒对SARS-CoV-2的ORFlab基因特异性测试结果。

图13～图16依次分别为本发明实施例6中试剂盒冻干后于37度分别保存0天、30天、60天、90天的稳定性测试结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

在一些实施方式中，所述a探针的5’端起第34位碱基T标记发光基团，第35位碱基用脱碱基核苷酸类似物替代，第36位碱基标记淬灭基团，3’端进行阻断剂修饰；所述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。

在一些实施方式中，所述b探针的5’端起第29位碱基T标记发光基团，第32位碱基用脱碱基核苷酸类似物替代，第34位碱基标记淬灭基团，3’端进行阻断剂修饰；所述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。

在一些实施方式中，所述发光基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、TexasRed、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。

在一些实施方式中，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。

在一些实施方式中，所述脱碱基核苷酸类似物为四氢呋喃。

在一些实施方式中，所述阻断饰选自间臂、磷酸基团、生物素-TEG或胺。

在一些实施方式中，所述间臂选自乙二醇、C9间臂(Spacer 9)、C18间臂(Spacer18)、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose(dSpacer)]、C3间臂(C3Spacer)中的任一种。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自C3间臂。

间臂(Spacer)可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。

在一些实施方式中，所述胺为C6胺。

在本发明中，所述探针可以包括SEQ ID NO：1和/或5所示的探针，或者与SEQ IDNO：1和/或5所示的探针实质上相同的核酸片段。

“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：1和/或5所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ ID NO：1和/或5替换、增加或减少1、2、3、4、5、6、7或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰(例如甲基化修饰，通常这种修饰对所述探针与靶核酸的杂交是无关紧要的)，长度优选控制在40bp～46bp的核酸片段。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

进一步地，所述探针至少30个碱基位于脱碱基核苷酸类似物位点的5’端，另外至少13～15个位于其3’端。

在一些实施方式中，其还含有用于扩增所述探针所结合位点的引物。

在一些实施方式中，所述引物为配合所述a探针使用SEQ ID NO：2和3所示引物；和/或；配合所述b探针使用SEQ ID NO：6和7所示引物。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有核酸提取试剂、核酸扩增试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

阳性对照可以为含有SARS-CoV-2N基因和/或ORFlab基因的质粒；阴性对照可以为阳性对照的空载质粒。

在一些实施方式中，所述核酸扩增试剂为等温核酸扩增所用试剂。

在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶III、反转录酶、ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、各种分子量分布的BSA和/或PEG、以及DTT以及水中的一种或多种；

所述辅助蛋白用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行。

pH调节剂可以包含不显著影响反应进行的酸和碱，以及缓冲组分(例如Tris和醋酸盐等)。进一步地，Tris缓冲液为Tris-tricine，其工作浓度可以为约80mM～120mM。

在一些实施方式中，所述重组酶选自uvsX、RecA以及KX中的至少一种，所述KX的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在一些实施方式中，所述单链DNA结合蛋白为gp32。

在一些实施方式中，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或Sau DNA聚合酶。

重组酶介导的核酸恒温扩增技术中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I(Bacillus subtilis Pol I，Bsu)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Pol I，Sau)，这两种DNA聚合酶均属于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是负责DNA复制过程中损伤修复的聚合酶，该家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力都不高，也就是说该家族的聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。

在一些实施方式中，所述辅助蛋白选自uvsY和/或KY，所述KY的氨基酸序列如SEQID NO：10所示。

当重组酶用于链插入步骤的情况下，所述系统可能要求能量来源。这些酶的大多数利用ATP作为能量来源，但是因为ATP整理(collate)酶活性必需的镁离子，因此有利的提供另外的ATP再生系统而不是提高ATP的浓度。在一些实施方式中，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种。

本发明所采用的等温核酸扩增所用试剂可以采用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)方法，或者申请人改进得到的重组酶依赖型扩增技术(Recombinase-dependent amplification，RDA)的检测方法和检测系统，RDA技术所需引物短(18bp～30bp)，对靶标序列的长度要求低，适用性广；且对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的恒温条件下实现高灵敏(可以实现单拷贝模板扩增)、高精度的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。

RDA反应体系可以主要包括重组酶KX和蛋白KY、gp32以及链置换DNA聚合酶；还可以包括Tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、PEG(例如PEG20000或PEG35000)、二硫苏糖醇、dNTPs、dATP、磷酸肌酸、引物、醋酸镁。

所述重组酶KX和蛋白KY来源于Escherichia phage phT4A噬菌体，Escherichiaphage phT4A属于Myoviridae科，Tevenvirinae亚科中Slopekvirus属。

所述重组酶KX和蛋白KY能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，并且KX的稳定性好于uvsX，可以量产和长期保存。

重组酶KX可以替代重组酶uvsX或RecA参与RPA反应。该酶制备工艺简单，重组酶的产量和稳定性大幅提高，量产成本低。作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶uvsY一起实现核酸扩增，重组酶KX的应用可以使得DNA或RNA的扩增反应灵敏、高效、经济、便捷。

同时本发明开发了重组酶KX的辅助蛋白KY，KY可以替代uvsY，使扩增反应更加灵敏、高效。

本发明提供的新型重组酶依赖型扩增(RDA)反应体系的反应原理为：(1)反应体系中重组酶KX与18bp～30bp的特异性引物结合形成的重组酶-引物复合体，在双链DNA模板中寻找靶位点；(2)重组酶-引物复合体识别模板特异性序列后，发生定位并引发链交换，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链形成的D-Loop结构；(3)重组酶-引物复合体水解体系中的dATP构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'端启动DNA合成；(4)DNA聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；(5)两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；(6)在反应体系中dATP水解为重组酶供能后变成dADP，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基转移到dADP分子中形成dATP，从而恢复反应体系中dATP的水平。上述过程不断重复，最终实现核酸的高效扩增。

本发明提供的试剂盒采用RDA恒温扩增检测方法，在约37℃～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，约20min～30min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为10copies/μl。

本发明RDA方法中，设计的高度特异性探针及其引物对，实现了对样本中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的实时、无本底背景的高效恒温核酸扩增。

在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂或混合的液体试剂。

在一些实施方式中，所述等温核酸扩增所用试剂主要活性组分在扩增核酸时的工作浓度在以下范围内：

KX 60～600ng/μL、KY蛋白16～192ng/μL、单链结合蛋白gp32 100～1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3～100ng/μL、核酸外切酶III 30～200U、肌酸激酶0.1～0.8mg/ml、磷酸肌酸25～75mM、反转录酶200U、Tris缓冲液20～100mM、PEG 2.5％～10％、醋酸钾或醋酸钠0～150mM、dATP 1～5mM、dNTPs 150～600nM、DTT 1～12mM。

在本发明中，“工作浓度”用于限定所述等温核酸扩增所用试剂在扩增核酸时主要活性组分的比例。所述试剂盒中所述等温核酸扩增所用试剂中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液或母液干粉(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液或母液干粉)。

在一些实施方式中，所述的核酸提取试剂为用于执行酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法的试剂。

在一些实施方式中，所述的核酸提取试剂包括Buffer A、Buffer B；

所述Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、EDTA、Tween80、曲拉通；

所述Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁。

这样的用途可以是诊断或非诊断目的。

这样的用途可以用于诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。

应用时的反应程序可以为RDA典型的反应程序：

(1)提取待测样本DNA或RNA；

(2)加入上述反应体系试剂，25℃～42℃下反应10min～60min，即完成核酸的扩增。

优选反应条件为：39℃反应30min。

上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。

检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECΜLAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRARVICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CΜLTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

实施例1用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的引物和探针的确定

(1)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测靶标的确定及引物设计

通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)查找新型冠状病毒(SARS-CoV-2)全基因序列，使用SeqMan软件和MEGA5.2进行同源性比对和序列分析，选择在病毒的种内保守、种间变异的序列做为靶标区域。经过对多种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择保守的N基因、ORFlab基因作为靶标基因。比对结果如图1～图4所示。N基因、ORFlab基因的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8所示。

在以上两个靶标基因进行相应的RDA引物设计。本实施例中采用RDA技术的引物设计原则进行设计，上游引物和下游引物长度18-35bp，根据新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N基因、ORFlab基因保守序列，对每种基因设计3对引物，通过一系列的实验筛选和评价，分别确定1个组合为最佳引物组，具体为：

1)SARS-CoV-2N基因引物信息：

SARS-CoV-2-NF(SEQ ID NO：2)：

TAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGC

SARS-CoV-2-NR(SEQ ID NO：3)：

TTTACCAGACATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATC

2)SARS-CoV-2ORFlab基因引物信息：

SARS-CoV-2-OF(SEQ ID NO：6)：

TTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGT

SARS-CoV-2-OR(SEQ ID NO：7)：

GGGCTGCACTTACACCGCAAACCCGTTTAAAAA

(2)用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的探针的设计及确定

RDA荧光探针的设计有其基本要求。RDA荧光探针设计时，探针序列不应与特异性引物位点重叠，46-60个核甘酸，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；探针共有四个修饰位点，探针的中间位置的核苷酸标记脱碱基核苷酸类似物例如四氢呋喃基团(THF)，四氢呋喃基团两边各标记荧光基团和淬灭基团，3’末端需添加阻断剂修饰。四氢呋喃标记位点作为核酸外切酶III的识别位点，其所在标记的位置应满足至少30个碱基位于四氢呋喃标记位点的5’端，另外至少15个碱基位于其3’端。四氢呋喃标记位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，荧光基团需要与淬灭基团相差2～5个碱基，两基团如相隔太远会降低荧光基团淬灭效率导致荧光本底信号过高。探针的标记基团推荐标记在胸腺嘧啶(T)上，如果标记的基团的两个胸腺嘧啶间距不适合或者无法找到相对应的胸腺嘧啶，则会导致探针中一个胸腺嘧啶与靶标序列错配而导致非特异性荧光产生。探针的3’末端需添加阻断剂修饰。

荧光探针与其相应扩增引物的最佳位置没有固定的规则，设计过程中尽量避免探针与扩增引物的区域出现重叠；与探针方向相反的引物与探针之间不应有重叠，以避免形成引物-探针二聚体；与探针方向相同的引物可与探针5’端部分重叠，但重叠区不得包括探针的脱碱基位点及其3’端后部分。

基于上述探针设计原则，本实施例对每个基因分别设计了3种方案，结合本实施例中确定的引物对进行探针筛选实验，N基因、ORFlab基因的探针筛选结果分别如图5-图6所示。将每种基因中反应效率最高的探针确定为对应基因的检测探针。对筛选出的N基因荧光标记探针、ORFlab基因荧光标记探针具体阐述如下。

所述N基因的荧光标记探针，具体特征为：探针的5’端起第34位碱基T标记发光基团，第35位碱基用四氢呋喃残基(THF)替代，第36位碱基标记淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。其具体信息如下：

SARS-CoV-2-NP：

5’-TGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGC[T(FAM)][THF][T(BHQ1)]TGCTTTGCTGCTG-SpacerC3-3′

所述ORFlab基因的荧光标记探针，具体特征为：所述探针的5’端起第29位碱基T标记发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基(THF)替代，第34位碱基标记淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。其具体信息如下：

SARS-CoV-2-OP：

5’-TGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGA[T(FAM)]CA[THF]C[T(BHQ1)]CCGCGAACCCATGCTT-SpacerC3-3′

实施例2一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RDA荧光法试剂盒

本发明构建一种基于重组酶依赖型扩增技术(RDA)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的试剂盒，包括核酸提取试剂，RDA恒温扩增反应模块，阳性对照和阴性对照。其中核酸提取试剂包括Buffer A和Buffer B，Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、EDTA、Tween80、曲拉通，Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；RDA恒温扩增反应模块优选反应体系包含重组酶KX 120ng/μL、KY蛋白60ng/μL、单链结合蛋白gp32 300ng/μL、链置换DNA聚合酶50ng/μL、核酸外切酶III 50U、肌酸激酶0.2mg/ml、磷酸肌酸50mM、反转录酶200U、Tris-tricine 100mM、PEG20000或PEG35000 5％、醋酸钾50mM、醋酸镁14mM、dATP2mM、dNTPs 200nM each、DTT 2mM、荧光标记探针300nM、引物对500nM；阳性对照为含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的靶标基因质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。所述反应体系的反应条件为：25℃～42℃下反应10min～60min。

优选反应条件为：39℃反应30min。

重组酶KX和重组酶辅助蛋白KY的制备可以选用如下方法：

重组酶KX的制备：

将目的基因表达片段导入pET 28a载体中，得到重组表达载体。

所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Sall酶切位点黏性末端：

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。

对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶KX。

所述诱导表达的方法为：在重组工程菌的菌落OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM/L～0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在16℃～22℃诱导表达20h-30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌；将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物。将所述粗产物采用亲和层析后，再经阴离子层析，纯化得到所述重组酶KX。

上述制备得到的重组酶KX纯度大于95％。

重组酶辅助蛋白KY的制备：

将SEQ ID NO：10所示目的基因表达片段导入pET 28a载体中，在其编码基因C端增加TrxA和SUMO双促溶标签，得到重组表达载体。将上述重组表达载体导入大肠杆菌中实现大量可溶性表达。

双促溶表达标签的KY蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌：以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述KY蛋白。

对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述KY蛋白的步骤中，包括：

在重组工程菌的菌落OD值为为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM/L-0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在16℃～22℃诱导表达20h～30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌，将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物，将所述粗产物纯化，得到所述KY蛋白。

其中，将所述粗产物纯化，包括：将所述粗产物采用聚乙烯亚胺沉淀和硫酸镀盐析后经亲和层析，再用Ulp1酶切除TrxA和SUMO标签，最后经阴离子层析得到所述KY蛋白。

上述KY蛋白的纯度能达到95％以上，作为重组酶依赖型扩增技术(RDA)中的重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶KX协同实现核酸的指数扩增。KY蛋白的应用使得DNA或RNA的扩增反应灵敏、高效。

本实施例中对收集的4例经荧光定量PCR验证均为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA阳性的鼻咽拭子样本，使用本专利的RDA荧光法检测试剂盒测试。

具体操作如下：

步骤一、样本处理。将20μL Buffer A和5μL阳性对照/阴性对照/待检样本震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤二、体系配制及检测。加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃1分钟，30个循环，每分钟荧光信号，30min可完成检测；

步骤三、结果判定。

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；

②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值<25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

c.若25min≤Tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤Tt值<30min，应参照阴性对照Tt值，若阴性对照Tt值≥30min，则判断为阳性。

检测结果如表1和图7、图8所示，检测靶标为N基因或ORFlab基因，阳性对照、阴性对照均符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果”的内容，各样本的Tt值均小于25min，判断为阳性。

结果表明，本实施例建立的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RDA荧光法试剂盒能够对鼻咽拭子样本中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA的N基因或ORFlab基因进行有效检测。

表1试剂盒有效性检测结果

实施例3基于RPA技术检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法

本实施例使用RPA技术进行新型冠状病毒检测，RPA试剂盒采用英国TwistDx的exo试剂盒，使用的模板为实施例2中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)阳性的鼻咽拭子样本总核酸，阳性对照为含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)靶基因的pUC57质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

配制体系时加入RT酶和相应的引物探针，检测N基因时使用SEQ ID NO：2和3引物以及a探针，检测ORFlab基因时使用SEQ ID NO：6和7引物以及b探针；在待测样本加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁；加入待测样本后，立即检测；反应程序为：39℃1分钟，30个循环，每分钟荧光信号，30min可完成检测；

结果判定：

②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值<25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

根据以上判读标准，本次实验的结果如表2所示，4例样本的N基因和ORFlab基因检测结果均为阳性，阳性对照为阳性，阴性对照结果为阴性，符合预期。本次实验结果表明，使用RPA技术配合本发明设计的荧光探针可对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA的N基因或ORFlab基因进行有效检测。

表2试剂盒有效性检测结果

实施例4 RDA荧光法检测试剂盒灵敏度测试

阳性对照为含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)靶基因的pUC57质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

具体操作如下：

步骤一、将阳性对照质粒稀释到10^4c，再10倍梯度稀释分别稀释成10^3c、10^2c、10^1c。

步骤二、样本处理。将步骤一各浓度的质粒各取5μL在EP管中，同时取阴性对照5μL在另一EP管中，分别加入20μL Buffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤三、体系配制及检测。各管加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃1分钟，30个循环，每分钟荧光信号；

步骤四、结果判定。判定标准：

②阴性对照：无扩增曲线出现，或者Tt值≥25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值<25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表3和图9、图10所示：检测靶标为N基因或ORFlab基因，阴性对照均无Tt值，符合判定标准中“无扩增曲线出现，或Tt值≥25min”的内容。10^4c、10^3c、10^2c、10^1c的Tt值均<25min，根据结果判定标准，对10^4c、10^3c、10^2c、10^1c的检测结果均为阳性。

即，本专利中建立的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RDA荧光法检测试剂盒对新型冠状病毒N基因、ORFlab基因的灵敏度，都可达到10个拷贝。

表3灵敏度测试结果

实施例5 RDA荧光法检测试剂盒特异性测试

新型冠状病毒感染引起的临床症状，可与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等已知病毒感染引起的症状相似，需要鉴别诊断。为验证本专利试剂盒对新型冠状病毒检测的特异性，本实施例选出甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)阳性的8种临床样本，按本专利试剂盒的方法进行样本检测。具体操作如下：

步骤一、样本处理。将以上5例阳性样本各取5μL在EP管中，同时取试剂盒的阳性对照、阴性对照各5μL在新的EP管中，分别加入20μL Buffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤四、结果判定。判定标准：

③被检样本：

a.若Tt值<25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表4和图11、图12所示。阳性对照、阴性对照符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果”的内容。SARS-CoV-2样本的Tt值小于25min，判断为阳性；甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)无扩增曲线，判定为阴性。

即，本专利中用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RDA荧光法试剂盒，仅对病原体中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的N基因、ORFlab基因的检测结果为阳性，对其他病原体检测为阴性，本专利试剂盒的特异性良好。

表4特异性测试结果

实施例6 RDA荧光法检测试剂盒冻干后稳定性测试

液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将RDA荧光法反应模块在真空干燥成粉状试剂，冻干后的粉状试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易。本实施例对RDA荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。

具体操作如下：

将含有冻干试剂的八连管密封于含有干燥剂的铝箔袋中，保存于37℃恒温箱。分别于0天、30天、60天、90天，取冻干试剂进行测试。

步骤一、样本处理。试剂盒的阳性对照/阴性对照各取5μL在EP管中，分别加入20μLBuffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤二、体系配制及检测。各管加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测。反应程序为：39℃1分钟，30个循环，每分钟荧光信号；

步骤三、结果判定。判定标准：

③被检样本：

a.若Tt值<25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表5和图13～16所示。分别对保存了0天、30天、60天、90天的RDA荧光法反应模块试剂冻干粉进行测试，N基因或ORFlab基因检测阴性对照均未检测到Tt值，检测阳性对照的各个Tt值均小于25min，根据结果判定标准，本专利的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、60天、90天对新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测结果均为阳性。表明本专利的试剂盒中试剂冻干后，在37℃中能稳定保存至少3个月。

表5 37℃保存稳定性

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州再生医学与健康广东省实验室；广州普世利华科技有限公司

<120> 用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(35)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctnttgct ttgctgctg 49

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

tagtcgcaac agttcaagaa attcaactcc aggc 34

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

tttaccagac attttgctct caagctggtt caatc 35

<210> 4

<211> 567

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 4

ttctactacc taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc 60

atcatatggg ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc 120

aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa 180

ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt 240

agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga 300

atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag 360

cttgagagca aaatgtctgg taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa 420

tctgctgctg aggcttctaa gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat 480

gtaacacaag ctttcggcag acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag 540

gaactaatca gacaaggaac tgattac 567

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tgtggaaagg ttatggctgt agttgtgatc anctccgcga acccatgctt 50

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

tttacactta aaaacacagt ctgtaccgtc tgcggt 36

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gggctgcact tacaccgcaa acccgtttaa aaa 33

<210> 8

<211> 219

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 8

tgacttaaaa ggtaagtatg tacaaatacc tacaacttgt gctaatgacc ctgtgggttt 60

tacacttaaa aacacagtct gtaccgtctg cggtatgtgg aaaggttatg gctgtagttg 120

tgatcaactc cgcgaaccca tgcttcagtc agctgatgca caatcgtttt taaacgggtt 180

tgcggtgtaa gtgcagcccg tttacaccgt gcggcacag 219

<210> 9

<211> 385

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 9

Met Ser Asn Lys Ala Leu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Asn Ser Asn Ser

1 5 10 15

Gln Thr Ala Ser Val Leu Ser Glu Ser Asp Val Phe Asn Asn Ile Thr

20 25 30

Ile Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Leu Asn Leu Ala Leu Ser Gly Ala

35 40 45

Phe Asn Gly Gly Leu Thr Ser Gly Leu Thr Leu Phe Ala Gly Pro Ser

50 55 60

Lys His Phe Lys Ser Asn Leu Gly Leu Leu Thr Val Ala Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Thr Tyr Glu Asp Ala Val Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Lys Gly

85 90 95

Val Thr Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val

100 105 110

Val Tyr Thr Arg Ile Thr Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Asp Val Val

115 120 125

Ser Gln Leu Asn Ala Leu Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Val Phe Val

130 135 140

Asp Ser Val Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Leu Ala Asp Ala Leu

145 150 155 160

Ser Asp Asn Asp Lys Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly

165 170 175

Met Phe Arg Met Val Thr Pro Tyr Leu Ala Asp Leu Asp Ile Pro Met

180 185 190

Val Cys Ile Cys His Thr Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys

195 200 205

Val Ile Ser Gly Gly Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ala Asp Thr Ala Ile

210 215 220

Ile Leu Gly Lys Gln Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Val Val Gly Tyr

225 230 235 240

Asp Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Ser

245 250 255

Lys Phe Pro Leu His Val Thr Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ser

260 265 270

Gly Leu Leu Asp Leu Ala Met Glu Met Asn Phe Val Gln Thr Val Thr

275 280 285

Lys Gly Trp Arg Asn Arg Ala Phe Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Leu

290 295 300

Glu Val Glu Glu Lys Lys Trp Arg Glu Ser Glu Thr Asn Ser Val Glu

305 310 315 320

Phe Trp Arg Pro Leu Phe Thr His Gln Pro Phe Leu Lys Ala Ile Glu

325 330 335

Glu Lys Tyr Lys Ile Pro Asp Arg Glu Ile Ser Asp Gly Ser Ala Leu

340 345 350

Glu Asp Leu Tyr Ser Thr Asp Ser Ile Pro Asp Pro Asp Leu Asp Asp

355 360 365

Asp Asp Ile Pro Glu Ser Phe Asp Asp Ile Glu Glu Asn Asp Glu Ile

370 375 380

Leu

385

<210> 10

<211> 139

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 10

Met Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Lys Asp Met

1 5 10 15

Leu Ile Asp Pro Leu Lys Leu Gln Ser Glu Ser Ala Asp Ile Pro Lys

20 25 30

Ile Trp Ala Lys Trp Leu Arg Tyr His Ser Asn Ala Lys Lys Lys Leu

35 40 45

Ile Gln Leu His Ala Lys Lys Glu Ala Asp Val Lys Asp Arg Met Leu

50 55 60

Tyr Tyr Thr Gly Arg His Asp Lys Glu Met Cys Glu Val Val Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Thr Thr Glu Ile Lys Ile Ala Ile Ala Gly Asp Pro Lys Ile Val

85 90 95

Glu Thr Asn Lys Leu Ile Gln Tyr Tyr Asp Met Val Val Asp Phe Thr

100 105 110

Ser Lys Ala Leu Asp Ile Val Lys Asn Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Asn

115 120 125

Met Leu Glu Ile Arg Lys Leu Glu Ser Gly Ala

130 135

Claims

1.用于检测SARS-CoV-2的探针和引物，其选自SEQ ID NO：1所示序列表示的用于检测N基因的a探针，和SEQ ID NO：5所示序列表示的用于检测ORFlab基因的b探针；

所述引物为配合所述a探针使用序列如SEQ ID NO：2和3所示引物；和配合所述b探针使用序列如SEQ ID NO：6和7所示引物；所述a探针的5’端起第34位碱基T标记发光基团，第35位碱基用四氢呋喃替代，第36位碱基标记淬灭基团，3’端进行阻断剂修饰；所述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸；

所述b探针的5’端起第29位碱基T标记发光基团，第32位碱基用四氢呋喃替代，第34位碱基标记淬灭基团，3’端进行阻断剂修饰；所述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。

2.根据权利要求1所述的探针和引物，所述阻断剂选自间臂、磷酸基团、生物素-TEG或胺。

3.根据权利要求2所述的探针和引物，所述间臂选自乙二醇、C9间臂、C18间臂、双脱氧间臂和C3间臂中的任一种。

4.根据权利要求2所述的探针和引物，所述胺为C6胺。

5.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其含有权利要求1～4任一项所述探针和引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其还含有核酸提取试剂、等温核酸扩增所用试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述等温核酸扩增所用试剂包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶III、反转录酶、ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、各种分子量分布的BSA和/或PEG、以及DTT以及水中的一种或多种；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述能结合单链核酸的重组酶选自uvsX、RecA以及KX中的至少一种，所述KX的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述单链DNA结合蛋白为gp32。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或SauDNA聚合酶。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，所述辅助蛋白选自uvsY和/或KY，所述KY的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种。

13.根据权利要求7～12任一项所述的试剂盒，所述等温核酸扩增所用试剂为冻干粉试剂或混合的液体试剂。

14.根据权利要求8～12任一项所述的试剂盒，所述等温核酸扩增所用试剂主要活性组分在扩增核酸时的工作浓度在以下范围内：

15.根据权利要求6～12任一项所述的试剂盒，所述的核酸提取试剂包括Buffer A、Buffer B；

所述Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁。

16.权利要求1～4任一项所述探针和引物或权利要求5～15任一项所述的试剂盒在用于检测SARS-CoV-2中的用途，所述用途为非疾病诊断目的。